酶法產L-丙氨酰-L-谷氨酰胺重組大腸桿菌pepD/pepN基因的敲除及其發酵優化

劉沛沛，張震宇，孫付保，周豪

(江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

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酶法產L-丙氨酰-L-谷氨酰胺重組大腸桿菌pepD/pepN基因的敲除及其發酵優化

劉沛沛，張震宇，孫付保，周豪

(江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

摘要L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-alanyl-L-glutamine, L-Ala-L-Gln)，是目前國內外公認的L-谷氨酰胺載體，在臨床醫學和營養學等領域有廣泛應用。為了減少丙谷二肽在生物酶法生產過程中菌體對其降解，利用λ Red同源重組系統，敲除大腸桿菌中肽酶D和氨肽酶對應的編碼基因。與野生型菌株相比，雙敲除突變菌株的全細胞酶活提高了0.29倍。對該菌株進行搖瓶發酵優化，得到最優培養基為(g/L)：葡萄糖 12、酵母提取物 10、胰蛋白胨 10、(NH4)2SO4 1、KH2PO4 3、K2HPO4 1、MgSO4 0.2；最優發酵溫度為27 ℃ ；最佳反應條件為：Gln 200 mmol/L 、Ala-Ome·HCl 200 mmol/L，反應pH 8.5，反應溫度25 ℃。在最優條件下發酵36 h，丙谷二肽產量達到了14.51 g/L 反應液，是優化前的4.74倍。

關鍵詞L-丙氨酰-L-谷氨酰胺；大腸桿菌；生物酶法；基因敲除；λ Red同源重組；發酵優化

L-谷氨酰胺(L-Glutmine,L-Gln)是一種條件必需氨基酸[1]，通?？捎杉∪獾冉M織大量合成，當人體處于外傷、手術或感染等應激或病理狀態時，Gln的代謝加快，內源合成的Gln不能滿足機體的需要，此時必須外源補充[2-3]。Gln具有維持胃腸黏膜正常組織結構[4]、提高機體抗氧化能力、增強機體免疫功能、抗腫瘤及抗抑郁性等重要生理功能[2]；在畜禽生產方面，適量的Gln可顯著改善斷奶仔豬腹瀉[5-6]，減緩肉仔雞老化速度并減少疫苗免疫對其的傷害[7]。由于Gln單獨存在時，水溶性差(35 g/L, 20 ℃ )，性質不穩定，高溫易產生有毒的焦谷氨酸和氨[8]，限制了其在臨床上的廣泛使用。L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-alanyl-L-glutamine,L-Ala-L-Gln)簡稱丙谷二肽，是國內外公認的L-Gln載體，因其具有水溶性好(586 g/L, 20 ℃ )、穩定性強、在體內能被很快酶解吸收等優點，使得采用丙谷二肽進行靜脈注射可以安全、有效、定量地提供Gln[3]。

目前丙谷二肽的生產方法主要為化學合成法[9]，普遍存在成本高、合成過程復雜、合成條件苛刻、所用試劑有毒、易生成副產物等缺陷，不適合大規模工業生產。然而，生物酶法生產丙谷二肽因其具有成本低、污染少、產物得率高等優勢，成為近年來的研究熱點。2007年，KAZUHIKO T等人[10]在Bacillussubtilis168中發現了L-氨基酸連接酶(Lal)，此酶能夠催化游離的L-丙氨酸和L-谷氨酰胺合成丙谷二肽，利用大腸桿菌過表達Lal，發酵47 h后，丙谷二肽產量達到24.7 g/L。2011年，YOSHINORI H等[11]克隆表達了SphingobacteriumsiyangensisAJ2458中的α-氨基酸酯酰轉移酶(SAET)，該酶能以L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽(L-Ala-OMe·HCl)和L-Gln為底物催化合成丙谷二肽，且酶的專一性較強，副產物較少。2013年，YOSHINORI H等[12]利用重組大腸桿菌過表達SAET，實現了大規模生物酶法催化生產丙谷二肽，在25 L發酵規模下，丙谷二肽濃度達到320 mmol/L。

