富血小板血漿制備方法穩定性的研究

潘紅娟，王雅麗，呂　爽，劉鐵梅

(吉林大學中日聯誼醫院 輸血科，吉林 長春130033)

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富血小板血漿制備方法穩定性的研究

潘紅娟，王雅麗，呂爽，劉鐵梅*

(吉林大學中日聯誼醫院 輸血科，吉林 長春130033)

富血小板血漿(platelet rich plasma，PRP)含有超過生理濃度數倍的血小板，作為一種自體血來源的產品，因獲取過程創傷較小、制備簡便及具有生物學治療潛能等方面的優點，被廣泛用于組織再生、創面修復、感染治療和功能重建等領域[1，2]。但目前實驗及臨床大都使用自體血液提取生長因子，這無疑會對患者機體形成二次創傷[3]，為了用盡可能少的血液制備出血小板含量較高且能滿足臨床需要量的PRP，本文將對PRP的制備方法提供新的參考。

1材料與方法

1.1實驗標本

取15例健康成年男性自愿者的外周血各40 ml，年齡 18-50歲，平均34歲。其納入標準為 ：①血紅蛋白>120 g/L，血小板>100×109/L。②采血前5 d 內未服用影響血小板功能和凝血系統的藥物。③無傳染性疾病、相關血液疾病、嚴重心血管疾病及感染等。所有自愿者知情并同意采血用于本實驗。

1.2主要試劑與儀器

一次性采血袋(天津金耀氨基酸有限公司)，50 ml無菌離心管(Thermo scientific公司)，20 ml一次性注射器(山東新華安得醫療用品有限公司)，9#腰椎穿刺針(蘇州偉康醫療器械有限公司)，一次性塑料管(江蘇康健醫療用品有限公司)；TDZ5-WS 臺式低俗離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司)，蘇凈安泰超凈工作臺(北京華威興業科技有限公司)，BC-6800 全自動血液分析儀(上海同舸醫療器械有限公司)。

1.3PRP 制備方法

1.3.1制備PRP

將200 ml一次性采血袋中的CPD-A抗凝劑除去22 ml，使其剩余6 ml；用裝有 5 ml抗凝劑的 一次性采血袋于每例志愿者肘前靜脈采血40 ml。搖勻后，取2 ml 抗凝血作全血細胞分析，3 ml用于細菌培養，40 ml 注入 50 ml無菌離心管中，剩余的1 ml血液棄掉，于常溫下制備 PRP。根據血液中各組分的沉降系數不同，以660 g/min 離心10 min 后，全血分為 3 層，上層為上清液，下層為紅細胞，兩層交界處一淺黃色層即 PRP 層。用20 ml 注射器吸取下層紅細胞，約剩余紅細胞層(1±0.3) ml。將剩余血液以相同條件離心后，可見在底部紅細胞表面有白膜樣物質，即為血小板和白細胞沉積層 ；其上部為透明的血漿層。再次以20 ml 注射器吸取上層大部分乏血小板血漿，保留離心管中約 (6±0.2) ml 血漿。靜置15 min后輕搖離心管約 5 min，使血小板充分重懸于剩余血漿中，即得到 PRP。上述除采血外，其他操作均在無菌室及超凈工作臺進行。

1.3.2血細胞分析

分別將2 ml 抗凝靜脈血和制備的 PRP 采用全自動血液分析儀進行血常規分析，測定血小板及白細胞濃度。

1.3.3細菌培養

對3 ml抗凝血及制備的PRP進行細菌培養，一周后記錄結果，整個過程均在無菌條件下進行。

1.4統計學方法

采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，對全血和 PRP 中血小板及白細胞濃度比較采用配對t檢驗，并對全血和 PRP 中血小板及白細胞濃度、PRP 中血小板和白細胞的回收率及富集系數采用 Pearson 檢驗進行相關分析。

2結果

2.1血細胞分析

經對全血及PRP中的血小板、白細胞的測定結果如圖1、圖2所示：由圖可以看出PRP中血小板及白細胞與全血中血小板及白細胞呈正相關趨勢，分析相關系數血小板計數r=0.938(P<0.01)，白細胞計數r=0.884(P<0.01)均呈顯著的正相關。

圖1　全血及PRP中的血小板計數

圖2　全血及PRP中的白細胞計數

經計算得，全血和PRP中血小板濃度分別為(183.97±33.48)×109/L及(1009.91±219.43)×109/L，比較差異有統計學意義(t=16.981，P<0.01)。全 血和 PRP 中 白 細 胞 濃 度 分 別 為(6.22±1.48)×109/L和(19.31±7.40)×109/L，比較差異有統計學意義(t=8.272，P<0.01)。PRP 中血小板和白細胞濃度的變異系數分別為 21.73% 和38.32%(表1)。

