外周血miR-21檢測在胰腺癌中的意義研究進展

劉書中,李子全,李政垚,王以朋

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院 骨科,北京100730)

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外周血miR-21檢測在胰腺癌中的意義研究進展

劉書中,李子全,李政垚,王以朋*

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院 骨科,北京100730)

胰腺癌(pancreaticcarcinoma，PC)是消化系統中惡性程度最高、預后最差的惡性腫瘤之一，95%的胰腺癌為胰腺導管腺癌(pancreaticductuleadenocarcinoma，PDAC)，其發病率有不斷上升趨勢。PC在腫瘤致死原因中列第四位，是5年生存率最低的惡性腫瘤，而缺乏早期診斷手段、早期易出現遠處轉移和發生化療耐藥是導致胰腺癌高死亡率的主要原因。胰腺癌早期診斷率低，致使95%以上的胰腺癌患者在明確診斷時己進入進展期，約60%患者獲診時已是IV期病例，病死率高達99%。手術是根治胰腺癌的唯一方法，但可施行根治性手術患者僅占15-20%，并且約70%患者在接受手術治療后的6-12個月復發。[1]?；熓且认侔┲饕妮o助治療手段，然而腫瘤細胞對化療藥物產生的耐藥性嚴重地影響了胰腺癌化學治療療效。目前，CA19-9與CEA是最常用的胰腺癌分子診斷標志物，但正常人胰腺、膽管、膽囊、胃、乳腺和子宮內膜等組織發生病變時CA19-9及CEA分泌亦會增加，且易出現假陽性及假陰性，早期診斷胰腺癌的效能則更低。近年來，提高PC高危人群早期篩查確診率、增強癌變組織藥敏性及改善PC患者生存質量已成為PC研究中的熱點及難點。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類在真核生物中發現的長18-25個核苷酸的內源性非編碼小分子單鏈RNA。研究表明miRNA的異常表達與腫瘤的發生、分級分期、耐藥性、預后等密切相關，參與了腫瘤細胞重要的細胞生物學行為的調控,間接地發揮“促癌和抑癌”等功能，miRNAs的深入研究為多種惡性腫瘤的診斷和治療提供了新思路。研究表明外周血miR-21水平與胰腺癌的病情進展密切相關，有望成為胰腺癌診斷及預后判斷的生物學標記物及治療靶標[2]。鑒于miR-21與胰腺癌的相關性逐漸被發現并證實，本文就近年外周血miR-21水平在胰腺癌診療及預后評估領域的研究進展做一綜述。

1miRNA的分子生物學特征

miRNA生成過程中,編碼miRNA的基因首先在細胞核內轉錄,在RNA聚合酶II的作用下轉錄為幾百至幾千堿基的初級產物(pri-miRNA),pri-miRNA在核內核酸內切酶Drosha酶作用下切割成只含60-70堿基的具有莖-環結構的發夾樣前體(pre-miRNA),pre-miRNA被RNAGTP2依賴的轉運體exportins5轉運至胞漿,在IIIDicer酶(雙鏈RNA專一性內切酶)作用下形成具有雙鏈結構的miRNA,在酶的作用下裂解成22個核苷酸的成熟miRNA與互補鏈miRNA*。而miRNA*立即被降解。

miRNA的主要分子生物學特征包括:(1)通常長度為18-25nt,3’端可以有2-3個nt的變化,長度不定。(2)廣泛存在于真核生物中,不具有開放閱讀框架(ORF,openreadframe),不編碼蛋白質。(3)成熟后的miRNA5’端為磷酸基團,3’端是羥基基團,這一特點可以使miRNA與功能性RNA降解生成片段相區分，miRNA通過與靶基因mRNA3’-UTR完全或不完全的互補配對結合,致使靶mRNA降解或翻譯抑制進而調控靶基因的表達,從而影響細胞增殖、侵襲、分化和凋亡等多種生物學行為。(4)miRNA在多種種屬中的表達具有保守性。(5)miRNA的表達具有時序性和組織特異性。miRNA的保守性、時序表達特異性和組織表達特異性提示其在生命活動的微觀層面發揮重要作用[3]。

miRNA的功能由RNA所介導的沉默復合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)介導,最終引起蛋白質翻譯受抑或者同源mRNA降解等生物過程，進而發揮抑癌基因或促癌基因的功能[4]。大量研究顯示miRNA可調節人類近60%的蛋白編碼基因,miRNA與靶mRNA并非完全互補配對,平均每個miRNA可以直接調節人類200種不同的mRNA,多個miRNA可以協同調節某些特殊靶基因,多個miRNAs也可能共同調節同一基因靶點,這種協同調節模式形成復雜的調控網絡，因此每一個miRNA的異常表達都有可能導致大量蛋白質的表達異常[5,6]。

