基于電子鼻技術(shù)監(jiān)測金耳深層發(fā)酵

黃星奕，陳茂晴，張志才，王順，潘思慧

(江蘇大學 食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江，212013)

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基于電子鼻技術(shù)監(jiān)測金耳深層發(fā)酵

黃星奕，陳茂晴，張志才，王順，潘思慧

(江蘇大學 食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江，212013)

摘要利用電子鼻技術(shù)監(jiān)測金耳深層發(fā)酵過程尾氣變化，實現(xiàn)對金耳液體發(fā)酵過程的監(jiān)測。優(yōu)選出7根對金耳發(fā)酵液揮發(fā)性組分敏感的TGS系列氣敏傳感器。對所得數(shù)據(jù)進行主成分分析(principal component analysis，PCA)、模糊C均值聚類分析(fuzzy c-means method，F(xiàn)CM)和K最近鄰分析(K-nearest neighbors analysis，KNN)，通過主成分分析和模糊C均值聚類分析可以準確區(qū)分金耳的3個生長階段。KNN模型在預測集和驗證集中均對發(fā)酵階段取得了較為理想的識別結(jié)果。實驗結(jié)果表明，電子鼻技術(shù)可以有效監(jiān)測金耳深層發(fā)酵過程狀態(tài)。

關(guān)鍵詞電子鼻；金耳；發(fā)酵監(jiān)控；尾氣

金耳是中國特有的稀有菌種，主要分布于西藏、云南等地，在我國擁有悠久的食用藥用歷史，古籍記載金耳可用于肺熱、痰多、咳嗽等癥的治療[1]。從20世紀后期開始，研究人員對金耳的培育、液體深層發(fā)酵、代謝產(chǎn)物進行了大量的研究，深入了解了金耳多糖的化學組分與功效[2]。近年來，液體深層發(fā)酵技術(shù)在金耳多糖的提取上有了眾多成功的應用[3]。但發(fā)酵過程異常復雜，依靠現(xiàn)有技術(shù)難以充分保障發(fā)酵過程安全。尾氣作為菌體代謝產(chǎn)物，可以全面表征微生物在發(fā)酵罐內(nèi)的生理狀態(tài)變化，選擇合適的技術(shù)手段監(jiān)測尾氣變化就具有十分重要的意義。

電子鼻是近些年發(fā)展起來的一種仿生嗅覺技術(shù)，與傳統(tǒng)的分析檢測儀器不同，其檢測結(jié)果為揮發(fā)性組分的整體信息[4]，需要對原始數(shù)據(jù)進行進一步的數(shù)據(jù)處理，通過各種化學計量學方法進行模式識別分析。近年來，研究人員將電子鼻應用于發(fā)酵監(jiān)控領(lǐng)域，NABARUM[5]等利用電子鼻技術(shù)在線監(jiān)控黑茶發(fā)酵確定了黑茶發(fā)酵的最佳時間，江輝[6]等人采用電子鼻技術(shù)較好識別了固態(tài)發(fā)酵的不同狀態(tài)。目前國內(nèi)外利用電子鼻監(jiān)控液體發(fā)酵過程的文獻較為少見，因此電子鼻技術(shù)應用于液體發(fā)酵過程監(jiān)測具有重要的理論和應用意義。本研究利用自行搭建的電子鼻系統(tǒng)監(jiān)測金耳發(fā)酵過程尾氣的變化，嘗試探索針對金耳發(fā)酵在線監(jiān)測的新技術(shù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

菌種：金耳(Tremellaaurantialba)，由江蘇大學應用微生物研究所提供；斜面培養(yǎng)基：PDA固體培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基：PDA液體培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖720 g,玉米粉270 g,麩皮360 g，蛋白胨72 g，KH2PO420 g，MgSO412 g，豆油70 mL。2 L雙閥鋁箔氣體采樣袋，大連德霖氣體包裝有限公司。

