多菌協同發酵蘿卜過程中不同鹽濃度對菌相的影響

黃道梅,胡露,賈秋思,鄭秀艷,孟繁博,陳曦,李國林,李詠富,林茂,劉書亮*

1(貴州省現代農業發展研究所，貴州 貴陽，550006)2(四川農業大學 食品學院，四川 雅安，625014)

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多菌協同發酵蘿卜過程中不同鹽濃度對菌相的影響

黃道梅1,2,胡露2,賈秋思2,鄭秀艷1,孟繁博1,陳曦1,李國林1,李詠富1,林茂1,劉書亮2*

1(貴州省現代農業發展研究所，貴州 貴陽，550006)2(四川農業大學 食品學院，四川 雅安，625014)

摘要采用傳統培養計數方法結合變性梯度凝膠電脈(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)技術，以自然發酵12%鹽度的工業化鹽漬蘿卜為對照，對多菌協同發酵不同鹽度(8%、10%、12%)工業化鹽漬蘿卜過程中(188 d)菌相變化進行了分析。結果表明：4種發酵方式鹽漬水中菌落總數均維持在105～108CFU/mL左右，并呈現先上升后下降最后緩慢上升至平穩的變化趨勢。乳酸菌受鹽度影響較大，其數量隨著鹽度升高而降低，其中自然發酵鹽漬蘿卜比多菌協同發酵蘿卜乳酸菌數低；酵母菌因其耐鹽性較強受鹽度影響較小，但受溫度影響較大，隨著溫度的升高，其數量不斷增加，且4種發酵方式之間酵母菌數無明顯差異。4種方式鹽漬蘿卜中的細菌種類及真菌種類相似，優勢細菌包括Weissella cibaria、Lactobacillus curvatus、Leuconostoc mesenteroides、Lactobacillus plantarum、Halomonas taeanensis等，其中乳酸菌占絕大多數；優勢真菌包括Kodamaea ohmeri、Debaryomyces sp.、Candida sp.等，酵母菌為主要菌群。發酵至88 d后，自然發酵中的優勢細菌種類略高于多菌協同發酵；鹽度的增加明顯抑制了部分細菌的生長，使細菌種類及數量明顯降低。自然發酵與多菌協同發酵的真菌種類在發酵過程中無明顯差異，但酵母菌數量前者多于后者；不同鹽濃度的酵母菌并無明顯差異，發酵28 d，二次加鹽使得酵母菌的種類及數量產生了差異，鹽度的增加抑制了部分酵母菌的生長。

關鍵詞鹽漬蘿卜；多菌協同發酵；菌相；鹽度

泡菜工業作為我國蔬菜加工的一大產業，絕大多數泡菜是通過將新鮮蔬菜進行鹽漬，待鹽漬發酵成熟，將鹽漬蔬菜進行整形、脫鹽、調味、灌裝、滅菌等工藝加工制成。鹽漬蔬菜作為泡菜的第一道關鍵工序，對泡菜風味品質的形成尤為重要。由于蔬菜季節性較強，集中在冬季收獲，絕大多數泡菜企業為了滿足市場的大量需求，不得不加大食鹽濃度(通常采用15%左右食鹽濃度)來達到延長鹽漬蔬菜貯藏期的目的。但泡菜生產帶來的高鹽廢水排放問題已不能滿足日益被重視的環境保護要求，限制了泡菜行業的可持續發展[1-3]。為了滿足行業可持續發展要求和市場需求，低鹽化人工接種發酵蔬菜將逐漸成為絕大多數泡菜企業的發展趨勢[4]。

