rProROL脂肪酶催化大豆油水解反應的半經驗動力學模型

覃小麗, 李道明, 王永華,鐘金鋒*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)　2(華南理工大學 食品科學與工程學院，廣東 廣州,510640)

?

rProROL脂肪酶催化大豆油水解反應的半經驗動力學模型

覃小麗1, 李道明2, 王永華2,鐘金鋒1*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(華南理工大學 食品科學與工程學院，廣東 廣州,510640)

摘要以大豆油水解反應為模型，考察了緩沖液pH(5.0～7.0)及其添加量(5%～30%)、酶添加量(10～50 U/g)和反應溫度(30～50 ℃)對rProROL脂肪酶(recombinant Rhizopus oryzae lipase with prosequence，rProROL)催化大豆油水解的影響，并基于反應條件假設該酶促反應遵循一級反應，建立了酶催化大豆油甘油三酯(triglyceride，TAG)水解反應的半經驗動力學模型(Hr=Hri×(1-e-kt)+Hre)，并通過規劃求解得到了不同反應條件下的方程系數。結果顯示，通過對比TAG水解率的實驗實測值與由動力學方程計算的預測值，兩者的相關系數高達0.999 1，驗證了該反應符合一級反應；不同反應條件對方程系數(k、Hri、Hre)的影響程度各不同，反映了該酶催化大豆油水解過程中反應速率常數(k)及TAG水解程度的變化規律，為該酶催化大豆油水解過程優化控制提供了直接的數據支持。

關鍵詞rProROL脂肪酶；水解反應；反應速率常數；動力學模型

油脂水解是脂肪酸生產的重要途徑。目前，油脂水解的方法主要有高壓蒸汽裂解法、化學催化劑催化法和生物酶法。然而，高壓蒸汽水解法存在反應溫度和壓力高(250 ℃，70 bar)、不飽和脂肪酸容易氧化等弱點；化學法對設備要求較高，需要大量的酸對脂肪酸鹽進行酸化。因酶法催化反應具有反應條件溫和、特異性強、設備要求低、工藝綠色化等優越性，其廣泛用于研究油脂改性。酶法催化油脂水解生產脂肪酸成為油脂工業的重要研究方向之一。目前，多種不同來源的脂肪酶被用于催化天然油脂水解制取脂肪酸[1]。近期，Alves等[2]研究顯示，單種酶(Novozym 435、Lipozyme TL-IM和Lipozyme RM-IM)催化大豆油水解的水解率(<50%，70 h)較低，但復合酶(80%Lipozyme RM-IM和20% Novozym 435)能夠顯著提高大豆油的水解率(>80%，24 h)。然而，脂肪酶的生產成本較高和催化效率仍是酶法催化油脂水解工業化生產脂肪酸的技術障礙。因此，對現有脂肪酶的基因序列改造，以獲得高產量和優異的催化性質(高活性、高穩定性等)的重組脂肪酶，這對生物酶法改性油脂具有重要意義。米根霉(Rhizopusoryzae)脂肪酶廣泛用于酯交換反應，但天然酶的表達量少、酶活低。國內外學者在Rhizopusoryzae脂肪酶基因克隆及在不同微生物中表達等方面做了大量研究[3-4]。WANG等[5]構建了Rhizopusoryzae脂肪酶前肽基因序列與成熟肽基因序列(Rhizopusoryzaelipase with prosequence，ProROL)，并在畢赤酵母(Pichiapastoris)中高效表達，獲得高產率的該重組脂肪酶(recombinantRhizopusoryzaelipase with prosequence，rProROL)；結果顯示該重組脂肪酶對多種油脂(棕櫚油、大豆油、菜籽油等)具有較高的水解活性。rProROL在催化醇解反應制備生物柴油中顯示較好的穩定性[6]，并可用于催化酸解反應制備結構酯[7-8]。然而，對rProROL脂肪酶在催化油脂水解制備脂肪酸方面的報道較少。

