嗜熱厭氧梭菌27405直接發酵造紙污泥產氫特性

瞿曉蘇，湯虹，朱明軍

(華南理工大學 生物科學與工程學院，廣州 廣東，510006)

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嗜熱厭氧梭菌27405直接發酵造紙污泥產氫特性

瞿曉蘇，湯虹，朱明軍*

(華南理工大學 生物科學與工程學院，廣州 廣東，510006)

摘要造紙污泥含有大量纖維素和半纖維素，能被纖維素降解菌直接利用。嗜熱厭氧梭菌(Clostridium thermocellum)能利用不同來源的木質纖維素生產氫氣。為評價C.thermocellum直接發酵造紙污泥產氫特性，研究了接種量、尿素濃度、酵母提取物濃度和底物濃度對產氫的影響。結果表明:當C.thermocellum接種量為7%、培養基中尿素濃度為15 μg/L、酵母提取物質量濃度為5 μg/L及造紙污泥質量濃度為20 μg/L時，氫氣產量最高，為110.61 μmmol/L。造紙污泥相對于其他木質纖維素原料具有明顯的產氫優勢。

關鍵詞熱纖梭菌;發酵;造紙污泥;產氫

近年來，環境污染的威脅、全球能源需求的增長及能源的愈發短缺加速了人們尋找新的可再生清潔能源的步伐。氫氣是一種零污染物排放的可再生能源，其完全燃燒僅產生水。與汽油相比，氫氣具有更高的熱值，每克氫氣完全燃燒時所放出的熱量為122 kJ[1]，因此氫氣作為替代燃料開發潛力巨大。氫氣可以在燃料電池和內燃機中使用，研究指出，在天然氣中加入10%氫氣將顯著減少溫室氣體排放[2]。相對于熱化學制氫和電化學制氫，發酵法生物制氫過程耗能少且成本低，備受世人關注。發酵法生產氫氣的經濟可行性很大程度上取決于以有機廢物或廢水為原料的可用性，現今大多數原材料來源于農業廢棄物[2-3]，多數原料需要進行預處理，增加了氫氣的生產成本。

造紙污泥是制漿造紙廢水生化處理過程的固體殘渣。2009年，中國產生9.982×106t 80%含水量的造紙污泥，居世界首位，且將以10%的增長率逐年增加[4]。在制漿造紙過程中，原料中的大部分纖維質被用于生產紙制品，余下的有機質則被轉移到廢水中，因此造紙污泥中含有豐富的生物質，碳水化合物含量約為50%～70%，其中大約有80%是纖維素和半纖維素[5]，另外還含有一些填料、凝聚劑等。將造紙污泥隨意棄置或未經無害化處理容易污染環境，尤其是污染地下水資源，危害人體健康，甚至帶來生態危機[6]。由于污泥成分的復雜性，處理的難度大且成本高，如何將造紙污泥進行資源化利用具有重要的現實意義。

嗜熱厭氧梭菌(Clostridiumthermocellum)是一種嚴格嗜熱厭氧菌，它能迅速降解纖維素和半纖維素。這種菌在細胞膜表面形成胞外多酶復合物(即纖維小體)，其中包含20種以上的水解酶，如纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、幾丁質酶、糖苷酶和脂酶[7]。水解纖維素后，C.thermocellum利用高聚合度的纖維二糖和纖維糊精產生乙醇、氫氣、乙酸、乳酸、甲酸和二氧化碳等代謝產物。C.thermocellum能高效水解不同種類的纖維素原料，理論上可以直接利用造紙污泥發酵產氫。本研究以造紙污泥為原料，利用C.thermocellum在不經任何預處理和不加酶的情況下直接發酵造紙污泥，并對其產氫性能進行了研究。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1菌種來源

嗜熱厭氧梭菌(ClostridiumthermocellumATCC 27405)由Dartmouth College 的 Lee R. Lynd 教授贈送，保藏于華南理工大學發酵工程研究室。

1.1.2原料

化學制漿污泥(含纖維素57.60%，半纖維素13.41%，灰分12.60%)來自廣東某造紙廠。將造紙污泥放入60 ℃烘箱干燥48 h后，使用高速萬能粉碎機粉碎后過200目篩，室溫存放。