近幾年來，為了滿足我國泡菜行業的發展需求，國內眾多研究者也開始對泡菜微生物多樣性進行研究，為我國泡菜產業的長足有效發展提供了理論基礎。HYUN-JU EOM等從各國泡菜發酵前期中分離出腸膜明串珠菌，證明它是啟動泡菜發酵的主要菌株[5]。HARUT等采用變性梯度凝膠電脈(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)技術分析了韓國泡菜發酵過程中的微生物，結果表明乳酸菌為主要微生物[6]。代道芳實驗表明，傳統培養和PCR-DGGE方法結合能夠互相取長補短，更好地獲得微生物的多樣性[7]。鄭炯等利用PCR-DGGE方法分析了低鹽和高鹽腌制筍中的細菌多樣性，低鹽的優勢菌多為益生菌，如食竇魏斯氏菌、乳球菌屬、乳酸球菌屬，高鹽的優勢菌則為抗性較強菌屬[8]。本文采用工業化生產工藝，對企業規模化生產泡菜發酵過程中的菌相變化進行解析研究，為其生產過程中的質量控制和品質提升提供數據參考和技術支撐。

1材料與方法

1.1材料與儀器

圓根蘿卜(RaphanussativusL.)、食鹽、鹽漬池：均由某泡菜企業提供。菌種：植物乳桿菌3m-1(Lactobacillusplantarum3m-1)、植物乳桿菌N2(LactobacillusplantarumN2)、腸膜明串珠菌8m-9(Leuconostocmesenteroides8m-9)、食竇魏斯氏菌SJ14(WeissellacibariaSJ14)，均由四川農業大學食品學院食品微生物實驗室提供。培養基：改良MRS液體培養基[9]；系列合成培養基(MRS、孟加拉紅、營養瓊脂、BGLB肉湯、VRBA肉湯)，均為生化試劑(BR)。試劑：Tris堿、甲醛、硝酸銀、乙二胺四乙酸二鈉、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、去離子甲酰胺、尿素、過硫酸銨、TEMED等均為分析純；液氮；TIANDZ柱式細菌DNAOUT，購于四川省綿陽天澤基因工程有限公司；TaqPCR Master Mix、6×Loading Buffer、Marker2000等，購于寶生物工程(大連)有限公司；引物[10](F338-GC、R518、F1427-GC、R1616)由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。

LDZX-40AI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋上海三申醫療核子儀器廠；PCR儀My CyclerTMThermal Cycler，Bio-Rad；凝膠成像系統Quantity One system，Bio-Rad；Milli-Q Gradient超純水系統Millipore；Thermo BR4i 型冷凍離心機Thermo Electron Corporation；變性梯度凝膠電泳儀美國C.B.S. Scientific。

1.2試驗方法

1.2.1鹽漬蘿卜制作

將蘿卜按某企業二次鹽漬發酵工藝放入鹽漬池中進行鹽漬發酵，發酵7 d時，將菌株3m-1、N2、8m-9、SJ14以2∶1∶1∶1的比例添加到鹽漬蘿卜中，通過循環泵循環混勻，密封發酵，并設置不同鹽濃度(8%、10%、12%)，以自然發酵(12%鹽)為對照[11]。

1.2.2樣品及其處理

用潔凈塑料管沿循環管道伸入鹽漬池底部采集水樣，搖勻分裝-20 ℃保存。取樣時間點為：0、7、14、21、28、38、48、58、68、78、88、108、128、158、188 d。

1.2.3菌相變化分析

1.2.3.1傳統培養計數分析無菌吸取25 mL樣品于裝有225 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，制成10-1稀釋液后于試管內進行梯度稀釋至適宜稀釋度，進行以下各種微生物的分離培養與計數。菌落總數：參照GB 4789.2—2010；乳酸菌數：參照GB 4789.35—2010；酵母菌數與霉菌數：參照GB 4789.15—2010；大腸菌群計數：參照GB 4789.3—2010。