我們的前期研究顯示，與Palatase 20000L脂肪酶(通常對催化油脂水解具有良好活性)相比，rProROL脂肪酶對大豆油水解具有更高的活性[9]。因此，本研究以自制rProROL肪肪酶為催化劑、大豆油甘油三酯(triglyceride，TAG)水解反應為模型底物，考察該酶在不同反應條件下催化大豆油水解反應的效果。同時，結合相關實驗數據和反應歷程推出大豆油水解反應的半經驗動力學方程，通過規劃擬合求解確定方程的系數，分別探討各反應條件與方程系數的關系，分析rProROL脂肪酶催化水解大豆油的動態反應歷程的變化規律，為rProROL脂肪酶應用于油脂水解生產脂肪酸進行最優化設計提供有益探索和理論依據。

1材料與方法

1.1材料與試劑

rProROL脂肪酶[Rhizopusoryzae脂肪酶前肽基因序列與成熟肽基因序列(ProROL)在重組Pichiapastoris中表達，酶活為5480 U/g]：實驗室自制[9]；大豆油：嘉里糧油(深圳)有限公司；甘油酯標準品(甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯)：Sigma-Aldrich中國分公司；異丙醇和正己烷：色譜純，天津科密歐藥品公司。

1.2實驗方法

1.2.1rProROL脂肪酶催化大豆油水解反應

將10 g大豆油與一定質量的具有不同pH值的緩沖液(0.1mol/L NaH2PO4/Na2HPO4)置于50 mL具塞錐形瓶中，充分混合后加入適量rProROL脂肪酶，置于一定溫度的水浴振蕩器(轉速為200 r/min)中反應。定時取樣得到的混合物經離心(10 000×g，5 min)后，取上層(油層)用于高效液相色譜分析。

1.2.2水解產物組成分析

取20 μL油相(上層)水解產物于1.5 mL進樣瓶中，用1 mL流動相[V(正己烷)∶(異丙醇)∶(甲酸)=15∶1∶0.003]溶解并充分混勻，然后運用高效液相色譜法-示差檢測器對其進行組分分離與分析。色譜分析條件主要包括高效液相色譜儀：Waters 1525型；示差檢測器：Waters 2414型；色譜柱：Phenomenex Luna Silica(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm particle size)；柱溫：35 ℃；流動相：正己烷/異丙醇/甲酸(15∶1∶0.003，體積比)；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL。通過對比標準樣品的保留時間來確定甘油酯及脂肪酸的色譜峰位置；相應組分的保留時間(min)分別為：3.12 (甘油三酯)，3.88(游離脂肪酸)，4.45(1,3-甘油二酯)，5.52 [1,2(2,3)-甘油二酯]，22.44 [1(3)-甘油一酯]，26.93(2-甘油一酯)。采用面積歸一化法計算TAG相對含量(質量分數，占總脂質的面積百分比)。根據式(1)計算大豆油TAG的水解率(hydrolysis rate, 記為Hr)：

(1)

式中：TAGi，反應初始時大豆油TAG相對含量，%；TAGt，反應一段時間后反應混合物中TAG相對含量，%。

1.2.3數據統計分析

采用Excel 2010對TAG水解率和TAG相對含量數據進行處理，結果采用平均值±標準差表示。以TAG水解率指標進行反應過程分析，采用最小二乘法(Solver, Microsoft Excel 2010)擬合得到半經驗一級動力學模型的參數。

2結果與討論

2.1rProROL脂肪酶催化大豆油水解過程中水解率動力學方程的建立

本實驗中，反應底物(大豆油)和攪拌轉速分別固定為10 g和200 r/min，分別考察水解反應體系中緩沖液pH(5.0～7.0)、緩沖液添加量(5%～30%)、酶添加量(10～50 U/g)和反應溫度(30～50 ℃)對大豆油水解率的影響，結果如圖1所示。由圖1可知，各種反應因素對大豆油TAG的水解程度均有不同程度的影響。總體上，不同反應因素對TAG的水解率的變化率在反應4 h內急劇增加，但隨著反應時間的延長(>4 h)，TAG水解率的變化程度趨于平緩。

