匍枝根霉淀粉發酵產纖維素酶的條件研究

周若飛，湯斌，李松，闞清華

(安徽工程大學 微生物發酵安徽省工程技術研究中心，安徽 蕪湖，241000)

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匍枝根霉淀粉發酵產纖維素酶的條件研究

周若飛，湯斌*，李松，闞清華

(安徽工程大學 微生物發酵安徽省工程技術研究中心，安徽 蕪湖，241000)

摘要以匍枝根霉TP-02(Rhizopus stolonifer TP-02)為出發菌株，首次利用淀粉水解液為主要碳源，快速合成纖維素酶。從碳源、氮源、培養溫度、初始pH、裝液量和接種量等方面研究該菌株的產酶條件。獲得最佳培養基和培養條件為：10%淀粉水解液，麩皮浸出汁5%，NH4Cl 0.5%，KH2PO40.5%，MgSO4·7H2O 0.4%，CaCl2 0.4%，酵母粉0.6%；發酵溫度30 ℃，裝液量80 mL/(250 mL)，初始pH 5.0，接種量8%。通過搖瓶實驗優化培養基和培養條件后，獲得濾紙酶活為9.66 IU/mL。研究中進一步利用該培養基在5 L發酵罐中發酵至60 h時酶活達到最大值，其中濾紙酶活、外切酶活、內切酶活和β-葡萄糖苷酶分別為16.51、15.39、11.48和6.17 IU/mL。與以往纖維素類物質為碳源發酵產纖維素酶相比，淀粉水解液發酵獲得的纖維素酶酶系組成有了較大的變化，特別是關鍵的外切酶活有了大幅度提高，而發酵時間縮短了將近1倍。

關鍵詞匍枝根霉；淀粉水解液；發酵；纖維素酶

纖維素酶己在食品、醫藥、飼料、造紙和生物質能源等工業領域得到廣泛的應用[1-2]，但仍受限于居高不下的生產成本問題，主要表現為以下兩個方面：其一，纖維素酶產生菌株的發酵酶活力相對較低，一直是大規模生產急需解決的問題，也是長期制約纖維素酶大量生產并限制其應用的主要因素[3]；其二，目前使用的絲狀真菌由于菌種特性和培養條件等因素使得纖維素酶發酵時間普遍較長，成本過高。因此，在目前纖維素酶的發酵生產和研究領域中，選擇廉價易得的發酵碳源并大幅降低發酵時間依然是快速降低纖維素酶發酵成本的有效途徑之一。已報道的可發酵產纖維素酶的碳源主要有工業纖維素、麥麩、農作物秸稈及乳糖等。自然界中，很多絲狀真菌能利用這些碳源很好地產纖維素酶，且分泌的纖維素酶酶系完全，然而發酵時間長一直無法解決[4-5]。

目前研究纖維素類碳源發酵產纖維素酶比較多，真菌利用淀粉發酵產纖維素酶報道比較少[6-7]。本文以匍枝根霉為研究對象，濾紙酶活為主要考量目標，首次利用淀粉水解液作為主要碳源，研究淀粉水解液發酵產纖維素酶的條件，尋找出一種適合匍枝根霉利用淀粉水解液發酵產纖維素酶的工藝條件。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1菌種

匍枝根霉TP-02(RhizopusstoloniferTP-02)，本實驗室從黃山生態林中采集并分離出1株高產纖維素酶菌種。

1.1.2培養基

(1)種子培養基(10%麩皮浸出汁)：稱取100 g麩皮，加入800 mL蒸餾水煮沸30 min，4層紗布過濾，定容至1 000 mL。

(2)20%淀粉水解液：稱取200 g玉米淀粉放入1 000 mL燒杯中，加入800 mL蒸餾水和6 g高溫α-淀粉酶，60 ℃水浴酶解30 min，定容至1 000 mL。

(3)液體發酵培養基：取500 mL 20%淀粉水解液和500 mL 10%麩皮浸出汁混勻后分別加入NH4Cl 0.5%，KH2PO40.5%，MgSO4·7H20 0.4%，CaCl20.4%，酵母粉0.6%，PEG4000 0.02%，微量元素液0.000 2%。

1.1.3試劑

分析純微晶纖維素，水楊苷，購自上海生物工程有限公司；羧甲基纖維素鈉，購自國藥集團化學試劑有限公司；玉米淀粉，購自成武大地玉米開發有限公司；細菌高溫α-淀粉酶(40 000 U/mg)，購自山東龍元生物工程有限公司；雙圈牌定量濾紙，購自杭州沃華濾紙有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.4主要儀器和設備