1.2.3.2PCR-DGGE技術分析參照文獻[13]中略加改動：取30 mL蘿卜鹽漬水樣品，2 000 r/min離心5 min，收集上清，8 000 r/min高速離心15 min，棄上清，收集菌體沉淀，收集的菌體用20 mL 0.1 mol/l的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)懸浮，8 000 r/min離心15 min，重復洗滌3次，洗凈的菌體懸浮在3 mL磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中，用移液器吹打后均勻，平均分裝3份于2 mL EP管中，-20 ℃凍存；按照天恩澤真菌DNA提取試劑盒的使用說明結合液氮研磨方法提取微生物總DNA。將提取的總DNA溶液，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，-20 ℃保存備用；以提取的總DNA為模板，按表1對細菌16S rDNA V3區和真菌18S rDNA進行PCR擴增，以一次PCR產物為模板按需進行二次PCR擴增，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余產物于-20℃冰箱保存備用；對PCR擴增所得產物采用美國C.B.S. Denaturing Gradient Gel Electrophoresis System進行電泳分離(電泳條件：DGGE變性膠丙烯酰胺濃度8%，變性劑溶液線性梯度40%～50%；電泳程序：60 ℃、200 V預電泳30 min，60 ℃、120 V電泳16 h/18 h)。電泳完成后，取下膠板先后進行固定、銀染、顯影、終止顯影，然后置于凝膠成像儀拍照(圖像用NTSYSpc2.1軟件進行聚類分析)，將優勢條帶進行切割收集，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行后續的回收純化、PCR擴增、克隆測序等步驟，最后測序結果通過 BLAST 程序與GenBank基因庫中的核酸數據進行同源性比對分析，并將序列用MEGA 6軟件繪制系統發育樹。

表1　真菌和細菌PCR擴增程序

1.2.4數據處理

試驗數據及其圖表繪制采用EXCEL、Origin 8.1、SPSS 19.0、MEGA 6、NTSYSpc 2.1等軟件進行處理。

2結果與分析

2.1傳統培養方法檢測結果分析

由圖1可知，在發酵過程中，4種發酵方式的鹽漬池水中的菌落總數變化趨勢基本一致，發酵初期快速上升(P<0.05)，14 d時，達到最大值，四者均接近108CFU/mL。隨后由于二次鹽漬致使其鹽度驟然升高，抑制了大量微生物的生長，致使菌落總數快速下降(P<0.05)，28 d后，隨著微生物對不同鹽度環境的慢慢適應，菌落總數開始逐漸增加(P<0.05)，58 d后，菌落總數開始逐漸下降(P<0.05)，可能是環境pH的降低抑制了部分微生物的生長，發酵88 d后，隨著鹽漬貯藏時間的繼續延長，環境溫度的不斷升高使得其他微生物開始繁殖且自然發酵中的微生物種類豐富，菌落總數開始增加(P<0.05)。

圖1　不同時期蘿卜鹽漬水的菌落總數變化Fig.1　Changes of total bacterial count in salt juice during fermentation

雖然不同發酵方式菌落總數的總體變化趨勢基本一致，但自然發酵與多菌協同發酵之間、不同鹽度發酵之間的菌落總數差異顯著(P<0.05)，其中，在發酵前期，多菌協同發酵大于自然發酵，在88 d后貯藏期，自然發酵大于多菌協同發酵。提高食鹽濃度可以抑制微生物的生長，低鹽度鹽漬池水中的菌落總數高于高鹽度鹽漬池水。

由圖2可知，發酵初期，由于低溫兼酸性環境會抑制大部分細菌的生長，乳酸菌為主要細菌菌群，乳酸菌數的變化趨勢和菌落總數保持一致，發酵初期迅速上升(P<0.05)，14 d時達到最大，4者均大于108CFU/mL，隨后二次鹽漬致使乳酸菌數快速下降(P<0.05)，隨后隨著微生物對不同鹽度環境的慢慢適應，乳酸菌數開始逐漸增加(P<0.05)，68 d后，乳酸菌數開始逐漸下降(P<0.05)，88 d后，乳酸菌數開始增加(P<0.05)，發酵158 d后乳酸菌數開始下降(P<0.05)。同樣由結果分析可知，自然發酵與多菌協同發酵之間、不同鹽度發酵之間的乳酸菌數差異顯著(P<0.05)，多菌協同發酵大于自然發酵，低鹽度鹽漬池水中的乳酸數高于高鹽度鹽漬池水，且不同鹽度對乳酸菌數的影響明顯大于菌落總數。