圖1　不同反應條件對酶促水解大豆油中TAG水解率的影響Fig.1　Effect of reaction parameters on hydrolysis rate of TAG catalyzed by rProROL

(2)

如式(2)所示，大豆油(TAG)與緩沖溶液(H2O)在rProROL脂肪酶作用下水解成甘油二酯(DAG)、甘油一酯(MAG)和脂肪酸(FA)。在本實驗中，緩沖溶液的用量設置為5%～30%(相對于大豆油的質量分數)，在酶促反應過程中TAG濃度大于H2O的濃度。因此，基于TAG水解率的變化趨勢(圖1)，我們假設本反應中rProROL脂肪酶催化大豆油(TAG)水解反應近似為單底物酶促催化反應過程，假設其遵循一級反應動力學。根據反應動力學的基本原理，TAG水解率方程表示為：

Hr=Hri×(1-e-kt)

(3)

式中：Hr，TAG水解率(實驗值)，%；Hri，反應達到平衡狀態時TAG水解率(計算值)，%；k，反應速率常數，h-1；t，反應時間，h。

從圖1可知，酶促水解反應進行到一段時間后，體系中TAG含量保持基本不變，因此，我們引入一個新的參數——Hre，對方程(3)進行修正，更利于反映實際酶促反應，修正得到的方程(4)為rProROL脂肪酶催化水解反應TAG水解率隨時間變化的半經驗動力學模型：

Hr=Hri×(1-e-kt)+Hre

(4)

式中：Hr，TAG水解率(實驗值)，%；Hri，反應達平衡狀態時TAG的水解率(計算值)，%；Hre，rProROL脂肪酶催化水解在時間t時TAG實際水解率(Hr)與計算值(Hri)的偏差值，%；k，反應速率常數，h-1；t，反應時間，h。

2.2反應動力學方程計算值與實驗值的比較與驗證

通過分析不同反應條件下TAG水解率的實驗數據(圖1)，并以此為基礎，將不同反應條件的實驗數據代入方程(4)進行規劃擬合求解，求出相應的方程系數。接著，將相應的動力學系數代入方程(4)計算得到TAG水解率的系列預測值，并對TAG水解率的實驗值作圖，其關系如圖2所示。由圖2可知，兩者之間的線性相關系數為R2=0.999 1，由此可知，依據半經驗動力學模型計算得到的TAG水解率預測值與實驗實測值之間具有良好一致性，這也說明了前面假設本反應近似等同于一級反應動力學是合理的，該半經驗動力學模型的建立能較好地反映本實驗條件范圍內rProROL脂肪酶催化大豆油水解反應過程中TAG水解率的變化規律，表明了建立的半經驗動力學模型的可靠性。

圖2　TAG水解率的實驗測定值與半經驗動力學模型計算值之間的比較Fig.2　Comparative results of TAG hydrolysis rate obtained between experimental determination and model prediction

2.3反應條件對rProROL脂肪酶催化大豆油水解反應過程中TAG水解率的影響

通過上述建立的半經驗動力學模型(方程4)，可以有效獲取不同反應條件下TAG水解率的預測值，對rProROL脂肪酶催化油脂過程優化控制具有一定的參考意義。該模型的3個方程系數共同決定著TAG水解率的預測值，即為了使rProROL脂肪酶催化大豆油水解程度更高，在考慮反應速率常數的同時，需結合Hri和Hre值。下面探討不同反應條件對大豆油水解過程TAG含量及動力學方程系數的影響。

2.3.1緩沖液pH對rProROL脂肪酶催化TAG水解反應的影響

不同pH緩沖液對TAG含量的影響如圖3a所示。當pH為6.5時，TAG含量在6 h時最低；但隨著反應進行到24 h時，pH為7的體系中TAG含量最低，即此時的水解率為最高。這表明具有較高pH值的緩沖液利于rProROL脂肪酶活性的發揮，但隨著水解反應的推進，體系中產生的游離脂肪酸可能降低了體系的pH值，因而顯示在初始pH為6.5的緩沖液中rProROL脂肪酶在水解反應后期的活性可能受到抑制。然而，很難直觀地從圖3a中直接評價整體反應快慢程度以及pH對rProROL脂肪酶催化TAG水解率變化程度。因此，我們需要結合半經驗動力學方程的系數變化來分析酶促水解反應。

