賀蘭山東麓葡萄酒產區釀酒酵母的分離及其主要特性研究

高曉航，李雪雁，孫春麗

(蘭州理工大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州，730050)

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賀蘭山東麓葡萄酒產區釀酒酵母的分離及其主要特性研究

高曉航，李雪雁*，孫春麗

(蘭州理工大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州，730050)

摘要為進一步豐富我國釀酒酵母資源，從賀蘭山東麓葡萄酒產區的6個不同品種的成熟期釀酒葡萄果實上分離獲得9株野生釀酒酵母，以商業釀酒酵母F15為對照，對分離所得菌株分別進行酒精、SO2、葡萄糖、pH和高滲等耐受性以及β-葡萄糖苷酶活力和果糖利用率影響因素的研究。結果表明，菌株B-1比較適合用于釀造葡萄酒，且β-葡萄糖苷酶主要存在于釀酒酵母細胞外；釀酒酵母的PFK及HK的活性與果糖利用率無相關關系。

關鍵詞釀酒酵母；耐受性；β-葡萄糖苷酶；磷酸果糖激酶；己糖激酶；果糖利用率

釀酒酵母作為葡萄酒發酵過程中最重要的生產菌，直接影響葡萄酒的質量，因此選用適宜的酵母菌對葡萄酒品質尤為重要[1]。β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase)作為水解葡萄糖苷的關鍵酶，能將葡萄中的非揮發性糖苷轉化成揮發性物質，提高葡萄酒香氣復雜性，改善葡萄酒質量[2]，因此，酵母菌產β-葡萄糖苷酶活力的高低也是其釀酒性能非常重要的特性之一。果糖是葡萄中主要的糖分之一，在葡萄酒釀造過程中，酵母菌會首先分解轉化葡萄糖，后分解果糖。有研究表明，發酵中后期葡萄酒中的低葡萄糖果糖比是導致發酵緩慢或停滯的一個重要因素，若果糖不能被有效利用而殘留在葡萄酒中，會造成葡萄酒口感失衡，且酒中殘糖還會誘發微生物污染。影響果糖利用的因素可能與磷酸果糖激酶(Phosphofructokinase, PFK)、己糖激酶(Hexokinase, HK)和轉運蛋白有關。

本研究為進一步豐富我國釀酒酵母資源，擬從賀蘭山東麓葡萄酒產區分離出較優的野生釀酒酵母，對其進行耐受性以及β-葡萄糖苷酶的研究，以篩選出適合葡萄酒釀造的菌株，并通過測定分離所得野生釀酒酵母的果糖利用率、PFK和HK酶活力，來研究這2種酶的活力與果糖利用率之間的關系。

1材料與方法

1.1材料與試劑

試樣：采自于寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產區的6種成熟期釀酒葡萄果粒，分別為：赤霞珠，西拉，梅鹿輒，霞多麗，蛇龍珠和黑比諾。

商業釀酒酵母菌株F15(Saccharomycescerevisiae)：由蘭州理工大學生命科學實驗教學示范中心提供。

葡萄汁培養基：鮮榨葡萄汁(10 BX)，瓊脂2%，pH 5.0，1×105Pa滅菌20 min；

YPD培養基：酵母浸膏1.0%，蛋白胨2.0%，葡萄糖2.0%(固體培養基添加瓊脂2.0%)，pH 5.0，1×105Pa滅菌20 min；

果糖培養基：酵母浸膏1.0%，蛋白胨2.0%，果糖2.0%，1×105Pa滅菌20 min；

WL營養培養基：酵母浸粉0.4%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖5%，瓊脂2%，儲液A(KH2PO45.5g，KCl 4.25 g，CaCl21.25 g，MgSO41.25 g，定容至400 mL，按1/25比例添加)，儲液B(FeCl30.25 g，MnSO40.25 g，定容至100 mL，按1/1000比例添加)，儲液C(0.44 g溴甲酚綠溶于100 mL 50%乙醇溶液中，按0.1%比例添加)，1×105Pa滅菌20 min。