本實驗室率先在國內開展生物酶法生產丙谷二肽的研究，將α-氨基酸酯酰轉移酶基因(saet基因)置于組成型啟動子的控制下，構建出了不需添加誘導劑，能催化生產丙谷二肽的重組大腸桿菌[13]。 本文在本實驗室已構建的SAET生產菌株的基礎上，敲除大腸桿菌中肽酶D和氨肽酶的編碼基因(pepD、pepN)，在搖瓶水平上探討pepD、pepN基因雙敲除對SAET表達的影響，并對重組大腸桿菌催化生產丙谷二肽進行了發酵優化。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和質粒

本試驗所用菌種及質粒如表1所示。

表1　所用菌種、質粒及其來源

1.1.2酶和試劑

TaqDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶、1 kb DNA Ladder、質粒小量提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒、胰蛋白胨均購自生工生物工程(上海)有限公司；DpnI快切酶、DL5000 DNA Marker及DL10000 DNA Marker購自大連寶生物公司(Takara)公司；L-丙氨酰-L-谷氨酰胺購自TCI公司；L-谷氨酰胺購自國藥集團；L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽購自薩恩化學技術有限公司；鄰苯二甲醛購自Sigma公司。其他試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 引物

所用引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。敲除及鑒定用引物序列見表2。

1.1.4 培養基

LB培養基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，NaCl 10，pH 7.0；固體培養基添加1.8% 瓊脂粉。

初始發酵培養基(g/L)：葡萄糖20，酵母抽提物10，胰蛋白胨10，(NH4)2SO45，KH2PO43，K2HPO41，MgSO40.5。

表2　敲除和鑒定用引物

The underlined sequence represents complementary to the sequence on the both ends of theKangene

1.2方法

1.2.1基因敲除用打靶片段的制備

以pKD4為模板，分別以DP1和DP2、NP1和NP2為引物，Taq和PfuDNA聚合酶以1∶1的比例混勻進行PCR擴增，DpnI處理后對PCR產物進行切膠回收，以膠回收產物分別作為打靶片段敲除大腸桿菌JM109的pepD基因和JM109(ΔpepD)的pepN基因。

1.2.2大腸桿菌pepD、pepN基因的敲除

大腸桿菌JM109中pepD和JM109(ΔpepD) 中pepN基因的敲除方法參見文獻[14]，驗證用菌落PCR的引物對分別為DY1和DY2、NY1和NY2。

1.2.3細胞培養條件

接種1環重組大腸桿菌至裝有30 mL LB液體培養基的250 mL搖瓶中，30 ℃、220 r/min振蕩培養10 h，按4%接種至裝有25 mL發酵培養基的250 mL搖瓶中，25 ℃、220 r/min振蕩培養36 h。

1.2.4完整細胞生產丙谷二肽的反應條件

取2 mL菌液，8 000 r/min離心5 min，去上清液，用等體積的生理鹽水洗滌細胞，用上述離心方法再次離心，棄上清，留下的菌體作為催化底物反應合成丙谷二肽的粗酶源，加入500 μL含有50 mmol/L Gln及50 mmol/L Ala-Ome·HCl、pH 8.0的底物溶液，25 ℃ 反應1.5 h，12 000 r/min離心5 min終止反應，取50 μL反應上清液用于丙谷二肽濃度檢測。

1.2.5 α-氨基酸酯酰轉移酶全細胞酶活的測定

取2 mL菌液，8 000 r/min 離心5 min，去上清，用等體積的生理鹽水洗滌細胞，用上述方法再次離心，棄上清，留下的菌體直接作為催化底物反應的酶源，加入500 μL含有200 mmol/L Gln及200 mmol/L Ala-Ome·HCl 、pH 8.0 的硼酸-NaOH緩沖液(0.1 mol/L)，25 ℃ 反應5 min，12 000 r/min離心5 min 終止反應，取50 μL反應上清測定丙谷二肽濃度。1個單位酶活定義為：1 min 內生成1 μmol 丙谷二肽所需酶量，單位為U；全細胞酶活定義為單位體積發酵液每克干菌體的酶活，單位為U/DCW，其中細胞干重DCW(g/L)=0.54×OD600。

1.2.6丙谷二肽的檢測

柱前衍生：取50 μL標準樣品或反應液，加入200 μL 甲醇、200 μL 0.1 mmol/L 四硼酸鈉、50 μL衍生劑(20 mg鄰苯二甲醛，1.8 mL甲醇，200 μL 0.1 mmol/L四硼酸鈉，20 μL β-巰基乙醇，混勻)混勻，于37 ℃ 水浴25 min，加入500 μL 流動相，過0.22 μm有機系膜。

