慢性應激大鼠海馬DG區牛磺酸在空間學習記憶過程中的變化

張兆一，任美玲，楊　朋，李　靜，吳建龍，陳靜伊，金清華*

(延邊大學醫學院 1.2012級臨床醫學專業;2.2012級麻醉學專業;3.生理學與病理生理學教研室;4.2013級麻醉學專業，吉林 延吉133002)

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慢性應激大鼠海馬DG區牛磺酸在空間學習記憶過程中的變化

張兆一1，任美玲2，楊朋2，李靜2，吳建龍3，陳靜伊4，金清華3*

(延邊大學醫學院 1.2012級臨床醫學專業;2.2012級麻醉學專業;3.生理學與病理生理學教研室;4.2013級麻醉學專業，吉林 延吉133002)

摘要：目的觀察海馬齒狀回(Dentate Gyrus,DG)區的牛磺酸(Taurine，Tau)在慢性應激模型大鼠空間學習記憶過程中的變化，初步探討慢性應激影響大鼠空間學習記憶能力的部分機制。方法SD雄性大鼠16只，隨機分為對照組和慢性應激組。以多種刺激隨機應用的方法制備慢性應激大鼠模型，并利用腦部微量透析法和HPLC法實時觀察慢性應激大鼠海馬DG區細胞外液中Tau的含量。其次，利用Morris水迷宮(Morris Water Maze，MWM)觀察大鼠的空間學習記憶能力，并觀察海馬DG區Tau含量在MWM訓練過程中的變化。結果1)慢性應激組大鼠海馬DG區細胞外液中的Tau含量明顯高于對照組(P<0.05)。2)MWM的定位航行實驗中，兩組大鼠的逃避潛伏期均隨著訓練次數的增加而減少，而慢性應激組大鼠訓練第4天的逃避潛伏期明顯小于對照組(P<0.05)；MWM的空間探索實驗中，慢性應激組的穿越原站臺區次數顯著多于對照組(P<0.05)。3)MWM訓練過程中，慢性應激組大鼠海馬DG區的Tau含量出現明顯的增加(P<0.05)，而對照組大鼠海馬DG區的Tau含量未出現明顯變化(P>0.05)，兩組間有顯著性差異(P<0.05)。結論慢性應激可以提高大鼠的空間學習記憶能力，這可能與海馬DG區的Tau含量增加有關。

關鍵詞：慢性應激；海馬齒狀回；牛磺酸；空間學習和記憶；大鼠

(ChinJLabDiagn,2016,20:0871)

應激是機體對有害或有潛在威脅的體內外刺激所做出的非特異性防御反應，它在整體功能全面動員的基礎上提高機體對有害刺激的耐受能力，減輕各種不良反應[1]。雖然應激對維持機體生命活動具有極其重要的意義，但持續而嚴重的應激會對機體產生負面影響，成為許多疾病的重要病因和誘因[1]，因此，關于應激對各種生理功能的作用及其機制的研究得到學術界普遍的關注。眾所周知，學習記憶是機體改變自身行為或產生新行為以適應環境的必要過程，而海馬在學習記憶，尤其在空間學習和記憶中扮演著重要的角色[2]。日常生活中人們所處的應激多數為慢性應激 (chronic stress,CS)，在CS的情況下，機體將加大對糖皮質激素的釋放，而海馬是血漿糖皮質激素作用的主要靶區[3]，研究報道，CS可導致海馬神經元樹突形態學的改變和抑制神經元的發生，進而影響海馬依賴性的學習和記憶功能[4]。