L-谷胱甘肽(還原型谷胱甘肽)(BR)，Triton x-100(RT)，北京博奧拓達科技有限公司；對硝基苯酚(pNP)(AR)，天津市凱信化學工業有限公司；咪唑(AR)，天津市大茂化學試劑廠；對硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)(BR),南京都萊生物技術有限公司；PFK(磷酸果糖激酶)試劑盒，HK(己糖激酶)試劑盒,蘇州科銘生物技術有限公司；半胱氨酸鹽酸鹽(BR)，咔唑(CP),上海中秦化學試劑有限公司。

1.2儀器及設備

SW-CJ-1FD型超凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；FA2004型分析天平，上海良平儀器儀表有限公司；DSX-280A型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；UV-3000PC型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；TGL-16型高速冷凍離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1野生釀酒酵母菌株的分離與鑒定

分別從6種成熟整穗葡萄中各摘取優質葡萄50粒，無菌條件破碎后常溫放置1 h，各取葡萄汁0.1 mL涂布于葡萄汁培養基上，重復3次，28 ℃培養2 d后，將長出的菌落接種YPD固體培養基上，再次28 ℃培養2 d，將再次長出菌落轉接到YPD固體培養基上，劃線分離，純化菌株至純種。通過形態學鑒定，將從自然發酵醪中分離出的野生酵母菌轉接至WL營養培養基劃線培養，28℃培養5～10 d，觀察菌落顏色和形態，進一步進行分類鑒定。

1.3.2酵母菌株的耐受性試驗

以菌株F15作為對照，將篩選出的酵母菌等量(用無菌水配成每毫升含108個細胞數的懸浮液)分別接種于乙醇體積分數(6%、9%、12%、15%、18% vol)、SO2質量濃度(50、100、150、200、250、300 mg/L)、葡萄糖含量(5%、10%、15%、20%、25%、30%)、pH(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0)、NaCl質量濃度(60、80、100、120、140、160 g/L)的帶杜氏小管的YPD液體培養基(10 mL)試管中，28 ℃培養72 h，觀察每支試管中的杜氏小管內是否產生氣泡，并記錄產生氣泡的時間及氣泡體積的變化，若產生氣泡則耐受該條件，同等條件相同時間氣泡體積越大則對該條件耐受性越強。

1.3.3釀酒酵母β-葡萄糖苷酶活性的測定

不同種類酵母菌的β-葡萄糖苷酶在酵母中的分布不同，以菌株F15為對照，測定9株野生釀酒酵母的胞外、壁膜間隙和細胞內β-葡萄糖苷酶的酶活性，酵母菌的β-葡萄糖苷酶是由這3部分酶相加所得。

β-葡萄糖苷酶活性的測定：采用以對硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷為酶底物的比色法[3]。β-葡萄糖苷酶的酶活力表示為每小時1 g干重細胞反應生成的對硝基苯酚的量(μmol)。采用王彩肖等[2]的方法制作pNP標準曲線，得方程y=0.008 7x+0.005 0(R2=0.999 4)。

1.3.4果糖利用率的研究

1.3.4.1果糖利用率的測定

采用半胱氨酸-咔唑比色法[5]。采用張曉卿等[5]的方法制作果糖標準曲線，得方程y=0.019 99x+0.01348(R2=0.999 3)。

1.3.4.2磷酸果糖激酶活性的測定

按照PFK試劑盒使用說明書進行操作。酶活力單位的定義：1 g干重細胞1 min催化1 nmol果糖-6-磷酸和1 nmol ATP轉化為1 nmol果糖-1,6-二磷酸和1 nmol ADP定義為1個酶活力單位。