圖3　不同pH緩沖液對rProROL 脂肪酶催化大豆油TAG水解反應的影響Fig.3　Effect of buffer pH on rProROL lipase catalyzed hydrolysis of soybean TAG(其他反應條件為：大豆油10 g，溫度45 ℃，酶添加量30 U/g緩沖溶液2 g)

不同pH緩沖液對rProROL脂肪酶催化TAG水解的影響規律如圖3(b)所示。從圖3(b)中可知，隨著pH的增大，k值變化不大。Hri隨著pH增加而先降低后增加，Hre則呈現與Hri相反的變化趨勢。由方程(4)可知，欲使rProROL脂肪酶催化大豆油水解程度更高，在考慮反應速率常數的同時，需結合Hri和Hre值以選擇合適pH值的緩沖溶液。例如，以反應10 h(因為10 h后TAG含量的變化趨于平緩，圖3a)為時間點，根據圖3(b)方程系數由方程(4)計算得到的TAG水解率預測值如圖3b所示。可見，當pH≥6.5時，TAG水解率預測值較高，這意味著較高pH的緩沖液能夠縮短水解反應達到平衡的時間。

2.3.2緩沖液添加量對rProROL脂肪酶催化TAG水解反應的影響

緩沖液添加量對TAG含量變化影響如圖4(a)所示。TAG含量隨著緩沖液添加量的增加而降低，但當添加量大于20%時，水解反應末階段的TAG含量差別不大。這意味適量的緩沖溶液有利于促進水解反應，但是達到一定量后，對水解反應的影響則趨于平緩。這可能由于反應體系中緩沖溶液添加量較大時其緩沖能力能夠抵消隨著反應不斷進行產生的游離脂肪酸引起體系的pH值變化，從而能較好地維持脂肪酶的催化活性。

圖4　緩沖液添加量對rProROL脂肪酶催化大豆油TAG水解反應的影響Fig.4　Effect of buffer content on rProROL-catalyzed hydrolysis of soybean TAG(其他反應條件為：大豆油10 g，溫度45 ℃，酶添加量30 U/g，緩沖溶液pH 6.5)

圖4(b)是緩沖液添加量對動力學方程系數的變化影響示意圖。從圖4(b)可知，當添加量為5%時，其反應速率常數(k)為0.379 6 h-1；當添加量≥20%時，k值(0.487 8 h-1)達到最大并隨后略有下降的趨勢。這主要是由于H2O作為反應物之一，適量增加其含量有助于反應向右進行，因而增大了反應速率常數；但過量的緩沖液(>20%)會稀釋酶的濃度，從而導致k值有所下降。Hri隨著緩沖液添加量增大呈現緩慢下降的趨勢，Hre則相反。通過計算TAG水解率的預測值(10 h)可知，較低的緩沖液添加量(5%)對TAG水解率的影響較大，但較高的緩沖液添加量(≥20%)對rProROL催化水解大豆油影響不大。

2.3.3酶添加量對rProROL脂肪酶催化TAG水解反應的影響

酶添加量對rProROL酶促水解大豆油中TAG含量的影響如圖5a所示。在反應初始階段，TAG含量隨著酶添加量的增加(從10 U/g增加至50 U/g)呈現顯著降低的趨勢，這說明增加酶的用量有助于提高水解反應效率。例如，從10 U/g增加至50 U/g時，TAG含量在4 h時分別降低至49.13%和31.17%。但是，隨著反應進行到接近平衡時，TAG含量降低程度趨于緩慢，例如，酶添加量從10 U/g增加至50 U/g時，TAG含量在24 h時從28.49%降至25.62%。