圖2　不同時期蘿卜鹽漬水的乳酸菌數變化Fig.2　Changes of lactic acid bacterial count in salt juice during fermentation

由圖3可知，在發酵過程中，酵母菌數總體呈現先增加后減少的變化趨勢，發酵88～188 d貯藏期，酵母菌數又呈現不斷上升趨勢。由于酵母菌的耐鹽能力較強，因此，發酵過程中的二次鹽漬對其數量影響較小，小幅度下降后隨即迅速上升。由結果分析可知，酵母菌數并不同于菌落總數、乳酸菌數一樣在自然發酵與多菌協同發酵之間、不同鹽度發酵之間呈現一定規律性，且發酵中后期，4種發酵方式的酵母菌數均在105CFU/mL以上，這可能是因為酵母菌的好氧性，而大型的鹽漬池無法嚴格達到厭氧環境，從而給酵母菌提供了有利生長條件。

圖3　不同時期蘿卜鹽漬水的酵母菌數變化Fig.3　Changes of yeast count in salt juice during fermentation

由表2可知，發酵前1周，大腸菌群數較高，隨著發酵的進行，酸度不斷增加，從而抑制了大腸菌群的生長，發酵58 d，4種發酵方式鹽漬水中的大腸菌群數均小于0.3 MPN/mL，從而也保證了成熟后鹽漬蘿卜的食用安全性。整個發酵過程中，4種發酵方式鹽漬水中霉菌數均小于10 CFU/mL。

表2　不同時期蘿卜鹽漬水的大腸菌群數

2.2PCR-DGGE檢測結果分析

2.2.1PCR擴增結果

采用液氮研磨結合真菌DNA提取試劑盒的方法分別對不同樣品菌體沉淀進行微生物總DNA提取。以提取的總DNA為模板，采用引物F338-GC、R518和F1427-GC、R1616分別對細菌16S rDNA V3區和真菌18S rDNA進行PCR擴增，產物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖4、5。細菌、真菌PCR擴增產物電泳條帶清晰明亮，特異性好，片段大小接近250 bp，與目標條帶(約230 bp)吻合，能夠達到DGGE分析要求，保證其準確可靠。

圖4　細菌PCR擴增產物電泳圖Fig.4　Electrophoretogram for the PCR products of bacteria

圖5　真菌PCR擴增產物電泳圖Fig.5　Electrophoretogram for the PCR products of fungus

由圖4、圖6、表3可知，不同發酵方式不同發酵時期鹽漬蘿卜樣品中優勢細菌存在差異，但由優勢細菌條帶測序比對結果分析可知乳酸菌為鹽漬蘿卜中的絕對優勢菌群，整個發酵過程中，4種發酵方式鹽漬蘿卜的細菌豐度呈現先下降后升高的趨勢，這可能與低溫和鹽度對細菌生長的影響有關，發酵前28 d，4個池子的細菌種類及其優勢菌株無明顯差異，隨著二次加鹽量的不同，58 d時4個池子的細菌種類及其優勢菌株明顯不同，鹽度較低的細菌種類較為豐富，隨著發酵的持續進行，由于環境溫度的逐漸升高、鹽漬水中的鹽分逐漸向蘿卜中滲透，受低溫和高鹽抑制的部分微生物開始大量繁殖，從而使發酵后期細菌種類增多。

當下，隨著互聯網5.0時代的到來，家電行業正在飛速的發展。各種款式多樣、功能豐富的新產品層出不窮，導購策略也是紛繁蕪雜。雖然消費者們擁有了更多家電產品的選擇空間，但在無形中的選購難度也在大大增加。由此，“嘉電”評測項目應運而生。

表3　四種發酵方式鹽漬蘿卜發酵過程中細菌DGGE

1-12%NaCl;2-對照；3-8%NaCl;4-10%NaCl圖6　不同發酵時期鹽漬水中16S rDNA擴增產物的DGGE圖譜Fig.6　DGGE profile of 16S rDNA amplifiled in pickled juice during fermentation