表1　全血和PRP中血小板及白細胞計數的比較

計算 PRP 中血小板、白細胞的回收率和富集系數，富集系數=PRP 中血小板或白細胞濃度/全血中血小板或白細胞濃度，回收率 =PRP 中血小板或白細胞總數/全血中血小板或白細胞總數×100%。計算得PRP中血小板的富集系數為5.46±0.45，回收率為84.37±4.32；白細胞的富集系數為3.02±0.71，回收率為46.90±11.37。并且PRP 中白細胞的回收率和富集系數間顯著相關(r=0.947，P<0.01)，而PRP中血小板的回收率和富集系數間相關性較差(r=0.502，P>0.05)，見表2。

表2　PRP中血小板和白細胞富集系數及回收率的比較

2.2全血和PRP的細菌培養結果

細菌培養1周，所用培養結果均為陰性。

3討論

自上世紀90年代富血小板血漿技術問世以來，富血小板血漿逐漸成為組織工程領域尤其是骨創傷缺損修復方面的研究熱點[4]，并在臨床中的應用越來越廣泛，同時也出現了多種富血小板血漿的制備方法。經典的制備方法有(1)Anitua[5]法 ：160 g離心6 min一次離心法，(2)Landersberg[6]法： 兩次均為200 g離心10 min的二次離心法；(3)Aghaloo[7]法：分兩次離心，第一次215 g離心10 min，第2次863 g離心10 min等；李明等[8]指出當離心血量較大時，這些方法制備的PRP的血小板濃度并不理想，較大的血量需要較大的離心管直徑及較高的離心力。對于PRP中血小板的有效濃度，Giusti等[9]發現人肌腱細胞培養中血小板濃度在(500-1000)×109/L之間刺激細胞的增殖、遷移及膠原合成的作用最為顯著，當血小板濃度為2 000×109/L和3 000×109/L時，PRP的促細胞增殖作用明顯減弱。同樣Graziani等[10]體外研究發現，PRP制劑對成纖維細胞和成骨細胞的促增殖作用具有劑量依賴性；當血小板計數為(800-1000)×109/L之間時能夠達到更好的促增殖作用。本實驗采血量為40 ml，加入6 ml抗凝劑，其抗凝劑與全血的比例為1∶6.7，其血液被稀釋而使全血及PRP中血小板、白細胞計數均偏低。本實驗中血小板的富集系數與回收率的相關系數r=0.502，并不顯著性相關(P>0.05)，可能是由于制備的PRP較多(1∶6.7)導致PRP的富集系數相對較低而回收率較高造成的。但PRP中血小板濃度(1009.91±219.43)×109/L、富集系數(5.46±0.45)及PRP的量尚可滿足臨床需要。此實驗采用二次離心法，兩次均為660 g離心10 min，避免了離心力過大離心時間過長導致血小板活化及生長因子的過早釋放。

白細胞中含有中性粒細胞，單核細胞和淋巴細胞，在機體的宿主防御中發揮著重要作用。中性粒細胞被病原體，毒素等激活后，生成具有高度殺菌活性的次氯酸和其它的活性氧衍生物，及其胞內的多種水解酶對病原體或異物具有消化作用；并且單核細胞的吞噬作用及淋巴細胞的免疫功能均對機體具有保護作用[11]。目前對于PRP中白細胞的含量及有無并沒有明確的要求。Wasterlain等[12]表示理想的骨科PRP制備應該有高比率的血小板和白細胞，從而合成代謝大于分解代謝，以利于骨折的愈合。但也有報道稱富白細胞PRP用于治療跟腱炎可能會增加患者的局部疼痛[13]。本實驗PRP中白細胞的濃度為(19.31±7.40)×109/L，富集系數為3.02±0.71，其在各種臨床疾病中的作用還有待進一步的試驗與研究。

本實驗的優缺點分析(1)第1次離心后采用去除紅細胞，第2次離心后去除上層的P-PRP的方法，減少了多次抽吸血小板及轉移試管對血小板的刺激，從理論上降低了血小板的活化；(2)由于不同疾病、不同性別患者的紅細胞壓積的不同，第1次離心后去除紅細胞的體積并不相同，本實驗用20 ml的離心管吸取紅細胞，最終使管底剩余約(1±0.3)ml的紅細胞，保證了每次制備的PRP中血小板的數量及PRP的有效體積，并減少沉降在紅細胞層的血小板的丟失，但同時使PRP中紅細胞的量增加。(3)本實驗為了盡可能的減少對患者的二次傷害，全血中加入抗凝劑的體積相對較大且制備的PRP的量也較大，這使得全血及PRP中血小板及白細胞的濃度均偏低。

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[13]Young A,McNaught CE.The physiology of wound healing[J].Surgery(Oxford),2011,29(10):475.

基金項目：吉林省衛計委項目(20152004)

*通訊作者

文章編號：1007-4287(2016)06-1008-03

作者簡介：劉鐵梅(1965-).女，博士，教授、主任醫師，輸血科主任，主要從事臨床輸血工作。

(收稿日期：2015-06-28)