QHZ-123B組合式全溫度振蕩培養箱； BIOTECH-5BG-15JSA-3000PLC 自動發酵罐；723可見分光光度計。

1.2實驗方法

1.2.1種子活化

將超低溫(-80 ℃)保存的菌種劃線接種到PDA斜面上，于30 ℃恒溫培養3 d。

1.2.2種子制備及發酵

用無菌水洗下培養3 d斜面上的孢子，并稀釋至每毫升孢子濃度為108個，接入100 mL種子液中培養24 h后，按10% 接種量吸取種子液到80 mL產酶培養基中，每隔6 h取樣并測發酵液相關酶活。每組3個平行，每個平行重復測定3次。以上培養條件均為200 r/min、30 ℃恒溫振蕩培養。

1.2.3酶活測定

粗酶液的制備：培養發酵12 h后，用移液器每隔6 h從產酶培養基中取1 mL酶液于1.5 mL離心管中，5 000 r/min離心10 min，取上清液用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(0.05 mol/L，pH 4.8)進行適當稀釋，用于測酶活。

濾紙酶活的測定：國際純粹與應用化學聯合會(International Union of Pure and Applied Chemistry,IUPAC)推薦的標準方法[8]測定。

CMC酶活的測定:以CMC為底物，采用文獻[9]的方法測定。

CBH酶活的測定：以微晶纖維素為底物，采用文獻[10]的方法測定。

β-葡萄糖苷酶酶活的測定：以水楊苷為底物，采用文獻[11]的方法測定。

1.2.4碳氮源對產纖維素酶的影響

將匍枝根霉種子液以10%接種量接種到不同淀粉水解液的培養基中，研究主要碳源淀粉水解液對產纖維素酶的影響；以10%的接種量接種到含有0.4%的單一氮源(硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、硝酸鉀、尿素)培養基中，考察單一氮源對產纖維素酶的影響；再以10%的接種量接種到含有0.5%的不同有機氮源(蛋白胨、酵母粉、牛肉浸膏、酵母浸膏，豆餅粉)的復合氮源培養基中，研究復合氮源對產纖維素酶的影響。在此基礎上，設計正交實驗研究碳氮源對產纖維素酶的影響。菌株在上述條件下自然pH，裝液量為80 mL，培養溫度為30 ℃，200 r/min恒溫搖床培養54 h，分別測定其濾紙酶活。

1.2.5培養條件對產纖維素酶的影響

以10%的接種量接種到80 mL產酶液體發酵培養基中，于不同培養溫度26、28、30、32、34 ℃發酵產纖維素酶，研究培養溫度對菌株產纖維素酶的影響；分別以2%、4%、6%、8%、10%的接種量接種到80 mL產酶發酵培養基中，于30 ℃恒溫搖床培養，研究接種量對菌株產纖維素酶的影響；以10%的接種量接種到80 mL酶培養基中，調節培養基pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，于30 ℃恒溫搖床培養，研究初始pH對產酶的影響；以10%的接種量接種不同體積(40、60、80、100、120 mL)的產酶培養基中，于30 ℃恒溫搖床培養，考察裝液量對產纖維素酶的影響；菌株在上述條件下于200 r/min恒溫搖床振蕩培養66 h。

1.2.6優化后的培養基上罐發酵產纖維素酶

在上述搖瓶發酵的基礎上，進一步研究上罐發酵的產纖維素酶情況。在5 L發酵罐中，裝液量為3.2 L，接種量為8%，發酵溫度為30 ℃，pH為5.0，溶氧控制為25%左右發酵產纖維素酶，發酵12 h后每隔6 h取樣測定發酵液的纖維素酶酶活。通過測定培養基優化后上罐發酵酶活力變化情況，確定此發酵培養基產酶效果及酶系配比。

2結果與分析

2.1碳氮源對產酶的影響

2.1.1淀粉水解液對產酶的影響

利用高溫α-淀粉酶水解淀粉得到淀粉水解液作為主要碳源，發酵產纖維素酶，并分別從淀粉百分比、加酶量、水解溫度與水解時間4個方面進行優化，結果如圖1所示。確定淀粉百分比為10%、加酶量為0.3%、水解溫度為60 ℃，水解時間為30 min，得到的淀粉水解液最適合發酵產纖維素酶。