哺乳動物的海馬一般可分為CA1、CA3和齒狀回(dentate gyrus,DG)等，這3個亞區在學習記憶過程中各自起不同作用，其中DG區是新信息進入海馬的傳入點，它把進來的信息進行編碼和加工，對學習記憶至關重要[2]。本課題組先前的研究表明，海馬DG區的天冬氨酸、谷氨酸(glutamate,Glu)和牛磺酸(taurine，Tau)在主動回避學習過程中明顯增加[5]，而且黃芪改善大鼠學習記憶能力可能與DG區Tau增加相關[6]。Tau分布在大腦皮質、海馬、小腦等腦區，可作為神經遞質或調質起作用。雖然已有研究報道，CS可通過影響DG區神經再生而改變海馬依賴性學習記憶功能[4]，但關于CS對海馬DG區Tau的含量是否有影響未見報道。因此，本實驗利用Morris水迷宮(Morris water maze，MWM)觀察CS大鼠空間學習記憶能力的過程中，利用腦部微量透析和HPLC法觀察了DG區的Tau含量的變化。

1材料與方法

1.1實驗動物和慢性應激模型的制備

16只健康雄性SD大鼠(體重為200±20 g)由延邊大學醫學部實驗動物科提供)隨機分成兩個組，即對照組和CS組，每組各8只，均單籠飼養。應激刺激選用束縛2 h、夾尾1 min、冰水浴5 min、潮濕墊料24 h、噪音和足底電刺激。將上述6種刺激隨機安排，每日1 種刺激，同種刺激不連續出現，共刺激30 d，使動物無法預料刺激。對照組大鼠自由飲食、攝水，整個實驗過程中不接受任何刺激。

1.2海馬DG區細胞外液中的Tau含量的測定

CS模型制備成功后第2天，大鼠進行腹腔麻醉(10%的水合氯醛，300 mg/kg)后固定于腦立體腦定位儀上，參考Paxinos和Watson大鼠腦圖譜，將透析用外套管插入到DG上方1 mm處(定位坐標為前囟后3.4 mm ,正中線左2.2 mm,深 2.5 mm),并用牙托水泥固定于顱骨表面。術后第二天，在動物清醒狀態下，通過透析用外套管將微量透析探針插入到DG區并固定在外套管上，探針超出外套管1.5 mm，其前端乙酸纖維素半透膜(DM-22，Eicom,日本)，可濾過分子量小于5×104的物質。微量透析探針和微量泵(ESP-64，日本Eicom公司)連接，灌流改良Ringer’s液(147 mM NaCl，4 mM KCl，2.3 mM CaCl2，pH 6.5)，流速為1.5 μl/min,穩定30 min后,用自動收集器收集微量透析樣本,每管收集10 min,每次收集3個管,將其放入-80℃冰箱，以備測定Tau濃度。大鼠回籠飼養24 h后開始進行MWM訓練，每天訓練后，經透析探針收集海馬DG區微量透析樣本。

取12 μl的解凍后的樣本，加入3 μl的OPA溶液(4 mM)，在室溫下反應2.5 min,然后抽取10 μl反應液注入到生物活性物質微量分析系統 (HTEC-300，日本Eicom公司),通過其高效液相色譜分離柱和電化學檢測器分析出Tau的含量。

1.3MWM實驗

應用MWM進行空間學習和記憶能力的檢測，包括定位航行和空間探索實驗。定位航行實驗時，水面高約45 cm，室溫及水溫均保持在22±2℃，站臺(直徑10 cm)任意放置于某一象限的中心位置并淹沒于水面下約2 cm處；每只大鼠按東西南北4個入水點分別放入水池，每次游泳時限為120 s，若在120 s內大鼠找到并爬上站臺，需讓其在站臺上站立5 s，若120 s以內未找到站臺，需由測試者引領其找到并爬上站臺，此時的潛伏期記錄為120 s；每天訓練1次，連續4 d。空間探索實驗在MWM訓練開始第5 d進行，除了撤去站臺，其他條件不變，從同一個入水點將實驗動物放入水中，測量它在120 s內穿越原站臺區的次數。