HPLC檢測色譜條件：色譜柱 SB-AQ C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；柱溫 35 ℃ ；流動相：磷酸緩沖液(12.5 mmol/L , pH 7.2) ∶乙腈 = 9∶1；流速 1 mL/min；激發波長 338 nm，發射波長 450 nm。

1.2.7發酵優化

(1)發酵培養基組分的單因素優化：包括葡萄糖的濃度、硫酸銨的濃度、有機氮源(酵母提取物∶胰蛋白胨 = 1∶1)的濃度以及硫酸鎂的濃度。

(2)發酵培養基組分的正交實驗：根據單因素優化結果，選取葡萄糖、硫酸銨、有機氮源(酵母提取物∶胰蛋白胨 = 1∶1)和硫酸鎂4個因素，按L9(34)正交表實驗。

(3)發酵溫度優化：發酵溫度分別為23、25、27、29、31、33 ℃ 。

(4)反應條件優化：優化了反應pH (7.5、8.0、8.5、9.0)、反應溫度(20、25、30、35 ℃ )及兩種底物濃度配比(丙氨酸甲酯鹽酸鹽濃度為200 mmol/L時，谷氨酰胺的添加濃度為50、100、150、200、250 mmol/L)。

2結果與分析

2.1大腸桿菌中pepD和pepN基因的敲除

據報道，在大腸桿菌中，分別由pepA、pepB、pepD、pepN編碼的4種肽酶對二肽具有廣譜降解活性[15]。一方面，KAZUHIKO T等人通過構建大腸桿菌pepA、pepB、pepD、pepN的單缺失型、雙缺失型及多缺失型突變菌株并加入丙谷二肽培養，探究單個或多個二肽酶和氨肽酶的失活對丙谷二肽降解的影響，結果表明，這些突變菌株中的丙谷二肽殘留量較野生菌都有不同程度的提高[10]，說明這些肽酶對丙谷二肽都有不同程度的降解活性。另一方面，pepD編碼的肽酶D是一種二肽酶，其只對二肽有降解活性[16]，pepN編碼的氨肽酶是大腸桿菌中主要的氨肽酶[17]，因此本實驗首先考慮在大腸桿菌催化生產丙谷二肽的過程中，敲除pepD、pepN基因，以期減少宿主大腸桿菌對產物丙谷二肽的降解。本文采用λ Red同源重組系統先后敲除大腸桿菌JM109中的pepD、pepN基因，構建雙缺失型突變菌株JM109(ΔpepDΔpepN)，作為SAET表達的宿主菌株。

首先分別制備pepD和pepN基因敲除的打靶片段。以pKD4為模板，分別以DP1和DP2、NP1和NP2為引物對，擴增出一段兩端分別與pepD、pepN基因兩端序列同源的，中間為Kan抗性基因的DNA片段，經0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段大小與理論值1601 bp、1572 bp一致(圖1)，經過DpnI處理及膠回收后，所得的產物即可作為JM109中pepD、pepN基因敲除用打靶片段。

A-pepD基因敲除用打靶片段；B-pepN基因敲除用打靶片段圖1　基因敲除用打靶片段的電泳分析Fig.1　Electrophoresis analysis of PCR products

將打靶片段分別電轉入含有pKD46的大腸桿菌電轉感受態細胞，涂布Kan/LB平板。挑選平板上長出的單菌落做菌落PCR鑒定，分別以DY1和DY2、NY1和NY2為引物，電泳檢測PCR產物大小。若以大腸桿菌野生型菌株為模板時，擴增出的條帶理論大小分別為1 458 bp、2 859 bp；若Kan抗性基因替代pepD、pepN基因整合到大腸桿菌的基因組上時，擴增出的條帶理論大小為1 589 bp、1 835 bp。通過平板篩選及菌落PCR鑒定(圖2)可以證明pepD、pepN基因被成功敲除。再將質粒pCP20分別轉化至陽性重組子中，通過42 ℃ 高溫誘導完成Kan抗性基因的消除及pKD46與pCP20質粒的丟失。并分別以DY1和DY2、NY1和NY2為引物做菌落PCR，以進一步確認Kan抗性基因的消除。若Kan抗性基因從基因組上消除，擴增出的條帶理論大小分別為236 bp、441 bp(圖3)。從圖中可以看出，各個條帶的大小均與理論值一致，即成功敲除大腸桿菌JM109中pepD和pepN基因，構建了突變菌株JM109(ΔpepDΔpepN)。