1.2儀器與設備

電子鼻系統(tǒng)，由江蘇大學食品/農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)無損檢測技術(shù)研究中心自主研制。20 L自動機械攪拌發(fā)酵系統(tǒng)，鎮(zhèn)江格瑞生物工程有限公司；發(fā)酵控制參數(shù)：裝液量70%，攪拌速度90 r/min, 罐壓0.05 MPa，罐內(nèi)溫度28 ℃。

1.3樣本處理

金耳接種培養(yǎng)后，每隔24 h采集尾氣樣本10個，同時提取適當發(fā)酵液用于分析菌體干重。整個金耳發(fā)酵階段共取尾氣樣本70個。共進行2個批次的金耳發(fā)酵試驗，第2批次樣本用于模型驗證。

1.4測定指標及方法

1.4.1菌體干重(dry cell weight,DCW)

取出發(fā)酵液后適當靜置，用40目不銹鋼濾網(wǎng)過濾金耳發(fā)酵液，去除發(fā)酵液中的麩皮。然后使用高速冷凍離心機9 000 r/min離心10 min,蒸餾水洗滌2次，收集沉淀物，60 ℃烘干至恒重即為菌體干重。

1.4.2電子鼻檢測

電子鼻的工作流程為：抽氣泵先將尾氣吸入傳感器陣列反應室，然后由數(shù)據(jù)采集模塊得到傳感器陣列的響應數(shù)據(jù)，最后通過模式識別算法得到分析結(jié)果。電子鼻系統(tǒng)檢測尾氣樣本的具體參數(shù)設置如下。

表1　電子鼻檢測參數(shù)

1.5數(shù)據(jù)處理

提取電子鼻響應的穩(wěn)定值作為特征數(shù)據(jù)。主要分析方法：主成分分析(principal component analysis，PCA)、K鄰分類算法(K-nearest neighbors，KNN)[7]、模糊C均值聚類方法(fuzzy c-means，F(xiàn)CM)[8]。本研究數(shù)據(jù)分析在Matlab 2012a(Mathworks，USA)平臺上完成。

2結(jié)果與分析

2.1電子鼻傳感器優(yōu)選

2.1.1傳感器初選

已有科研人員分析了金耳發(fā)酵液揮發(fā)性組分[9]，其中主要包括醇類、烴類、酯類和倍半萜類芳香化合物。日本費加羅公司生產(chǎn)的TGS系列傳感器性能較為穩(wěn)定，壽命長，具有極高的靈敏性，對多種氣體組分具有一定的廣譜響應特性。初步篩選12根TGS系列的氣敏傳感器用于金耳發(fā)酵尾氣監(jiān)控，型號分別為TGS825、TGS832、TGS831、TGS822、TGS813、TGS816、TGS880、TGS826、TGS2610、TGS2611、TGS2600、TGS2620。然而由于氣體組分十分復雜，傳感器響應信息中包含大量冗余，因而需要進一步優(yōu)選傳感器。

2.1.2相對變化值分析

計算12根傳感器在整個發(fā)酵階段響應的相對變化均值，傳感器TGS831的相對變化值均值小于100，可認為該傳感器對發(fā)酵階段尾氣不敏感，故剔除此傳感器。

2.1.3相關(guān)性分析和變異系數(shù)分析

相關(guān)性分析用來表征不同傳感器的相關(guān)程度，若兩個傳感器之間相關(guān)性分析結(jié)果較大，則說明傳感器響應存在重復，進而可以選擇合適的參數(shù)比較方法去除一個傳感器消除部分冗余信息，簡化氣敏傳感器陣列的構(gòu)成。變異系數(shù)(Coefficient of Variation,CV)反映了傳感器的穩(wěn)定性，變異系數(shù)值越大，說明傳感器檢測結(jié)果的離散程度越大，其可靠性越差，予以剔除。