1.3.4.3己糖激酶活性的測定

按照HK試劑盒使用說明書進行操作。酶活力單位的定義：1 g干重細胞1 min生成1 nmol NADPH定義為1個酶活力單位。

2結果與分析

2.1野生釀酒酵母菌株的分離與鑒定

從6個不同品種成熟期釀酒葡萄的自然發酵醪中分離出117株酵母菌，通過WL培養基篩選出9株釀酒酵母，分別編號為2-1、2-2、2-3、2-4、A-2、A-5、A-7、A-8和B-1。

2.2釀酒酵母菌株的耐受性分析

2.2.1酒精耐受性

復篩所得9株野生釀酒酵母和對照菌株F15的不同最大耐乙醇體積分數(見圖1)比較可知，9株釀酒酵母酒精耐受能力均低于對照菌株。菌株2-3和菌株B-1酒精耐受能力為12%，基本滿足釀造葡萄酒的要求，但應用于實際生產還需進一步馴化培育。

圖1　不同釀酒酵母的酒精耐受性結果比較Fig.1　Comparison of alcohol tolerance of different S.cerevisiae

2.2.2SO2耐受性

復篩所得9株野生釀酒酵母與對照菌株F15的不同最大耐SO2濃度(見圖2)比較表明，菌株B-1耐SO2能力與對照菌株F15相當，可耐受300 mg/L SO2。根據國標GB2760—2011《食品安全國家標準—食品添加劑使用標準》要求葡萄酒中SO2最大使用量250 mg/L，說明菌株B-1完全適應葡萄酒釀造的SO2環境。

圖2　不同釀酒酵母的SO2耐受性結果比較Fig.2　Comparison of SO2 tolerance of different S.cerevisiae

2.2.3高糖耐受性

隨著葡萄糖質量濃度的升高，杜氏小管內出現氣體的時間略有延長。復篩所得9株野生釀酒酵母與對照菌株F15的不同最大耐糖濃度(見圖3)比較發現，菌株B-1耐高糖能力與對照菌株相當，葡萄酒釀造過程中釀酒酵母接觸的最高糖度一般在30%左右，菌株2-3所能耐受的葡萄糖質量濃度為25%左右，所以菌株B-1和2-3對高糖的耐受性基本能適應葡萄酒釀造的糖度環境。

圖3　不同釀酒酵母的高糖耐受性結果比較Fig.3　Comparison of high glucose tolerance of different S.cerevisiae

2.2.4低pH耐受性

隨著pH的降低，杜氏小管內產氣時間延長，產氣量減少。由圖4可知，菌株B-1對pH的耐受性相比對照菌株略差，當pH降至2.5時，杜氏小管內沒有氣體產生，菌株B-1不能生長。與張翠英等[7]報道的釀酒酵母最低生長pH 2.5相比，耐受性略低。一般葡萄汁或葡萄酒pH在3～4，說明菌株B-1和2-3能滿足葡萄酒釀造的pH環境。

圖4　不同釀酒酵母的低pH耐受性結果比較Fig.4　Comparison of pH tolerance of different S.cerevisiae

2.2.5滲透壓耐受性

隨著NaCl質量濃度的升高，杜氏小管內氣體量遞減。由圖5可知，菌株B-1對NaCl的耐受性高于對照菌株，菌株B-1在NaCl質量濃度為120 g/L的YPD培養基中仍能生長，高于蔣錫龍等[8]報道的釀酒酵母耐KCl滲透壓1.8 mol/L，比薛軍俠等[9]報道的個別釀酒酵母耐受2.4 mol/L的KCl低，菌株B-1耐滲透脅迫能力較強，說明菌株B-1完全適應葡萄酒釀造的滲透壓環境。菌株2-2耐滲透脅迫能力與對照組相當，說明該菌株也能適應葡萄酒釀造的滲透壓環境。

圖5　不同釀酒酵母的滲透壓耐受性結果比較Fig.5　Comparison of osmoticsterss tolerance of different S.cerevisiae