1.4組織學鑒定

所有實驗結束后，動物過量麻醉處死，取腦固定于10%的福爾馬林溶液中，進行冠狀面的冰凍切片(厚度約60 μm)、中性紅染色，光學顯微鏡下確定透析探針的位置是否在海馬DG區，透析探針沒有進入DG區者不計入統計。

1.5統計學處理

2結果

2.1CS對大鼠海馬DG區Tau含量的影響

CS組進行慢性應激刺激30 d后，每只大鼠收集三個管的海馬DG區微量透析樣本，高效液相色譜法測定每個管的Tau的含量，取平均值。結果顯示，CS組海馬DG區細胞外液中的Tau含量為1.39±0.24 μM，與對照組的0.41±0.09 μM相比，顯著增加(P<0.05，圖1)。

*P<0.05，與對照組相比。

2.2CS對大鼠的空間學習記憶能力的影響

兩組大鼠在為期4 d的水迷宮定位航行訓練中，隨訓練次數的增加，其逃避潛伏期均有不同程度的縮短：對照組大鼠訓練第3和第4 d的逃避潛伏期分別為30.95±6.96 s、31.15±4.80 s,與第1 d(55.59±5.72 s)相比顯著降低(均為P<0.05，圖2)；CS組大鼠第3、第4 d的逃避潛伏期分別為20.22±4.70 s和17.14±2.84 s，與第1 d(44.97±8.29 s)相比顯著降低(均為P<0.05，圖2)。CS組大鼠第4 d的逃避潛伏期明顯短于對照組(P<0.05，圖2)，提示CS可促進大鼠的空間學習功能。

訓練第5 d移除站臺，進行空間探索實驗，結果顯示，慢性應激組120 s內穿越原平臺區次數為11.00±5.36次，與對照組的5.17±1.94次相比，明顯增加(P<0.05，圖3)，提示CS可以提高大鼠的空間記憶能力。

2.3海馬DG區Tau含量在大鼠空間學習記憶過程中的變化

為了探討CS是否通過影響海馬DG內的Tau含量來調節大鼠的空間學習記憶能力，本實驗還觀察了MWM訓練過程中的DG區Tau含量的變化。在 MWM訓練過程中，CS組大鼠海馬DG區的Tau含量逐漸增加，訓練第3 d和訓練開始前相比有顯著性差異(P<0.05)，其后逐漸回降，與之相比，對照組大鼠海馬DG的Tau含量在訓練過程中未出現明顯變化(均為P>0.05)，兩組間有顯著性差異(P<0.05)(圖4)。

#P<0.05，與第一天相比；*P<0.05，與對照組相比。

*P<0.05，與對照組相比。

以訓練前的Tau含量作為100%，計算出每天訓練后的Tau含量百分比。#P<0.05，與訓練前相比；*P<0.05，與對照組相比。

圖4海馬DG區Tau含量在MWM訓練過程中的變化

3討論

應激是生活中不可避免的事件，人們為了適應日益強烈的競爭，需要承受來自不同方面的種種壓力，常常處于應激，尤其是慢性應激(CS)狀態，而由它引起的問題也隨之而來。輕度的刺激多數情況下會提高個體的學習記憶能力，如果是刺激頻率大、刺激時間延長或者刺激程度加強的CS則多會引發生理功能的異常。制備CS模型大鼠時用的刺激方法種類較多，常見的有：光照刺激、晝夜交替、無墊料或潮濕墊料、鼠籠震蕩、鼠籠傾斜、冷熱刺激、束縛刺激、電刺激、噪聲刺激、禁食水等，根據CS相關文獻[7]，以及本實驗室的條件，我們選擇束縛、夾尾、冰水浴、足底電擊、噪音、潮濕墊料等六種刺激，每天隨機給予一種刺激，共30 d，制備了慢性不可預見性應激模型，并利用MWM觀察了這種CS對大鼠空間學習記憶能力的影響。本實驗中CS組大鼠找到隱藏站臺的逃避潛伏期明顯縮短，而且撤去站臺后120 s內穿越原站臺區的次數顯著增加，我們的實驗結果提示CS可以提高大鼠的空間學習和記憶的能力。