表2　傳感器響應相對變化均值

通過對余下的11根傳感器進行相關(guān)性分析，在置信度為95%的基礎上，傳感器TGS832、TGS822、TGS813任意兩根傳感器之間的相關(guān)性在0.95以上，TGS816、TGS880、TGS2600任意兩根傳感器之間的相關(guān)性也在0.95以上，可以認為以上兩組傳感器分別對尾氣具有相似的敏感性。然后，分別對以上兩組相關(guān)性較強的傳感器進行變異系數(shù)分析， TGS832和TGS2600的變異系數(shù)明顯低于其他傳感器，詳見表3，可以認為這兩根傳感器相較其他幾根具有更好的穩(wěn)定性。

表3　傳感器變異系數(shù)分析

綜合以上傳感器優(yōu)選方法，選出如下7根氣敏傳感器構(gòu)成電子鼻傳感器陣列，分別為：TGS825、TGS832、TGS826、TGS2610、TGS2611、TGS2600、TGS2620。

2.2菌體干重變化分析

菌體干重常用于衡量發(fā)酵液中的生物量，該指標和菌體生長有重要關(guān)系。由圖1知，可根據(jù)菌體生長情況將金耳液體發(fā)酵分為3個階段，第1天為第1階段，發(fā)酵液中菌體質(zhì)量增加并不明顯。第2～4天為對數(shù)生長期，菌體質(zhì)量呈指數(shù)增加。從第5天開始，金耳菌絲體質(zhì)量趨于穩(wěn)定，這是由于菌體的繁殖數(shù)量和死亡數(shù)量大致平衡。一般選擇穩(wěn)定期為收獲期，故而選擇在第7天下罐結(jié)束發(fā)酵。

圖1　菌體干重變化Fig.1　The change of DCW

2.3電子鼻檢測

2.3.1主成分分析

前3個主成分的累計貢獻率達到94.66%，代表了大部分的電子鼻特征信息。圖2 為前3個主成分的得分圖，表現(xiàn)為樣本點在三維平面上的投影。第1天的尾氣樣本較為分散，因為接種后的第1天金耳菌絲體未完全適應新環(huán)境，生長緩慢，尾氣中也無明顯芳香氣味。第2～4天的樣本聚類趨勢明顯，這一階段中金耳菌體生長速度明顯加快，相互纏繞形成球狀菌團，且隨著發(fā)酵進程推進菌團體積逐漸增大，發(fā)酵液顏色不斷加深，尾氣中的芳香氣味也越來越濃郁。第5～7天的樣本在圖中位置較為接近，這是因為當發(fā)酵進行到第5天時，金耳菌絲體生長速度放緩，球狀菌團的體積無顯著變化，尾氣中揮發(fā)性組分相對恒定，其濃郁程度已接近最高。第6、第7兩天的樣本重疊現(xiàn)象嚴重，這是因為到了最后兩天菌體生長增殖趨于停滯，其代謝產(chǎn)物相對恒定。通過主成分分析，了解了金耳發(fā)酵不同發(fā)酵階段尾氣成分的變化特征，可以明顯的將金耳生長分為3個階段，該結(jié)果不僅與菌體量變化趨勢相吻合，也符合人工生產(chǎn)經(jīng)驗。

圖2　主成分分析Fig.2　Principal component analysis

2.3.2FCM分析

對所有的尾氣樣本進行標號，例如第1天的第1個樣本記為1-1，依次類推。FCM分析時，設置冪指數(shù)為3，最大迭代次數(shù)為200，目標函數(shù)的終止容限為1×10-6。結(jié)果如表4所示，F(xiàn)CM算法共將金耳發(fā)酵分為3個階段，接種的第1天為第1階段，第2～4天為第2階段，第5～7天為第3階段。該分類結(jié)果與PCA分類結(jié)果一致。