1.1.3主要試劑及儀器

微晶纖維素Avicel? PH-105購自美國FMC BioPolymer公司; G+細菌基因組DNA提取試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司; qPCR用premix試劑SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa); 其余試劑為進口或國產的分析純或生化試劑。主要儀器:7500型實時熒光定量PCR儀，美國應用生物系統公司(ABI)生產。

1.2培養基及培養方法

本研究所用的基本培養基為MTC培養基，主要包括A、B、C、D、E五種培養液。培養基的具體成分詳見李平等的研究[8]。培養基5種成分按體積比40∶2∶1∶1∶1用無菌注射器在100 mL血清瓶中混合，每個血清瓶中培養基裝液量為45 mL。以10%的接種量(V/V)接入C.thermocellum菌液，于55 ℃、150 r/min的條件下培養84 h作為種子液。

1.3實驗方法

1.3.1菌種降解造紙污泥產氫特性研究

在55 ℃、150 r/min的條件下，研究接種量、酵母提取物濃度、尿素濃度和底物濃度對C.thermocellum直接發酵造紙污泥產氫的影響。所有實驗在100 mL血清瓶中進行，工作體積為50 mL。以10%的接種量(V/V)接種新鮮種子液，發酵168 h后測定氫氣產量、生物量、pH值以及發酵液中產物的分布。為了保證數據的可信度，實驗組各設3個平行實驗。

1.3.2最優條件下菌種降解造紙污泥產氫

在1.3.1研究的基礎上，探索最優條件下C.thermocellum直接發酵造紙污泥產氫特性。以最優濃度的造紙污泥為碳源，配制MTC培養基，其中尿素濃度和酵母提取物濃度按照最優濃度配置，以最優接種量(V/V)接種新鮮菌液，放置于55 ℃、150 r/min的搖床中培養，每24 h取樣，連續取樣至168 h，測定各瓶中氫氣產量、生物量、pH值、底物降解率以及發酵液中產物的分布。底物降解率通過測定發酵前后造紙污泥干重的變化進行計算。

(1)

1.4分析測定方法

1.4.1氫氣產量的測定

發酵后血清瓶中H2和CO2濃度通過氣相色譜(GC)法分析得出。具體步驟詳見之前的研究[9]。

1.4.2發酵液中產物的測定

發酵液中的次級代謝產物(乙醇、乙酸)通過高效液相色譜(HPLC)測定，色譜儀為Waters 1525 Binary HPLC Pump;色譜柱為Aminex HPX-87H column (Bio-Rad Laboratories, CA, USA)，柱溫60 ℃;檢測器為Waters 2414示差折光檢測器 (RID, refractive index detector)，檢測器溫度為40 ℃。流動相為5 mmol/L H2SO4(超純水配制)，流速為0.6 mL/min。所有樣品在HPLC分析前都必須進行預處理，具體方法詳見李平等的研究[8]。

1.4.3細胞生長的測定

生物量按照之前所建立的qPCR方法進行測定[9]。

1.4.4pH的測定

發酵后發酵液的pH值直接用PB-10酸度計進行測定，測定范圍為0～14，精度為0.01。

2結果與討論

2.1不同接種量對菌種直接發酵造紙污泥產氫的影響

發酵初期的菌體濃度可能顯著影響菌體生長的延滯期及產物的合成，為研究接種量對C.thermocellum直接發酵造紙污泥產氫的影響，分別以5%、7%、10%、12%和15%的接種量(V/V)接種菌液，168 h后測定各瓶中氫氣的產量、生物量、pH值以及發酵液中產物的分布，其結果如圖1所示。

圖1　在不同的接種量下發酵168 h后得到的發酵產物、生物量和pH變化情況 Fig.1　Effect of inoculum size on products, cell number and pH at the end-point(168 h) of fermentation