A-不同水解時間，淀粉含量為15%，加酶量為0.2%，水解溫度為70 ℃；B-不同加酶量，淀粉含量為15%，水解時間為30 min，水解溫度為70 ℃；C-不同水解溫度，淀粉含量為15%，加酶量為0.3%，水解時間為30 min；D-不同淀粉含量：加酶量為0.3%，水解時間為30 min，水解溫度為60 ℃。圖1　不同淀粉水解液對產酶的影響Fig.1　Effect of different starch hydrolyzate on enzyme production

2.1.2單一氮源對產纖維素酶的影響

由圖2可知，相對于其他氮源，氯化銨為氮源時濾紙酶活最高，因此選擇氯化銨作為無機氮源。

圖2　氮源對產酶的影響Fig.2　Effect of different nitrogen on enzyme production

2.1.3復合氮源對產酶的影響

由圖3可知，在0.4%的氯化銨無機氮源基礎上添加0.5%的酵母粉有機氮源獲得濾紙酶活最高，故選擇添加0.5%的酵母粉。

圖3　有機氮源對產酶的影響Fig.3　Effect of different organic nitrogen on enzyme production

2.1.4碳氮源正交實驗

正交實驗L9(33)設計見表1。

由實驗結果可知，淀粉水解液、氯化銨、酵母粉對匍枝根霉產纖維素能力依次是淀粉水解液>氯化銨>酵母粉，即碳源淀粉水解液濃度對酶活影響最大，其次是氮源氯化銨濃度，最后是氮源酵母粉濃度。故選擇酶活力最高的培養條件，即淀粉水解液10%、氯化銨0.5%、酵母粉0.6%。方差結果顯示，其中碳源對匍枝根霉發酵產纖維素酶影響顯著(P<0.05)(見表3)。

表1　正交實驗設計

表2　正交實驗結果

表3　實驗結果方差分析

2.2發酵條件對產酶的影響

2.2.1溫度對產酶的影響

由圖4可知纖維素酶的合成與培養溫度有較大的關系，在較低溫度26 ℃時，由于菌株生長緩慢，酶活高峰期延長且酶活力比較低。當培養溫度為30 ℃時，菌絲體旺盛生長，酶分泌增多，酶活力增大，54 h時濾紙酶活達8.12 IU/mL。但若溫度持續升高，可能造成了菌株過早老化，酶分泌量減少，酶活力逐漸降低。

圖4　不同溫度對纖維素酶合成的影響Fig.4　Effects of different temperatures on cellulose production

2.2.2接種量對產酶的影響

由圖5可知，接種量對產纖維素酶效果影響較為明顯，接種量為2%時，生長緩慢，酶活最高點延遲且酶活力較小，當到接種量為8%時，產酶水平達到峰值，濾紙酶活為8.83 IU/mL，當接種量超過8%以后，產酶水平有所下降。

圖5　不同接種量對纖維素酶合成的影響Fig.5　Effects of different inoculum size on cellulose production

2.2.3初始pH對產酶的影響

從圖6可以看出在pH 3.0～5.0，隨著pH的提高，濾紙酶活不斷增加，pH 5.0時達9.05 IU/mL。pH超過5.0之后，產酶水平開始下降。

圖6　不同pH對纖維素酶合成的影響Fig.6　Effects of different pH on cellulose production

2.2.4裝液量對產酶的影響

由圖7可知，隨著裝液量的增加，濾紙酶活逐漸上升，由于匍枝根霉發酵過程中耗氧比較快，當裝液量超過80 mL，產酶水平不升反降，這是由于供氧不足，不利于匍枝根霉的生長與產酶。結果表明，250 mL三角瓶中裝入80 mL培養基能獲得最佳的產酶效果，濾紙酶活達9.66 IU/mL。

圖7　裝液量對纖維素酶合成的影響Fig.7　Effects of liquid on cellulose production

2.35 L罐發酵產纖維素酶

由圖8可知，相比搖瓶，上罐在60 h時酶活達到最高點，FPA，CBH，CMC，BG分別為16.51，15.39，11.48，6.17 IU/mL，相對優化前分別提高了54.8%，53.9%，47.5%，48.1%，可見通過對產酶條件的研究，使得匍枝根霉可以利用酶解淀粉作為主要碳源發酵，高效合成纖維素酶。于其他絲狀真菌發酵產纖維素酶情況相比較，匍枝根霉利用淀粉水解液發酵產纖維素酶在酶活力沒有減少的前提下，發酵時間大大縮短。