圖2　大腸桿菌JM109野生型菌株及基因缺失型菌株PCR電泳圖譜Fig.2 　Identification of E.coli JM109 gene knockout by colony PCR(A)泳道1：DL5000 DNA Marker；泳道2、3、4：以JM109野生型菌株為模板的菌落PCR；泳道5、6、7：以JM109(ΔpepD)為模板的菌落PCR(B)泳道1、2：以JM109(ΔpepDΔpepN)為模板的菌落PCR；泳道3、4：以JM109野生型菌株為模板的菌落PCR；泳道5：DL5000 DNA Marker

圖3　 大腸桿菌JM109基因缺失型菌株及Kan抗性消除菌株PCR電泳圖譜Fig.3 　Identification of the elimination of Kan resistance gene by colony PCR(A)泳道1：DL5000 DNA Marker；泳道2：空白對照；泳道3、4：以JM109(ΔpepD)為模板的菌落PCR；泳道5、6：以去除Kan抗性基因菌株為模板的菌落PCR(B)泳道1：DL5000 DNA Marker；泳道2：JM109野生型菌株為模板的菌落PCR；泳道3：以JM109(ΔpepDΔpepN)為模板的菌落PCR；泳道5、6：以去除Kan抗性基因菌株為模板的菌落PCR

2.2敲除菌與原菌全細胞酶活比較

將本實驗室已構建的含SAET的質粒載體pAMP-phoC-SAET(圖4)分別轉化至野生菌和敲除菌中，比較SAET在野生菌和敲除菌中的表達情況。如表3所示，首先，敲除菌較野生菌，其菌體生長較慢，有報道pepA、pepB、pepD、pepN缺失型突變株的生長比野生型菌株慢[18]，一些小肽(如含亮氨酸)會抑制大腸桿菌的生長[15]。綜合考慮，肽酶缺失導致胞內一些肽類的累積可能抑制了細胞的生長，但目前還不清楚這些肽酶對胞內二肽的整體降解有多大影響[19]。其次，pepD、pepN雙缺失型菌株，其全細胞酶活較野生菌提高了0.29倍，原因可能是雙突變菌株的生長較野生菌慢，在相同的發酵時間內，其OD600也較低，進而影響了DCW的值；肽酶D和氨肽酶的失活減少了丙谷二肽的分解，使突變菌株的酶活有所提高。實驗結果表明，野生菌的pepD和pepN基因的雙敲除，對SAET催化產丙谷二肽有一定的正向促進作用。

圖4　SAET 表達載體Fig.4　SAET expression vector

重組E.coliOD600值酶活性(U/DCW)JM109/pAMP-phoC-SAET9.1772.33JM109(ΔpepD)/pAMP-phoC-SAET8.0273.5JM109(ΔpepDΔpepN)/pAMP-phoC-SAET7.9493.33

2.3大腸桿菌生長曲線及種齡的選擇

種齡對微生物發酵周期有著重要影響，發酵中一般選擇菌種生長的對數中后期為宜。挑取JM109 (ΔpepDΔpepN)/pAMP-phoC-SAET單菌落接種于LB中，菌種OD600與時間的關系如圖5所示。菌種接入LB后，4 h開始進入對數期，4～12 h為菌種的對數生長期，12 h后進入穩定期。因此，選擇最佳種齡時間為10 h。

圖5　重組菌JM109/(ΔpepDΔpepN)/pAMP-phoC-SAET生長曲線Fig.5　The growth curve of recombinant E. coli JM109/(ΔpepDΔpepN)/pAMP-phoC-SAET

2.4重組大腸桿菌發酵曲線及發酵時間的選擇

為了確定合適的發酵時間，繪制了重組大腸桿菌的發酵曲線。如圖6所示，在發酵36 h之后，丙谷二肽產量沒有明顯的提高，因此，將重組大腸桿菌的發酵時間定為36 h。

圖6　重組菌JM109/(ΔpepDΔpepN)/pAMP-phoC-SAET發酵曲線Fig.6　The fermentation curve of recombinant E. coli JM109(ΔpepDΔpepN)/pAMP-phoC-SAET