表4　FCM分類結(jié)果

2.3.3KNN分析

在主成分分析的基礎上，利用KNN進行分析。首先將尾氣樣本分為7類，同一天的樣本作為一類，隨機選擇49個樣本作為訓練集的樣本，余下的21個為測試集的樣本。KNN模型的輸入量為主成分得分，輸出量為不同發(fā)酵階段。不同的k值和不同的主成分數(shù)會對模型的識別結(jié)果造成較大影響，需要對其進行優(yōu)化，利用模型預測結(jié)果的識別率來衡量模型的性能。當K=5，主成分數(shù)為7時，模型達到最優(yōu)，圖3表明此時預測集識別準確率達到94.95%。如果將樣本分為3類，即對應金耳發(fā)酵的3個階段，當K=2，主成分數(shù)為3時，模型最優(yōu)，該模型的識別準確率達到100%，詳見圖4。

圖3　分為7類的預測結(jié)果Fig.3　The prediction result of seven categories

圖4　分為3類的預測結(jié)果Fig.4　The prediction result of three categories

第1批金耳發(fā)酵試驗結(jié)束后，進行了第2批次的金耳發(fā)酵試驗，條件與第1批次保持一致。利用基于第1批數(shù)據(jù)建立的預測模型對第2批次發(fā)酵進行預測分析。與第1批次相同，也按2種方法對發(fā)酵階段進行分類，第1種是將發(fā)酵的每一天當成1個階段，共分為7個階段，第2種分類方法是將金耳發(fā)酵階段分為第1天、第2～4天和第5～7天共3個階段。表5表明，當分為3個階段時，識別準確率達到80%。當分為7個階段時，其識別準確率較低為64.29%，由于發(fā)酵過程的復雜性，該識別結(jié)果亦可以接受。

表5　第2批發(fā)酵預測結(jié)果

3結(jié)論

本研究利用電子鼻監(jiān)控了金耳發(fā)酵過程尾氣變化。首先優(yōu)選出7根對金耳發(fā)酵液揮發(fā)性組分較為敏感的TGS系列傳感器。采用PCA、KNN和FCM等模式識別算法分析電子鼻數(shù)據(jù)，通過PCA和FCM可以準確區(qū)分金耳菌絲體的3個生長代謝階段。在預測集中，KNN對不同發(fā)酵階段達到較高的識別準確率。在驗證集中，當發(fā)酵分為3個階段時，模型達到了80%的識別準確率，當模型分為7個階段時，識別準確率略低。電子鼻技術(shù)在識別金耳深層發(fā)酵過程狀態(tài)方面取得了較為理想的結(jié)果，結(jié)果表明，該技術(shù)在發(fā)酵過程監(jiān)測方面擁有一定的應用前景。本研究為以后研發(fā)專用于金耳發(fā)酵過程監(jiān)測的便攜式電子鼻系統(tǒng)奠定了基礎。

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Monitoring ofTremellaaurantialbasubmerged fermentation using electronic nose

HUANG Xing-yi，CHEN Mao-qing，ZHANG Zhi-cai，WANG Shun，PAN Si-hui

(School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Jiangsu Zhenjiang 212013，China)

ABSTRACTElectronic nose was used for monitoring the off-gas change of Tremella aurantialba broth to monitor the fermentation. And seven TGS gas sensors for volatile components were selected. The data was analyzed by principal component analysis(PCA)，fuzzy c-means method(FCM) and K-nearest neighbors analysis(KNN). The three stages of the growth of the Tremella aurantialba fermentation could be accurately distinguished by PCA and FCM. Good recognition results had been achieved in the prediction and validation set using KNN algorithm. The experimental results showed that the electronic nose system could effectively monitor the state of the liquid fermentation process.

Key wordse-nose; Tremella aurantialba; monitoring of fermentation; off-gas

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606018

基金項目：公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201003008)；國家自然科學基金項目(31071549)；江蘇省高校優(yōu)勢學科建設工程項目資助。

收稿日期：2015-10-28，改回日期：2016-02-19

第一作者：教授(本文通訊作者，E-mail：h_xingyi@163.com)。