學習和記憶是多種腦高級功能的基礎，而海馬在哺乳類動物學習和記憶的形成中扮演主要角色。文獻報道，海馬內的氨基酸類物質，如Glu、γ-氨基丁酸、甘氨酸、Tau等，參與海馬的學習記憶功能的調節中[8]。如在前言所述，海馬DG區在新信息的處理和編碼中起關鍵作用[2]，而本課題組先前的研究證明，在大鼠的主動回避條反射過程中伴有DG內氨基酸類物質的增加[5]，且黃芪改善大鼠學習記憶能力可能與DG區Tau增加相關[6]。為探討CS的改善空間學習記憶的作用是否與海馬內的Tau有關，本實驗利用腦部微量透析法和高效液相色譜法測定了海馬DG區細胞外液中的Tau的含量。結果發現，CS可明顯增加大鼠海馬DG區Tau基礎含量，同時也增強Tau在空間學習記憶過程中的反應。研究表明，Tau不僅促進學習記憶功能和神經系統的生長發育，而且還可通過抑制Glu活性來減輕腦缺血時的Glu的神經毒性作用[9,10]。另外，Tau對學習記憶的促進作用可能還與增加海馬內Fos蛋白、β-內啡肽，加壓素的含量有關[11，12]。因此，我們推測CS促進大鼠的空間學習記憶功能，可能與海馬DG區Tau含量增加有關，但其具體的下游機制有待于進一步探究。

參考文獻：

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基金項目：國家自然科學基金(31560278)；延邊大學本科生科研項目(ydbksky201577)

*通訊作者

文章編號：1007-4287(2016)06-0871-04

中圖分類號：Q427

文獻標識碼：A

作者簡介：張兆一(1993-)，男，臨床醫學專業學生，研究方向為神經生理學。

(收稿日期：2016-01-15)

Change of taurine in hippocampal dentate gyrus during spatiallearning and memory in a rat model of chronic stress

ZHANGZhao-yi1,RENMei-ling2,YANGPeng2,etal.

(1.Grade2012StudentsMajorinClinicalMedicine;2.Grade2012StudentsMajorinAnaesthesia;3.DepartmentofPhysiologyandPathophysiology;4.Grade2013StudentsMajorinAnaesthesia,YanbianUniversityCollegeofMedicine,Yanji133002,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the changes of extracellular level of taurine (Tau) in the hippocampal dentate gyrus (DG) in a rat model of chronic stress during Morris water maze (MWM) test,and primarily investigate the neurochemical mechanism responsible for effect of chronic stress on spatial learning and memory.MethodsTotally 16 SD rats were randomly divided into two groups,control group and chronic stress (CS) group.The rat model of CS was prepared by random application of varied stressors,and then the extracellular concentration of Tau in the DG was determined by in vivo microdialysis and HPLC.Next,the spatial learning and memory abilities of rats were assessed by Morris water maze (MWM),and the extracellular concentration of Tau in the DG was simultaneously observed.Results1) Compared with the control group,the extracellular concentration of Tau in hippocampal DG was significantly increased in CS group (P<0.05).2) In the place navigation trial of MWM test,the escape latency decreased in both control and CS groups over the course of the training days,however,on the 4th day,escape latency was significantly shorter in CS group compared with control group (P<0.05); in the spatial prove trial of MWM test,the number of platform crossings was markedly increased in CS group compared with control group(P<0.05).3) During MWM test,Tau level in the DG was significantly increased in CS group (P<0.05),while it was not changed in control group(P>0.05).ConclusionChronic stress facilitates the spatial learning and memory in rats,which may be related to the increase of Tau in hippocampal DG region.

Key words:chronic stress; dentate gyrus;taurine;spatial learning and memory;rats