由圖1可以看出，接種量對C.thermocellum直接發酵造紙污泥產氫具有較為明顯的影響。當接種量為5%時，發酵液中菌體含量較低，同時，發酵液中纖維素酶的酶解效率較低，不利于菌體利用底物。氫氣的產量在接種量為7%時最高，達到41.17 mmol/L(0.59 mmol/g); 隨著接種量的繼續增加，氫氣的產量逐漸下降，這可能是由于接種量較高時，發酵前期菌體生長迅速，同時快速產生有機酸，伴隨著發酵液pH的迅速下降。過低的pH一方面抑制菌體的生長，另一方面也抑制了纖維素酶的活力[8]，從而阻礙了菌體的代謝和酶解。另外，種子液的pH約為5.0～5.5，而C.thermocellum生長最適的pH為7.4，接種量越大，發酵液初始pH越低，從而抑制菌體的生長和代謝，進一步抑制發酵產氫。

2.2尿素濃度對菌種直接發酵造紙污泥產氫的影響

ISLAM等[10]在研究中發現，當提高培養基中尿素的濃度時，能同時促進C.thermocellum產生氫氣和乙醇。為研究尿素濃度對C.thermocellum發酵造紙污泥的影響，調整MTC培養基中尿素質量濃度分別為0、5、10、15和20 g/L，發酵168 h后測定各瓶中氫氣產量、生物量、pH值以及發酵液中產物的分布，其結果如圖2所示。

圖2　在不同的尿素質量濃度下發酵168 h后得到的發酵產物、生物量和pH變化情況Fig.2　Effect of urea concentration on products, cell number and pH at the end-point(168 h) of fermentation

由圖2可知，在較低質量濃度范圍內，氫氣產量隨著尿素質量濃度的升高而略微升高，當濃度從0 g/L升高為15 g/L時到達最大值，為37.18 mmol/g，進一步提高尿素質量濃度則使氫氣產量下降。與氫氣產量不同，乙醇產量隨著尿素含量的升高而顯著提高，尿素質量濃度為15 g/L時，乙醇產量最高，為25.27 mmol/L，比不添加尿素時提高了210%; 進一步提高尿素質量濃度并沒有使乙醇產量繼續提高。LIN等[11]指出，產氫微生物活性依賴于碳氮比，合適的碳氮比通過影響微生物的代謝途徑從而增強氫氣的產量。可以推斷，尿素濃度的提高改變了碳氮比，使C.thermocellum發酵產生乙醇的代謝途徑顯著增強，而C.thermocellum的氫氣代謝途徑與乙醇代謝途徑都屬于葡萄糖代謝的分支途徑，存在一定的競爭關系，因此當乙醇代謝途徑增強時， 往往伴隨著氫氣代謝途徑的減弱。

曾有文獻報道，尿素對乙酸的產生起促進作用[12]。也有文獻指出，尿素可以與乙醇反應生成氨基甲酸乙酯(尿烷)，從而降低乙醇濃度[13]。

乙酸產量在低質量濃度范圍內隨尿素質量濃度的升高而升高，但當尿素質量濃度高于10 g/L時，乙酸產量并沒有進一步增加。造成這種現象的原因可能是:尿素的堿性使發酵終pH值隨尿素濃度的升高而升高(圖2(b))，當尿素含量從0 g/L增加到20 g/L時，發酵終pH值從5.17增加到6.29。

2.3酵母提取物質量濃度對菌種直接發酵造紙污泥產氫的影響

酵母提取物與尿素都屬于有機氮源，為微生物生長和產物合成提供營養。尿素對微生物的促進作用僅在于細胞的比生產能力，而酵母提取物則對發酵的各個方面都存在顯著的影響[10]。為研究酵母提取物對C.thermocellum生長代謝的影響，調整MTC培養基中酵母提取物質量濃度分別為0、1、3、5和7 g/L，發酵168 h后測定各瓶中氫氣產量、生物量、pH值以及發酵液中產物的分布，其結果如圖3所示。

