大黃聯合烏司他丁對百草枯中毒大鼠肺損傷保護作用

張永成　姜銀松　王占青

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·論著·

大黃聯合烏司他丁對百草枯中毒大鼠肺損傷保護作用

張永成姜銀松王占青

264100濱州醫學院煙臺附屬醫院急診科

【摘要】目的觀察大黃聯合烏司他丁對急性百草枯中毒大鼠肺組織病理變化以及血漿中TNF- α、TGF-β1含量的干預作用。 方法將72只SD大鼠隨機分為對照組8只、染毒組32只、干預組32只。染毒組、干預組分別于第1天、3天、5天、7天分批處死存活大鼠，光鏡下觀察肺組織變化，并測定血漿TNF- α、TGF-β1的含量。 結果染毒組大鼠肺組織出現明顯的出血、炎癥細胞浸潤、肺實變等變化；干預組較染毒組病理損傷減輕；染毒組、干預組TNF-α、TGF-β1水平在染毒后1天開始升高，與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.01)，在相同時間點干預組血漿TGF-β1、TNF- α表達低于染毒組，差異均有統計學意義(P<0.01)。結論大黃聯合烏司他丁可通過降低百草枯中毒大鼠血漿TNF-α、TGF-β1水平，發揮對百草枯中毒大鼠肺組織的保護作用。

【關鍵詞】百草枯；大黃；烏司他丁；腫瘤壞死因子-α；轉化生長因子-β1

百草枯(paraquat，PQ)中毒具有低致死量、進展快、無特效藥等特點，死亡率極高。肺組織是百草枯中毒最重要的靶器官，國內外研究證實腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等細胞因子參與并推動全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)是百草枯中毒引發肺損傷的發病機制之一[1]，采用有效途徑抑制炎癥反應是減輕中毒癥狀，改善患者生存率的重要舉措。中藥大黃對多種中毒導致的臟器損傷具有保護作用，已在臨床得到廣泛的應用，現代醫學研究發現其還有抗炎、排毒、胃腸道修復等作用[2-4]，同時資料報道烏司他丁(ulinastatin，UTI)能夠顯著降低百草枯中毒患者體內的炎癥介質[5]，本文通過觀察大黃聯合烏司他丁對百草枯灌胃大鼠細胞因子的干預作用，初步探討二者對百草枯中毒大鼠保護作用的機制，為臨床應用大黃及烏司他丁治療百草枯中毒提供實驗依據。

1材料與方法

1.1實驗動物

SPF級SD大鼠72只，體質量(200±20) g，濱州醫學院動物實驗室提供，動物批號：SCXK(魯)20140007。

1.2實驗試劑

20%百草枯水劑，購自江蘇南通先正達農藥公司；TNF-α試劑盒，批號：SXR063；TGF-β1試劑盒，批號：SXR015，美國R&D公司產品進口分裝；生大黃粉(免煎劑型)，購自三九醫藥股份有限公司；烏司他丁，購自廣東天普洛安。

1.3儀器

LG16-W型臺式高速離心機購自北京醫用離心機廠；梅特勒·托利多AX-205DeLta Range電子天平、820Rotary切片機(美國)均購自湖北泰維科技實業有限公司；Olympus顯微鏡(日本)購自上海奧電電子科技有限公司。

1.4造模與分組

實驗參照文獻[6-7]進行。72只SD大鼠按隨機數字表法隨機分為對照組8只、染毒組32只、干預組32只。染毒組、干預組分別給予20%百草枯水劑(60 mg/kg，用0.9%生理鹽水稀釋至1 mL)灌胃染毒，對照組同時給予1 mL生理鹽水灌胃。干預組染毒后60分鐘給予生大黃粉300 mg/kg(用溫水浸泡)灌胃，同時腹腔注射UTI 75 kU/kg。對照組和染毒組同時以等量生理鹽水灌胃。

1.5觀測指標

染毒組、對照組分別于中毒后1天、3天、5天、7天處理存活的大鼠各8只，取下腔靜脈血5 mL，5000 rpm離心5分鐘取上清，-70℃凍存待測。取大鼠肺組織置于10%的甲醛溶液中固定，HE染色后光學顯微鏡觀察。采用酶聯免疫吸附法(ELISA) 檢測血漿TNF-α和TGF-β1水平。

1.6統計學處理

2結果

2.1各組大鼠肺組織光鏡下的觀察

染毒大鼠中毒后逐漸出現肺毛細血管擴張、水腫，可見大量中性粒細胞、淋巴細胞，部分肺泡塌陷，出現肺不張；中毒后3天部分肺泡融合，明顯肺不張，肺間質出血和肺泡出血并存，間質增厚；干預組大鼠肺出血、炎癥細胞、肺實變等明顯減輕；對照組肺組織結構及形態無明顯變化。見圖1。

2.2各組大鼠血漿TNF-α水平的表達

同時間點相比，染毒組、干預組大鼠TNF-α水平較對照組升高(P<0.01)，干預組大鼠TNF-α水平較染毒組明顯降低，具有統計學差異(P<0.01)。見表1。

2.3各組大鼠血漿TGF-β1水平的表達

中毒組大鼠TGF-β1水平隨著中毒時間的延長，在中毒后7天含量最高;同時間點，染毒組、干預組大鼠TGF-β1水平較對照組升高，差異具有統計學意義(P<0.01)；同時間點，干預組大鼠TGF-β1水平較染毒組明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.01)。見表2。