自然發酵鹽漬蘿卜(12%鹽+未接菌)在整個發酵過程中的優勢細菌主要包括Weissellacibaria、Lactobacillusgraminis、Lactobacillusalimentarius、Lactobacillusplantarum、Halomonastaeanensis等，其中Weissellacibaria雖然并未人工添加，卻一直存在于整個發酵時期且基本無交替變化，這說明Weissellacibaria為鹽漬蘿卜中的一類優勢細菌，具有較強的耐鹽和耐低溫能力；Lactobacillusgraminis、Lactobacillusalimentarius主要出現于發酵后期，前期無明顯蹤跡，可能此兩類菌株受溫度及鹽度影響較大；Lactobacillusplantarum在發酵前28 d時數量較多，隨著二次加鹽以及發酵的進行，數量急劇減少至消失，發酵88 d時，又開始出現，隨著發酵的延長再一次增長為優勢細菌；耐鹽能力極強的Halomonastaeanensis在發酵前88 d一直處于優勢地位，發酵至158 d時，數量開始有所減少。

1-12%NaCl;2-對照；3-8%NaCl;4-12%NaCl圖7　不同發酵時期鹽漬水中18S rDNA擴增產物的DGGE圖譜Fig.7　DGGE profile of 18S rDNA amplifiled in pickled juice during fermentation

多菌協同發酵鹽漬蘿卜(12%鹽+接菌、10%鹽+接菌)在發酵過程中的優勢細菌為Weissellacibaria、Lactobacilluscurvatus、Leuconostocmesenteroides、Lactobacillusgraminis、Lactobacillusalimentarius、Lactobacillusplantarum、Pediococcusethanolidurans、Halomonastaeanensis等。其中Weissellacibaria一直存在于整個發酵時期且基本無交替變化；Lactobacilluscurvatus、Leuconostocmesenteroides、Lactobacillusgraminis、Lactobacillusalimentarius這4類細菌受溫度及鹽度影響較大均活躍在發酵后期；Halomonastaeanensis變化趨勢與自然發酵中一致；12%鹽度中Lactobacillusplantarum變化趨勢同自然發酵，而在10%鹽度中一直存且基本無交替變化。多菌協同發酵鹽漬蘿卜(8%鹽+接菌)在發酵過程中的優勢細菌較多，除了上述3種鹽漬蘿卜中的優勢細菌外，還出現了Staphylococcus、Lactobacilluspentosus、Lactobacillusacetotolerans，其中Staphylococcus在中后期數量較多，Lactobacilluspentosus基本上只存在于中期，Lactobacillusacetotolerans只在發酵88 d時出現，Weissellacibaria、Halomonastaeanensis、Leuconostocmesenteroides、Lactobacillusplantarum一直存在于整個發酵時期且基本無交替變化，其他優勢細菌變化趨勢與多菌協同發酵鹽漬蘿卜(10%鹽+接菌)無明顯差異。

綜上所述，自然發酵與多菌協同發酵鹽漬蘿卜之間相比較，由于高鹽低溫環境，在發酵前中期兩者中的優勢細菌種類以及數量并無明顯差異，發酵至88 d后，自然發酵中的優勢細菌種類略高于多菌協同發酵，但自然發酵中并未檢測到Leuconostocmesenteroides的存在或極少量存在。對比不同鹽度多菌協同發酵鹽漬蘿卜之間，鹽度的增加明顯抑制了部分細菌的生長，使細菌種類及數量明顯降低。

表4　四種發酵方式鹽漬蘿卜發酵過程中真菌DGGE

由圖5、圖7、表4可知，不同發酵方式不同發酵時期鹽漬蘿卜樣品中優勢真菌存在差異，但由優勢真菌條帶測序比對結果分析可知酵母菌為鹽漬蘿卜中的絕對優勢菌群，在整個發酵過程中，4種發酵方式鹽漬蘿卜的真菌豐度呈現逐漸升高的趨勢，與細菌的變化趨勢存在差異，分析原因可能是大部分酵母菌具有較強的耐鹽能力，其生長受鹽度影響較小，隨著環境溫度的逐漸升高，其種類及數量也逐漸升高。