據報道，C.thermocellumATCC 27405完全轉化1%纖維素時，需要至少0.6%酵母提取物[14];C.thermopalmarium與C.thermocellum共培養的條件下，1 g纖維素底物在添加1 g酵母提取物時達到最高產氫量和底物利用率[15]。另外，酵母提取物除了含有氨基氮外還含有維生素和其他未知生長因子，為微生物生長提供良好的營養源;而C.thermocellum所利用酵母提取物中的功能組分主要是對氨基苯甲酸、VB12、吡哆胺和生物素。這可能是酵母提取物同時對纖維素降解和氫氣的生產產生顯著促進作用的原因。如圖3所示，當酵母抽提物質量濃度從0提高到5 g/L的過程中，氫氣的產量隨之不斷升高，從21.55 mmol/L增加到38.51 mmol/L;同時，發酵結束時細胞量從6.60×108cell/mL上升為21.89×108cell/mL，發酵終點的pH從5.25下降為5.10。然而，進一步提高酵母提取物的濃度，氫氣產量有所下降。因此，C.thermocellum在以造紙污泥為碳源時發酵產氫，酵母提取物的最優濃度為5 g/L。

圖3　在不同酵母提取物質量濃度下發酵168 h得到的發酵產物、生物量和pH變化情況Fig.3　Effect of yeast extract concentration on products, cell number and pH at the end-point(168 h) of fermentation

2.4底物濃度對菌種直接發酵造紙污泥產氫的影響

底物濃度對發酵產物的產量具有顯著的影響，工業化生產中常期望提高底物濃度以增大產物的產量。底物濃度過低會增加發酵成本，底物濃度過高則不利于發酵過程的傳質傳熱。為探索造紙污泥最佳濃度，分別以5、10、20和40 g/L的造紙污泥為碳源，測定發酵168 h后各瓶中氫氣產量、生物量、pH值以及發酵液中產物的分布，結果如圖4所示。

由圖4可知，氫氣產量隨著造紙污泥濃度的增加而上升(圖4(a))。當造紙污泥質量濃度達到40 g/L時，氫氣濃度達到最大值132.99 mmol/L，為20 g/L造紙污泥濃度時氫氣產量的1.41倍。但是40 g/L造紙污泥濃度下的每克底物的氫氣產量為3.32 mmol，比20 g/L造紙污泥濃度時每克底物的氫氣產量4.72 mmol/L低29%。這說明在高濃度底物條件下，C.thermocellum酶解效率較低。高底物濃度下發酵產物的產量降低的現象在其他文獻中也有報道[16]。當底物濃度過高時，由于游離水少，傳質傳熱困難，氫氣產量增加放緩，發酵效率下降。底物濃度過高，也將促使血清瓶內揮發性脂肪酸的積累增多，進而使pH下降幅度增大，影響脫氫酶的活性，不利于菌體產氫。另外，隨著底物濃度的提高，血清瓶中的氫分壓也相應增大，過高的氫分壓抑制氫氣的生成。考慮到當底物質量濃度超過20 g/L時，目的產物氫氣濃度上升而單位氫氣產量卻下降，故研究選取20 g/L的造紙污泥作為最適的底物質量濃度。

圖4　在不同的造紙污泥濃度下發酵168 h得到的發酵產物、生物量和pH變化情況Fig.4　Effect of paper sludge concentration on products, cell number and pH at the end-point(168 h) of fermentation

2.5最優條件下C.thermocellum直接發酵造紙污泥產氫

基于之前的研究結果，探索最優條件下C.thermocellum直接發酵造紙污泥產生氫氣的量。以20 g/L的造紙污泥為碳源，調整MTC培養基中尿素濃度和酵母提取物含量分別為15 g/L和5 g/L，以最優接種量7%(V/V)接種新鮮菌液，放置于55 ℃，150 r/min的搖床中培養，每24 h取樣，連續取樣至168 h，測定各瓶中氫氣產量、生物量、pH值、底物降解率以及發酵液中產物的分布，其結果如圖5所示。

圖5　最優條件下發酵168 h得到的產物、生物量、pH和底物降解率隨時間的變化曲線Fig.5　Time course of products, cell growth, pH value and substrate degradation during fermentation by C. thermocellum