圖8　纖維素酶酶活發酵過程變化曲線Fig.8　Cellulase activity curve of the fermentation process

3討論

通過對匍枝根霉淀粉發酵產纖維素酶培養基的優化，得到最適產酶的培養基和培養條件如下：10%淀粉水解液(水解溫度60 ℃、水解時間30 min、加酶量0.3%、淀粉10%)，麩皮浸出汁5%，NH4Cl 0.5%，KH2PO40.5%，MgSO4·7H2O 0.4%，CaCl20.4%，酵母粉0.6%， PEG4000 0.02%，微量元素液0.000 2%，發酵溫度30 ℃，裝液量80 mL，初始pH 5.0，接種量8%，搖瓶發酵54 h后獲得濾紙酶活為9.66 IU/mL。該條件下匍枝根霉具有良好的產纖維素酶能力，分泌的酶系也比較完全且發酵時間縮短，5 L發酵罐發酵60 h時纖維素酶酶活達到最大值，獲得濾紙酶活，外切酶活，內切酶活，β-葡萄糖苷酶分別為16.51，15.39，11.48，6.17 IU/mL。

本文首次利用淀粉發酵匍枝根霉產纖維素酶，與以往的利用纖維素直接誘導產纖維素酶有較大區別。目前關于纖維素誘導產纖維素酶研究比較多，普遍認為纖維二糖有誘導產纖維素酶的作用，然而酶解淀粉快速高效合成纖維素酶沒有相關報道，其誘導機理也有待進一步研究。與匍枝根霉稻草誘導產酶相比，利用淀粉水解液發酵所獲得的纖維素酶酶系配比發生了較大變化。其中，濾紙酶活提高了25.5%，內切酶活雖然有所下降，但關鍵的外切酶活提高了近28倍，β-葡萄糖苷酶活變化不大[7]，其酶系組成變得更加合理。另外，匍枝根霉利用稻草發酵需要84 h達到酶活最高點，而酶解淀粉發酵只需要60 h，由此可見利用淀粉發酵能大大縮短發酵時間，并有效提高纖維素酶總酶活和酶解效率，具有良好的應用前景。

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Studies on the fermentation conditions ofRhizopusstoloniferto produce cellulase by starch hydrolysate

ZHOU Ruo-fei,TANG Bin,LI Song,KAN Qing-hua

(Anhui Polytechnic University,Engineering Technololy Research Center of Anhui Microbial Fermentation,Wuhu 241000,China)

ABSTRACTStarch hydrolyzate was first utilized as the main carbon for Rhizopus stolonifer TP-02 to achieve a highly efficient production of cellulase. The fermentation conditions including carbon source, nitrogen source, temperature, initial pH, medium volume, and concentration of inoculum were optimized. The optimal medium and culture conditions were confirmed as follows: starch hydrolyzate of 10%, wheat bran extract of 5%, NH4Cl of 0.5%, KH2PO4 of 0.5%, MgSO4·7H2O of 0.4%, CaCl2 of 0.4%, yeast extract of 0.6%, fermentation temperature of 30 ℃, medium volume of 80 mL/ (250 mL), initial pH 5.0 and inoculation concentration of 10%. In the condition mentioned above, the filter paper activity could peak at 9.66 IU/mL. Enlarging the fermentation in a 5 L fermenter, the activity of cellulase reached the maximum value after 60 h. The activity of filter paper, exoglucanase, endoglucanase and β- glucosidase was 16.51 IU/mL, 15.39 IU/mL, 11.48 IU/mL and 6.17 IU/mL, respectively. Compared with conventional cellulose-based material as a carbon source for fermentation of cellulose enzyme, the composition of cellulase obtaining from fermentation of starch hydrolyzate had significant changes. Especially the critical exonuclease activity had greatly improved. The fermentation time had been nearly doubled shortened.

Key wordsRhizopus stolonifera; starch hydrolysate; fermentation; cellulose

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606016

基金項目：國家自然科學基金項目(31270135)

收稿日期：2015-12-24，改回日期：2016-01-23

第一作者：碩士研究生(湯斌教授為通訊作者，E-mail：tangbin@ahpu.edu.cn)。