自然發酵鹽漬蘿卜(12%鹽+未接菌)在整個過程中的優勢真菌主要有Debaryomyceshansenii、Ambrosiozymamonospora、Saccharomycescerevisiae、Candidasp.、UnculturedDebaryomyces、Kluyveromycesmarxianus、Kodamaeaohmeri、Debaryomycessp.、Kazachstaniasiamensis、Candidalactis-condensi等，其中Saccharomycescerevisiae、Debaryomycessp.一直大量在于整個發酵過程中且基本無交替變化，說明這兩類酵母菌適應力極強，受溫度、鹽度影響較小；Debaryomyceshansenii前期未出現，發酵至28 d時成為優勢菌群，二次加鹽后受高鹽環境影響生長受到抑制，數量減少至消失，當發酵時間延長至158 d時，又再一次成為優勢菌群；Saccharomycescerevisiae在發酵88 d時開始出現，但數量較少，發酵至158 d時繁殖成為優勢菌群；Kodamaeaohmeri、Candidalactis-condensi在發酵58～88 d時出現且數量無明顯差異；Kazachstaniasiamensis發酵前88 d一直存在且處于優勢地位，但發酵88 d后開始減少至消失。

多菌協同發酵鹽漬蘿卜(12%鹽+接菌)在整個發酵過程中真菌的種類及其變化趨勢與自然發酵并無明顯差異，但各類優勢菌的條帶亮度均要低于自然發酵，這說明在人工添加菌株對其酵母菌的菌群交替并無顯著影響，但對抑制酵母菌生長、減少酵母菌的數量有一定的作用。

多菌協同發酵鹽漬蘿卜(10%鹽+接菌)在整個發酵過程中的優勢真菌有Debaryomyceshansenii、Candidasp.、Debaryomycessp.、Wickerhamomycesanomalus、Debaryomyceshansenii、Kodamaeaohmeri、Candidalactis-condensi等。其中，Candidasp.、Debaryomycessp.一直存在于整個發酵過程中且處于優勢地位；Wickerhamomycesanomalus、Kodamaeaohmeri發酵開始并未出現，發酵中期出現，發酵88 d時消失不見，發酵158 d時再次出現；Debaryomyceshansenii僅出現于發酵28 d；Candidalactis-condensi僅出現在發酵58 d且處于優勢。除上述優勢菌群外，Kluyveromycesmarxianus少量存在于發酵88～158 d；Pichiamanshurica、Myxozymaudenii、UnculturedDebaryomyces在發酵末期(158 d)少量存在。

多菌協同發酵鹽漬蘿卜(8%鹽+接菌)由于鹽度較低，在整個發酵過程中的優勢真菌比其他三者多，有Kodamaeaohmeri、Wickerhamomycesanomalus、Debaryomyceshansenii、Ambrosiozymamonospora、Candidasp.、Kluyveromycesmarxianus、Pichiamanshurica、Debaryomycessp.、Kazachstaniasiamensis、Candidalactis-condensi等，其中，Candidasp.、Debaryomycessp.一直存在于整個發酵過程中且處于優勢地位；Wickerhamomycesanomalus發酵28 d時開始出現，后慢慢消失，發酵88 d后又出現；Debaryomyceshansenii僅在發酵28 d時出現；Kodamaeaohmeri、Ambrosiozymamonospora、Myxozymaudenii僅在發酵158 d出現；Saccharomycescerevisiae發酵88 d時出現，后慢慢消失；Kluyveromycesmarxianus在發酵88～158 d時出現；Pichiamanshurica在發酵58 d時出現，隨后慢慢消失，當發酵158 d時再次出現；Kazachstaniasiamensis在發酵前88 d一直存在，末期開始逐漸消失。