2.3β-葡萄糖苷酶活性的比較

通過比較不同釀酒酵母的β-葡萄糖苷酶酶活力(見表1)可知，所試釀酒酵母的β-葡萄糖苷酶主要分布在細胞外，除對照菌株F15外，菌株2-1的β-葡萄糖苷酶活性最高，為175.215 μmolpNP/(g·h)，酶活高于110.00 μmolpNP/(g·h)的菌株還有B-1、A-8、A-5和A-2。菌株2-1胞外酶活最高，為136.799 μmolpNP/(g·h)。結合表1可知，不同野生釀酒酵母發酵上清液中的β-葡萄糖苷酶活性差異顯著(P<0.05)。

2.4果糖利用率的研究

2.4.1果糖利用率的測定

由表2可知，商業酵母F15的果糖利用率最高，接近于100%，復篩所得菌株果糖利用率由高到低依次為A-2、2-3、A-7、A-5、A-8、B-1、2-4、2-2和2-1，不同菌株之間果糖利用率差異顯著。

表1　不同釀酒酵母的β-葡萄糖苷酶酶活力

注：數據后標注不同小寫字母表示多重比較差異顯著(P<0.05)，下同。

表2　不同釀酒酵母的PFK與HK酶活力以及果糖利用率

2.4.2PFK及HK酶活性的比較

由表2可知，菌株2-3的PFK酶活性最高，對照菌株F15最低，不同釀酒酵母之間PFK酶活性差異顯著。菌株2-3的HK酶活性最高，菌株A-2最低，不同菌株之間HK酶活性差異顯著。

3結論

本試驗通過從寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產區的6種成熟期釀酒葡萄果粒分離獲得了9株野生釀酒酵母，通過對這9株釀酒酵母進行耐受性分析以及β-葡萄糖苷酶活力的測定，得知釀酒酵母β-葡萄糖苷酶主要位于細胞外，除對照菌株F15外，酶活性高于110.00 μmol pNP/(g·h)的菌株依次是2-1、B-1、A-8、A-5和A-2。綜合分析，菌株B-1耐受性各項指標均能滿足釀造葡萄酒的基本要求，且β-葡萄糖苷酶活性也較高。通過對各菌株果糖利用率、PFK和HK酶活力的測定和比較，結果表明釀酒酵母的PFK及HK的活性與果糖利用率無相關關系。

目前，國內外有關釀酒酵母果糖利用率的研究報道較少，本試驗從PFK和HK兩個酶的酶活性著手研究，補充了當前釀酒酵母果糖利用率的研究空白，結果證明了PFK和HK酶活性與釀酒酵母果糖利用率無相關關系。因此，為進一步探索影響釀酒酵母果糖利用率的機理，還需從其他可能的影響因子上進行更深一步的研究。

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The isolation and main characteristics ofSaccharomycescerevisiaein East Helan mountain wine-producing regions

GAO Xiao-hang, LI Xue-yan*, SUN Chun-li

(School of life science and engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730050, China)

ABSTRACTIn order to further enrich the resources of wild Saccharomyces cerevisiae in China, 9 yeast strains were isolated from 6 different varieties of mature wine grape fruits in East Helan mountain wine-producing areas. The tolerance (alcohol, SO2, glucose, pH and high osmotic pressure, etc.), β-glucosidase enzyme activity and fructose utilization of the 9 wild wine yeasts were studied using the commercial strain F15 as control. The results showed that the strain B-1 was suitable for brewing wine, and the β-glucosidase mainly existed in the extracellular fluid of S.cerevisiae. The activity of PFK and HK in S.cerevisiae was not correlated with the utilization of fructose.

Key wordsSaccharomyces cerevisiae; tolerance; β-glucosidase; phosphofructokinase; hexokinase; fructose utilization rate

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606011

收稿日期：2016-01-07，改回日期：2016-02-18

第一作者：碩士研究生(李雪雁教授為通訊作者,E-mail：llglixueyan@163.com)。