C.thermocellum經過24 h的延滯期，進入對數生長期(圖5(b))，在對數前期(48 h)開始有少量氫氣生成(圖5(a))。隨著發酵的進行，氫氣的產量迅速增加，呈對數增長。96 h氫氣產生速率減緩，此時pH降至5.38，研究指出，產氫最適的pH的范圍是5.5～7.5，在此pH范圍之外時氫氣產率將顯著降低[17]。發酵期間，pH由最初的7.28降至最終的5.21。直至168 h發酵結束時，氫氣產量達到110.61 mmol/L，與優化前相比，產量增加17.11%;底物降解率達到63.37%(圖5(c))。乙酸產量的積累趨勢與氫氣產量相似(圖5(a))。 乙醇在24 h開始產生，但濃度很低，24 h～72 h乙醇產量迅速增加，發酵結束時乙醇濃度為14.89 mM，與優化前相比，產量增加21.85%。另外，發酵結束時(168 h)，發酵液中葡萄糖含量為0.09 g/L，說明直接發酵造紙污泥后的發酵液可發酵糖含量非常低，菌體利用非常充分。

對近年來發酵(木質)纖維素原料生物制氫的研究與本研究進行了比較(表1)。造紙污泥在不進行預處理的條件下，由C.thermocellum直接發酵產氫具有顯著的優勢:不僅氫氣產率高，而且免去了因預處理產生的成本。

發酵過程中的pH被認為是影響菌種代謝途徑和產氫的最重要環境因素之一。GENG等[15]指出，添加一定濃度的KHCO3有利于延遲pH降低的時間，緩解了低pH對C.thermocellum生長和代謝的抑制，從而導致纖維素的利用率提高，產氫增加，發酵終pH維持在較高值。ZHANG等[18]也在研究中發現，氨堿法純堿生產固體廢棄物白泥中含有大量碳酸鈣，在培養基中加入的白泥能參與發酵系統的酸堿平衡，增加了發酵液的堿度和緩沖能力，從而在無需外部調控pH的情況下顯著提高產氫率。與此類似，造紙污泥中存在著大量的碳酸鈣填料，緩沖能力較強，且富含纖維素和半纖維素，作為生物制氫的原料具有很大的潛力。

表1　木質纖維素生物制氫的比較

3結論

C.thermocellum能在不經任何預處理和不加酶的情況下直接發酵造紙污泥生產氫氣，在最適接種量為7%，尿素質量濃度為15 g/L，酵母提取物的質量濃度為5 g/L，底物質量濃度為20 g/L的條件下，血清瓶培養時氫氣產量達到110.61 mmol/L，相對于其他木質纖維素原料具有明顯的產氫優勢。

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Study on characteristics of biohydrogen production from unpretreated paper sludge byClostridiumthermocellum

QU Xiao-su,TANG Hong,ZHU Ming-jun*

(School of Biological Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China)

ABSTRACTPaper sludge was largely composed of cellulose and hemicellulose. It could be used as carbon source by bacteria with cellulolytic capability. Clostridium thermocellum could utilize various lignocellulose to produce hydrogen. In order to evaluate the use of cellulose contained in this type of sludge for Clostridium thermocellum to produce hydrogen, the influence of various factors including inoculum size, urea concentration, yeast extract concentration and substrate concentration on hydrogen production were studied. The maximum yield of hydrogen reached 110.61 mmol/L medium under the optimal conditions as follows: 7% of inoculum size, 15 g/L of urea, 5 g/L of yeast extract and 20 g/L of paper sludge. Paper sludge has considerable advantages over the other lignocellulosic biomass on hydrogen production, which might be attributed to the existence of calcium carbonate. This kind of alkali-rich materials could maintain the relative stability of pH thus improve hydrogen fermentation performance. The glucose concentration at the end of fermentation was lower than 0.1 g/L, indicating that no new pollutants were produced in the biodegradation.

Key wordsClostridium thermocellum(C.thermocellum); paper sludge;fermentation;hydrogen production

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606015

基金項目：國家自然科學基金(51278200 & 51478190)；廣東省自然科學基金重點項目(2014A030311014)；廣州市科技計劃項目(201510010288)

收稿日期：2015-12-22，改回日期：2016-01-23

第一作者：碩士研究生(朱明軍教授為通訊作者,E-mail：mjzhu@scut.edu.cn)。