3討論

由于肺內聚胺類的物質攝取系統對百草枯的主動轉運作用，中毒后百草枯大量蓄積在肺組織中，隨著中毒的程度加深，中毒機體的肺組織出現上皮細胞增生、肺水腫甚至出血、纖維化等病理損傷[8]，有研究表明，TNF-α和TGF-β1在肺損傷過程中發揮著重要的生物學作用， TNF-α在百草枯導致的細胞網絡反應中起著啟動和放大的作用，并且能夠激活不同的炎癥細胞，加劇炎癥反應對中毒機體的打擊；TGF-β1則可通過與靶細胞表面相應受體結合，開啟細胞內的信號轉導級聯[9]，調控細胞內相關基因的表達，誘導肺纖維化的形成，最終引發呼吸衰竭。此外，隋宏等[10]觀察發現中毒大鼠血漿內的TGF-β1、PDGF、IGF-1等細胞因子的的含量與染毒劑量相關。大黃是重要的導瀉劑，隨著研究的深入，人們發現大黃具有減少毒物的吸收、抑制炎癥因子釋放以及促進中毒機體胃腸功能恢復等作用，在救治急性農藥中毒中有著重要價值[4]。近年發現，烏司他丁能有效降低百草枯中毒機體的多種炎癥因子的水平[11]，并在救治農藥中毒的過程中逐漸得到應用。王剛等[12]給予大鼠灌胃百草枯(120 mg/kg)制備急性百草枯中毒模型，2小時后腹腔注射UTI 75 KU/kg，結果顯示UTI組給藥后6 小時、24小時、72小時等時間點血清中TNF-α含量均較中毒對照組明顯降低。

圖1　各組大鼠肺組織病理學觀察

組別n第1天第3天第5天第7天對照組822.28±3.7816.87±4.0221.18±4.9917.58±1.90染毒組32231.21±7.89a435.94±7.52a689.39±8.08a985.29±2.47a干預組3297.04±3.20ab278.27±3.68ab323.00±3.08ab699.55±4.80ab

注： 與對照組比較，aP<0.01；與染毒組比較，bP<0.01。

表2　大鼠血漿TGF-β1水平的表達

注： 與對照組比較，aP<0.01；與染毒組比較，bP<0.01。

本實驗發現，染毒組大鼠的血漿TGF-β、TNF-α水平較對照組明顯升高，而且隨著時間延長有增加的趨勢，與以往研究結果相一致。大黃聯合烏司他丁干預后的大鼠血漿內TGF-β、TNF-α含量在中毒后1周內明顯降低，并且干預組大鼠肺病理損傷亦有明顯減輕，說明大黃聯合烏司他丁能夠有效地減輕百草枯中毒導致的肺損傷，其機制可能與大黃促進毒物排泄、減少毒物吸收以及烏司他丁抑制炎癥細胞反應、降低血漿中細胞因子的表達有關。

總之，本實驗初步證實了大黃聯合烏司他丁治療方案對急性期百草枯中毒大鼠的細胞因子具有干預作用，但本研究存在樣本較小、時間較短、未涉及死亡率等不足，后期將對百草枯中毒機體死亡率、血漿濃度、基因表達以及信號轉導等方面進行大樣本深入探討，以期為臨床應用大黃、烏司他丁治療百草枯中毒提供更有力的實驗依據。

參考文獻

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(本文編輯： 韓虹娟)

The protection effect of Rhubarb combine with Ulinastatin on paraquat poisoning induced lung injury in rats

ZhangYong-cheng，JiangYin-song,WangZhan-qing.

DepartmentofEmergency，theAffiliatedHospitalofBinZhouMedicalCollege，Yantai264100，China

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the intervention effect of Rhubarb combine with Ulinastatin on pathological changes of lung tissue and the plasma levels of TNF -α and TGF β1content on paraquat poisoning induced lung injury in rats. Methods72 SD rats were randomly divided into control group(n=8), phosgene group(n=32), intervention group (n=32). The rats in phosgene group and the intervention group were sacrificed at first days, 3 days, 5 days and 7 days. The changes of lung tissue were observed under light microscope, and the determination of the content of plasma TNF-α, TGF-β1. ResultsLung tissue of phosgene group showed significant hemorrhage, inflammatory cell infiltration, pulmonary consolidation and other changes; The lung tissue of intervention group was better than the phosgene group; The level of TNF-α, TGF-β1 was increased on the first day after paraquat intoxication in phosgene group and intervention group, compared with control group, the result had statistical difference(P<0.01); The plasma TGF-β1and TNF-α of intervention group was lower than that of phosgene groups at the same time point, the differences were statistically significant(P<0.01).ConclusionsRhubarb and Ulinastatin can reduce lung injury by decreasing the expression of TNF-α and TGF-β1 on paraquat poisoning induced lung injury in rats.

【Key words】Paraquat；Rhubarb；Ulinastatin；TNF-α；TGF-β1

作者簡介：張永成(1976- )，本科，主治醫師。研究方向：急性中毒。E-mail15666056239@163.com

【中圖分類號】R285.5

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.07.005

(收稿日期：2015-11-08)