2.5發酵培養基單因素優化

2.5.1葡萄糖濃度的優化

在大腸桿菌中，葡萄糖過量會導致溢流效應，葡萄糖經EMP途徑后由代謝支路溢出生成乙酸[20]，而乙酸的積累會影響菌體的生長和蛋白的表達[21]。對葡萄糖濃度的優化(圖7)結果表明，當葡萄糖濃度小于8 g/L時，丙谷二肽產量明顯降低；當葡萄糖濃度校大于8 g/L時，丙谷二肽產量逐漸降低，因此，葡萄糖的最佳濃度為8 g/L。

圖7　葡萄糖添加量的優化Fig.7　The optimization of carbon source concentration

2.5.2氮源濃度的優化

培養基中的氮源能為微生物提供生長所必需的核苷酸、維生素和礦物質元素等。本文優化了無機氮源硫酸銨的添加濃度，如圖8A顯示，當硫酸銨添加濃度大于3 g/L時，丙谷二肽產量逐漸降低，因此，硫酸銨添加量定為3 g/L。

與無機氮源相比，有機氮源除含有豐富的蛋白質、肽類、游離的氨基酸以外，還含有少量的糖類,脂肪和生長因子等。據報道，以酵母提取物與胰蛋白胨為有機氮源時，兩種氮源以1∶1的比例添加時比單獨添加一種有機氮源丙谷二肽產量高[13]，因此在優化有機氮源添加量時，以1∶1的比例添加。由圖8B可知，當有機氮源為30 g/L時，即酵母提取物與胰蛋白胨添加量分別為15 g/L時，丙谷二肽濃度最高。

A-無機氮源硫酸銨濃度優化；B-有機氮源濃度優化(酵母提取物∶胰蛋白胨=1∶1)圖8　氮源添加量的優化Fig.8　The optimization of nitrogen source concentration

2.5.3硫酸鎂質量濃度的優化

Mg2+處于離子狀態時，是許多重要酶的激活劑，MgSO4質量不但影響基質的氧化，還影響蛋白質的合成，而硫可以為菌體合成含硫蛋白質提供硫源。本實驗考察了MgSO4質量濃度對丙谷二肽產量的影響，結果如圖9，當MgSO4質量濃度小于2 g/L時，丙谷二肽產量無明顯變化，MgSO4質量濃度為1 g/L時，丙谷二肽產量相對較高；當MgSO4質量補加量超過2 g/L時，丙谷二肽產量明顯降低。

圖9　MgSO4質量濃度的優化Fig.9　The optimization of MgSO4 concentration

2.5.4培養基組分的正交實驗

根據以上單因素優化結果，考察發酵培養基各組分間的交互作用，選取葡萄糖、硫酸銨、有機氮源(酵母提取物∶胰蛋白胨=1∶1)、MgSO4這4因素做正交實驗，每個因素3個水平，本實驗選取L9(34)正交表試驗，正交實驗因素水平表見表4，結果見表5。

表4　正交試驗因素水平表

表5　正交實驗結果

Ti為各因素同一水平下丙谷二肽產量總和；Ki為Ti平均值；R為極差，表示各因素不同水平下丙谷二肽產量總和的最大差值。

由極差R值可知各因素對丙谷二肽產量的影響順序為：硫酸鎂>有機氮源>硫酸銨>葡萄糖；得到各因素的最佳搭配為：A3B1C1D1。最佳培養基是：12 g/L葡萄糖、1 g/L硫酸銨、10 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、3 g/L磷酸二氫鉀、1 g/L磷酸氫二鉀、0.2 g/L硫酸鎂。經發酵驗證，正交實驗所確定的最佳搭配，丙谷二肽產量為5.08 g/L，是優化前(3.06 g/L)的1.66倍。

2.6發酵溫度優化

培養溫度對菌體生長和目的基因的表達有重要影響，溫度除了直接影響發酵過程中各種反應速率外，還通過改變發酵液的物理性質，間接影響菌體的生物合成。如圖10所示，發酵溫度對丙谷二肽的催化生產有較大影響，當發酵溫度為27 ℃ 時，所對應的丙谷二肽濃度最高，當發酵溫度高于27 ℃ 時，丙谷二肽產量快速下降。

圖10　培養溫度的優化Fig.10　The optimization of fermentation temperature

2.7酶催化反應條件優化

本實驗以發酵菌體為粗酶源，催化L-丙氨酸甲酯鹽酸鹽和L-谷氨酰胺合成丙谷二肽。酶促反應條件是影響酶活性的重要因素，本實驗通過優化催化反應條件，探索產SAET的最適酶促反應條件。