圖5　酶添加量對rProROL脂肪酶催化大豆油TAG水解反應的影響Fig.5　Effect of lipase loading on rProROL-catalyzed hydrolysis of soybean TAG(其他反應條件為：大豆油10 g，緩沖溶液(pH 6.5)2 g，溫度45 ℃)

酶添加量對動力學方程系數的影響變化趨勢如圖5b所示。反應速率常數k值隨著酶添加量增加呈線性增加的趨勢，這與SCHWAAB等[10]報道的動力學速率系數與催化劑(脂肪酶)的用量成正比一致。這說明了增大酶添加量有助于提高rProROL脂肪酶催化反應速率。同時，隨著酶添加量的增大，Hri呈現先緩慢下降后快速上升的趨勢，而Hre則呈現相反的變化趨勢。雖然反應速率常數隨著酶添加量的增加而增大，但將這3個方程系數(k、Hri和Hre)帶入方程(4)中得到相對應的TAG水解率(10 h)預測值沒有明顯增大，尤其是酶添加量≥30 U/g時，這說明較高酶用量(≥30 U/g)對rProROL脂肪酶催化大豆油水解反應平衡所需要的時間沒有顯著影響。

2.3.4反應溫度對rProROL脂肪酶催化TAG水解反應的影響

反應溫度對rProROL酶促水解反應中TAG含量的影響如圖6a所示。當反應溫度從30 ℃升高至45 ℃時，TAG含量隨著反應進行呈現降低的趨勢，這主要由于適當提高溫度，可以促進酶活的發揮，有利于水解反應的進行；但溫度繼續升高至50 ℃時，TAG含量反而較高，這可能由于較高的溫度容易使酶蛋白失活，不利于該反應向水解正方向進行，從而導致了TAG的水解程度較低。

圖6　反應溫度對rProROL脂肪酶催化大豆油TAG水解反應的影響Fig.6　Effect of reaction temperature on rProROL-catalyzed hydrolysis of soybean TAG[其他反應條件為：大豆油10 g，酶添加量30 U/g，緩沖溶液(pH 6.5)2 g]

由圖6(b)可知，反應速率常數k隨著溫度的升高而呈現先升高后趨于平緩的變化趨勢，這說明升高溫度，有利于提高水解反應速率，但當溫度超過一定值(>45 ℃)后，k值呈現略有下降的趨勢，這主要由于過高的溫度造成了酶蛋白變性，酶活力下降，從而影響了酶促水解反應速率。然而，這些變化比較平緩，說明了反應溫度對酶促反應速率影響較小。同時，結合Hri和Hre值通過方程(4)計算得到的TAG水解率預測值變化不大，這進一步驗證反應溫度對rProROL酶促水解大豆油的反應影響較小。

3結論

本文研究了緩沖溶液pH、緩沖溶液添加量、酶添加量、反應溫度對rProROL脂肪酶催化水解大豆油過程中水解率的影響。基于本實驗條件下得到的大豆油水解率系列數據，從反應的基本原理出發，推導并假設了該反應遵循一級反應半經驗動力學。通過規劃求解得到大豆油水解率的反應動力學方程[Hr=Hri×(1-e-kt)+Hre]的各系數值。通過對比大豆油水解率實驗測定值與由半經驗動力學方程計算得到的預測值，兩者的相關系數(R2)為0.999 1，驗證了該反應過程符合一級反應動力學方程，并能較好反映該酶促過程中大豆油水解率的變化規律。最后，將方程系數對反應因素作圖，得到了反應條件對動力學方程系數的影響程度各不相同，由這些方程系數共同決定TAG含量的預測值。本研究為rProROL脂肪酶催化水解油脂最大化制取游離脂肪酸進行了有益探索。

參考文獻

[1]MURTY V R, BHAT J, MUNISWARAN P. Hydrolysis of oils by using immobilized lipase enzyme: a review [J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2002, 7(2): 57-66.

[2]ALVES J S, VIEIRA N S, CUNHA A S, et al. Combi-lipase for heterogeneous substrates: A new approach for hydrolysis of soybean oil using mixtures of biocatalysts [J]. RSC Advances, 2014, 4(14): 6 863-6 868.