綜上所述，自然發酵與多菌協同發酵鹽漬蘿卜之間相比，在整個發酵過程中兩者在真菌菌群種類上無明顯差異，但多菌協同發酵鹽漬蘿卜由于人工添加的菌株對酵母菌的生長有一定的抑制作用，因此在酵母菌數量上前者多于后者；對比不同鹽度的多菌協同發酵鹽漬蘿卜之間，發酵前期并無明顯差異，發酵28 d二次加鹽后由于不同的鹽環境使得酵母菌的種類及數量產生了差異，鹽度的增加在一定程度上抑制了部分酵母菌的增長。

3結論與討論

乳酸菌、酵母菌是蔬菜發酵過程中的優勢菌群，乳酸菌產酸使其乳酸含量不斷積累，從而抑制腐敗微生物的生長，部分酵母菌不斷產生乙醇、酯類等風味物質，賦予獨特的風味，另部分酵母菌會導致泡菜產膜生花，引起腐敗，研究表明，畢赤酵母屬(Pichiasp.)、假絲酵母屬(Candidasp.)在酸性條件下易產膜，是導致泡菜在貯藏過程中生花的主要菌群[13-14]。

微生物的生長很大程度上受環境因素影響，同一環境中不同微生物生長和不同環境中同種微生物生長均存在差異[15]。本文中，鹽度、溫度是影響微生物生長的主要因素。在整個發酵過程中，4種發酵方式鹽漬水中菌落總數均維持在105～108CFU/mL左右，呈現先上升后下降最后緩慢上升至平穩的變化趨勢；乳酸菌受鹽度影響較大，鹽度高的鹽漬蘿卜比鹽度低的乳酸菌數低，自然發酵鹽漬蘿卜比多菌協同發酵乳酸菌數低，這也是自然發酵、高鹽度發酵滯后的主要原因之一；酵母菌因其耐鹽性較強受影響較小，但受溫度影響較大，隨著溫度的升高，酵母菌數不斷增加；發酵58 d后，均未檢測到霉菌和大腸菌群的存在，從而保證了成熟鹽漬蘿卜的使用安全性。在發酵過程中，提高食鹽濃度雖然能夠抑制部分雜菌的生長，但同時抑制了乳酸菌的發展，延長了發酵時間，因此選擇適宜的鹽濃度是關鍵。

通過PCR-DGGE對發酵過程中的菌群變化分析，工業化鹽漬蘿卜發酵過程中優勢細菌包括Weissellacibaria、Lactobacilluscurvatus、Leuconostocmesenteroides、Lactobacillusgraminis、Lactobacillusalimentarius、Lactobacillusplantarum、Pediococcusethanolidurans、Halomonastaeanensis等，其中乳酸菌占絕大多數，優勢真菌包括Kodamaeaohmeri、Debaryomycessp.、Candidasp.、Kazachstaniasiamensis等，酵母菌為主要菌群，這與眾多學者研究結果相似[13-18]。

在整個發酵過程中，Weissellacibaria始終作為優勢細菌大量存在，也成為自然發酵的主要菌群，說明Weissellacibaria本身就是鹽漬蘿卜發酵過程中的主要發酵菌株，LEE等[19]通過DGGE對不同發酵時期朝鮮泡菜檢測，發現Weissellaconfuse、Lactobacillussakes、Lactobacilluscurvatus等為微生物群落的主要組成成員, 趙永威等[20]揭示了魏斯氏菌屬為冬瓜腌制過程中的優勢種群之一。而腸膜明串珠菌作為添加菌種之一，大量存在于多菌協同發酵鹽漬蘿卜的后期過程中，自然發酵中僅少量存在，推測腸膜明串珠菌的添加對改善風味有一定功效，有別于PEDERSON等[21]、EON等[6]由腸膜明串珠菌啟動發酵的研究結果，可能是腸膜明串珠菌受鹽度影響較大所致。植物乳桿菌作為另一添加菌株廣泛存在于整個發酵過程中，但在58 d時因受高鹽抑制少量存在于12%鹽度的鹽漬水中。