2.7.1反應pH優化

酶的穩定性與其所處環境的pH緊密相關，環境的pH會影響酶分子中相關基團的解離狀態，對反應體系pH值的優化結果如圖11，反應體系pH值為8.5時，丙谷二肽產量最高，因此將酶促反應的最適pH定為8.5。

圖11　反應液pH的優化Fig.11　The optimization of reaction liquid pH

2.7.2反應溫度優化

溫度對酶促反應速率的影響主要表現在兩個方面，一方面是溫度升高時，反應速率加快；另一方面由于酶是蛋白質，隨著溫度的升高，酶蛋白容易逐漸變性而失活，引起酶反應速率的下降。不同溫度對SAET催化生成丙谷二肽的影響結果如圖12，當反應溫度為25 ℃ 時，丙谷二肽的生成量最高。

圖12　反應溫度的優化Fig.12　The optimization of reaction temperature

2.7.3 底物濃度及其配比優化

底物濃度和配比同樣對酶促反應有著重要影響，為了確定最適的底物添加量，將Ala-OMe·HCl固定在200 mmol/L，測定不同Gln濃度對反應速率的影響，考察底物濃度對SAET催化產丙谷二肽的影響，結果如圖13，隨著Gln添加量的加大，丙谷二肽生成量也不斷提高，在底物濃度比為200∶200 時，丙谷二肽產量最高。當繼續增加Gln的添加量時，丙谷二肽產量不再提高，因此將Ala-OMe·HCl和Gln最適底物濃度及配比定為200∶200。

圖13　底物配比的優化Fig.13　The optimization of the ratio of the two substrates,AlaOMe·HCl and Gln

3結論

Ala-Gln不僅具有Gln的各種重要的生理功能，且穩定性好，具有重要的臨床應用價值。本研究在本實驗室成功構建的SAET表達菌株基礎上，敲除了宿主大腸桿菌JM109中的肽酶D與氨肽酶對應的編碼基因pepD與pepN，構建重組大腸桿菌JM109(ΔpepDΔpepN)/pAMP-phoC-SAET。突變菌株的全細胞酶活較野生菌提高了0.29倍。并進一步優化了重組大腸桿菌發酵生產丙谷二肽的發酵培養基組分、發酵溫度及反應條件，在最優條件下，丙谷二肽產量達到了14.51 g/L反應液，是優化前的4.74倍(3.06 g/L)，是國內已知生物酶法生產丙谷二肽的最高水平，為丙谷二肽的工業化生產及國產化提供了技術支持。

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The knockout of genespepDandpepNof recombinantEscherichiacoliproducingL-alanyl-L-glutamine and optimization of its fermentation conditions

LIU Pei-pei, ZHANG Zhen-yu, SUN Fu-bao, ZHOU Hao

(Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education,Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology,Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China)

ABSTRACTL-alanyl-L-glutamine is widely recognized as the L-glutamine carrier and applied in the field of clinical medicine and nutrition.In order to interrupt the degradation of proglumetacin dipeptide in E. coli during the biosynthesis process, the λ Red homologous recombination system was employed to knockout the peptidase D and aminopeptidase corresponding coding genes. Compared with wild-type strains, double knockout mutant strain of whole cell enzyme activity increased 0.29 times. The optimized medium composition contained (g/L): glucose 12，yeast extract 10，bacto tryptone 10，(NH4)2SO4 1，KH2PO4 3，K2HPO4 1，MgSO4 0.2. The optimal cultivation temperature is 27 ℃; the most appropriate reaction conditions are: Gln 200 mmol/L, Ala-Ome·HCl 200 mmol/L, reaction pH value is 8.5, reaction temperature is 25 ℃. Finally, after 36 h fermentation under the optimal conditions, the yield is 14.51 g/L reaction liquid which is 4.74 fold that of the initial codition.

Key wordsL-alanyl-L-glutamine; Escherichia coli; enzymatic; gene knockout; λ Red homologous recombination; fermentation optimization

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606002

基金項目：國家自然科學基金(30970058)；國家自然科學基金(21176106)；工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)開放課題基金(KLIB-ZR200801)

收稿日期：2016-01-15，改回日期：2016-03-01

第一作者：碩士研究生(張震宇教授為通訊作者,E-mail:zhangzy@jiangnan.edu.cn)。