[3]LI Z, LI X, WANG Y, et al. Expression and characterization of recombinantRhizopusoryzaelipase for enzymatic biodiesel production [J]. Bioresource Technology, 2011, 102(20): 9 810-9 813.

[4]Di Lorenzo M, Hidalgo A, Haas M, et al. Heterologous production of functional forms ofRhizopusoryzaelipase in Escherichia coli [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(12): 8 974-8 977.

[5]WANG J R, LI Y Y, XU S D, et al. High-level expression of pro-form lipase fromRhizopusoryzaeinPichiapastorisand its purification and characterization [J]. International Journal of Molecular Sciences, 2013, 15(1): 203-217.

[6]DUARTE S H, del PESO HERNNDEZ G L, CANET A, et al. Enzymatic biodiesel synthesis from yeast oil using immobilized recombinantRhizopusoryzaelipase [J]. Bioresource Technology, 2015, 183:175-180.

[7]TECEL O C, GUILL N M, VALERO F, et al. Immobilized heterologousRhizopusoryzaelipase: A feasible biocatalyst for the production of human milk fat substitutes [J]. Biochemical Engineering Journal, 2012, 67:104-110.

[8]NUNES P, PIRES-CABRAL P, GUILL N M, et al. Production of MLM-type structured lipids catalyzed by immobilized heterologousRhizopusoryzaelipase [J]. Journal of the American Oil Chemists′ Society, 2011, 88(4): 473-480.

[9]LI D, QIN X, WANG J, et al. Hydrolysis of soybean oil to produce diacylglycerol by a lipase fromRhizopusoryzae[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2015, 115:43-50.

[10]SCHWAAB M, PINTO J C. Optimum reference temperature for reparameterization of the Arrhenius equation. Part 1: Problems involving one kinetic constant [J]. Chemical Engineering Science, 2007, 62(10): 2 750-2 764.

Semi-empirical kinetic model of hydrolysis of soybean oil catalyzed by recombinantRhizopusoryzaelipase

QIN Xiao-li1, LI Dao-ming2, WANG Yong-hua2, ZHONG Jin-feng1*

1(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)2(College of Food Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

ABSTRACTSoybean oil was hydrolyzed by using a recombinant Rhizopus oryzae lipase containing prosequence (rProROL), and effect of buffer pH (5.0-7.0), buffer amount (5%-30%), lipase amount (10-50 U/g) and reaction temperature (30-50℃) were investigated. Based on the employed reaction conditions, rProROL-catalyzed hydrolysis was assumed as a first-order reaction, and a semi-empirical kinetic model for the hydrolysis rate (Hr) was established, and the model was presented as follows: Hr=Hri×(1-e-kt)+Hre. Parameters including reaction rate constant (k), theoretical hydrolysis rate (Hri) and difference value (Hre) related to Hr and Hri were solved using a programming. The results showed that the correlation coefficient between hydrolysis rates of soybean oil obtained from experiments and predicted by the established kinetic model was 0.999 1, which verified that the rProROL-catalyzed hydrolysis of soybean oil was a first-order reaction and the established model was effective. In addition, reaction rate constant (k), Hre and Hri were affected by various conditions, indicating changes in k and Hr during the hydrolysis of soybean oil catalyzed by rProROL. These results may provide information for optimization and monitoring of rProROL-catalyzed hydrolysis process.

Key wordsrecombinant Rhizopus oryzae lipase with prosequence (rProROLT1 lipase); hydrolysis; reaction rate constant; kinetic model

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606012

基金項目：中央高校基本業務費專項(XDJK2014B019，XDJK2016b034)；重慶市基礎科學與前沿技術研究專項(cstc2015jcyjA80013)；國家自然科學基金(31501446)

收稿日期：2016-02-23，改回日期：2016-03-09

第一作者： 博士，講師(鐘金鋒為通訊作者,E-mail：jfzhong@swu.edu.cn)。