Candidasp.、Debaryomycessp.這兩類酵母菌大量存在于整個發酵過程中，研究表明Candidasp.在酸性條件下易產膜，因此發酵中后期池面產生大量膜狀物，可能與Candidasp.的生長密切相關。Kazachstaniasiamensish大量存在于發酵前88 d，隨著發酵的完成，開始慢慢減少至消失。在多菌協同發酵和自然發酵過程中，Kodamaeaohmeri、Ambrosiozymamonospora、Pichiasp.、Kluyveromycesmarxianus等菌不斷交替變化產生的差異，導致最后泡菜風味品質的差異性。

本文采用工業化生產工藝，人工強化接種技術，并首次人工添加食竇魏斯氏菌屬，對不同鹽濃度泡菜多菌協同發酵過程中菌相變化進行解析研究。人工添加的菌株在發酵過程中起到了強化發酵的作用，其中食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria)對不同鹽濃度均有較強的耐受能力，可以作為優良發酵菌株廣泛應用于發酵蔬菜生產中。另外，鹽濃度的增加對鹽漬蘿卜發酵過程中微生物的種類及數量都有一定的抑制作用，尤其是細菌，應適當降低鹽濃度有助于發酵過程中微生物的生長，泡菜特殊風味的形成。該研究結果為泡菜的工業化生產中人工接種技術的應用及產膜生花的防治提供了數據參考。

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Effect of different salinity on the microbial community diversity during strains synergism fermentation of pickled radish

HUANG Dao-mei1,2, HU Lu2, JIA Qiu-si2, ZHENG Xiu-yan1, MENG Fan-bo1,CHEN Xi1，LI Guo-lin1, LI Yong-fu1, LI Mao1*, LIU Shu-liang2*

1 (Guizhou Institute of Modern Agricultural Development, Guiyang 550006,China)2 (College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014,China)

ABSTRACTThe traditional cultivate counting method combined with PCR-DGGE technique was adopted in this paper. Industrialized pickled radish with salinity of 12% from natural fermentation was used as control. The microbial community diversity in different salinity radishes from strains synergism fermentation was analyzed. The results showed that strains quantity was maintained at 105～108 CFU/mL in the pickled water from four ways fermentation, and had a trend of increasing in the beginning and then went down and ascended steadily at last. Salinity had great influence on lactic acid bacteria. The lactic acid bacteria count of pickled radishes with high salinity were less than that of pickled radishes with low salinity, and that of pickled radishes from natural fermentation were less than that of pickled radishes from strains synergism fermentation. Yeast had a high ability of salt tolerance, but it was more vulnerable to temperature. By temperature increasing, yeast count was increased continuously. There was no significant difference in four ways fermentation. Using these four modes, bacteria and fungi species in pickled radishes were similar. The main advantage strains included Weissella cibaria, Lactobacillus curvatus, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus plantarum, Halomonas taeanensis etc., most of them were lactic acid bacteria. The advantage fungi included Kodamaea ohmeri, Debaryomyces sp., Candida sp. etc., wherein yeast were the main microbial community. After 88 days, though the bacteria species during natural fermentation were slightly more compared with strains synergism fermentation, the increase of salinity obviously restrained part of bacterial growing. In fungal species, there was no significant difference between natural fermentation and strains synergism fermentation, but during the whole fermentation, the former fungal count was higher. There was no obvious difference among different salinity pickled radish from strains synergism fermentation during early stage fermentation, however, secondary addition of salinity led to variations of fungal species and its count after 28 days of fermentation. The increase of salinity inhibited the growth of some yeast.

Key wordspickled radish; strains synergism fermention; the microbial community diversity; salinity

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606007

基金項目：黔科合院所創能([2012]4002)；黔科合條(X[2014]4001)；黔科合條(NY[2013]3051)；四川省農業科技成果轉化資金項目(14NZ0012)

收稿日期：2015-12-24，改回日期：2016-02-25

第一作者：碩士研究生(劉書亮教授為通訊作者,E-mail：lsliang999@163.com)。