2miR-21與胰腺癌的關系

50%以上的miRNAs基因位于染色體脆性位點及染色體擴增、缺失或轉位區域，因而miRNAs表達異常易導致腫瘤性疾病的發生。miR-21編碼基因位于第17號染色體,其成熟序列長度為21bp。miR-21可調控腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移和凋亡等多種生物學行為。研究證實miR-21在胰腺癌、食管癌、肺癌以及結腸癌等惡性腫瘤組織中均出現異常高表達，并發現miR-21在多種惡性腫瘤中通過抑制PTEN(phosphataseandtensinhomolog)、程序性細胞死亡因子4(programmedcelldeath4，PDCD4)、金屬蛋白酶3組織抑制因子(tissueinhibitorofmetalloproteinases-3，TIMP3)、TPM1 (tropomyosin1)和maspin等細胞凋亡相關基因促進腫瘤細胞增殖、浸潤及發生化療耐藥[7]。Moriyama等[8]研究發現miR-21在胰腺癌組織和細胞株中均呈顯著高表達，轉染miR-21前體可以明顯增加胰腺癌細胞的增殖和侵襲能力，而抑制miR-21則明顯抑制其增殖與侵襲，同時發現miR-21與侵襲相關基因MMP-2、MMP-9和VEGF的表達呈正相關，進而增強胰腺癌細胞侵襲能力，并證實miR-21與胰腺癌化療耐藥相關，提示miR-21有望成為耐化療胰腺癌患者新的治療靶點。miR-21通過抑制某些基因的表達、激活蛋白激酶B(proteinkinaseB，PKB)信號通路等方式激活核因子-κB(nuclearfactorkappaB，NF-κB)信號通路，NF-κB通路的激活能上調VEGF蛋白及IL-6等表達，最終增強PC細胞浸潤及轉移能力。Park等[9]研究表明miR-21和miR-221的過度表達增強了胰腺癌細胞的惡性表型，在HS766T細胞系中應用反義寡核苷酸敲除miR-21和miR-221的表達，可使腫瘤細胞在G1期生長受阻，減少細胞增殖，促進細胞凋亡。此外，脂質體轉染上調miR-21表達可使其靶基因Bcl-2表達過量，間接導致caspase-3蛋白活性下降而使細胞凋亡減少，下調miR-21表達則使caspase-3蛋白活性增加而導致離體PC細胞凋亡增多。有研究發現PDAC細胞株(MiaPaCa-2)中let-7和miR-143的缺失以及miR-21高表達會上調Ras及其GTP激酶，從而促進腫瘤增生，而姜黃素類似物CDF可以促進let-7和miR-143重新表達以及miR-21表達下調，從而抑制腫瘤增生，因此，CDF可能成為新的胰腺癌治療藥物[10]。原位雜交顯示miR-21是由病理性導管細胞產生，在胰腺導管腺癌組織中獲得的，胰腺癌細胞系中miR-21的產生受Kras(G21D)和表皮生長因子受體調節，DuRieu等[11]應用Kras(G12D)小鼠模型和實時定量PCR技術研究miRNA在PanIN中的表達情況,研究發現miR-21、miR-205及miR-200與PanIN的發展相關，其中miR-21的相關性最大，而且miR-205和miR-21的表達上調先于表型的改變。miR-21、miR-221、miR-222及let-7a隨著PanIN分級增高而表達上調，其高峰在PanIN2/ 3，此研究提示miR-21具備成為檢測早期胰腺癌分子標志物的潛能。Zhang等[12]利用古抑菌素A(TSA)處理胰腺癌細胞后，觀察到細胞生長停滯在G0/G1 期、細胞凋亡率增加、胰腺癌細胞中miR-21表達下調，該研究表明組蛋白去乙酰化酶抑制劑也可以通過調控miR-21發揮治療胰腺癌的作用。miR-21在胰腺癌中的差異性表達肯定了它在胰腺癌診斷、治療及預后中的重要作用，但是其具體作用機制尚不明確。miR-21可以作用于靶基因，而靶基因又可以調節miR-21的表達，所以miR-21不會是點對點式的在腫瘤的進展中起作用，而是在腫瘤細胞中形成復雜的調控網絡。因此，進一步闡明miR-21在胰腺癌中的作用及機制將為胰腺癌臨床診療提供更優化的措施。

3外周血miR-21檢測在胰腺癌診斷、治療及預后評估中的意義

3.1外周血miRNA的表達及檢測方法

外周血miRNA可能來源于凋亡壞死腫瘤細胞、血細胞、巨噬細胞的裂解等。最新研究顯示血清miRNA可能來自組織細胞的主動分泌過程，成熟的miRNA在細胞內被脂蛋白包被成外切酶體分泌至細胞外，最終到達血液。由于大多數miRNA是由細胞分泌的，組織細胞中miRNA與循環miRNA必然有一定的聯系。研究結果表明miRNA在組織和體液中具有相同的改變趨勢[13]。但胰腺腫瘤組織檢測技術難度高，對機體創傷大，在獲取組織或者細胞的過程中也容易受到周圍組織或細胞的污染，從而降低有效診斷率。實驗表明外周血中RNA在室溫下過夜、反復凍存、解凍、煮沸、過酸或過堿等惡劣情況下可以維持穩定，進一步證實了循環miRNA替代組織活檢而成為新型生化指標的可能。

目前檢測miRNA的方法有克隆測序、Northern印記雜交、原位雜交、基因芯片、實時定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)等[14]。其中應用最廣泛的是qRT-PCR技術，能區分miRNA前體和成熟體，只定量具有生物活性的成熟miRNA，可精確區分同一家族中序列高度同源的miRNA，能檢測只有一個堿基差別的不同miRNAs表達水平，靈敏度和特異度高，樣品消耗量少，只需要l-l0ngRNA即能檢測出低豐度靶miRNA，定量線性范圍寬，有著在臨床檢測領域大規模推廣的潛力。

3.2外周血中miR-21檢測在胰腺癌診斷、治療及預后評估中的價值

Kong[15]和Que等[16]研究證實外周血miR-21可以將胰腺癌患者與健康對照者相鑒別。krha等[17]在對胰腺癌合并糖尿病患者血清腫瘤標志物的研究中發現miR-21可作為胰腺癌診斷的新型生化指標，但對于新發無癥狀的胰腺癌合并糖尿病患者中miR-21對疾病的預后價值尚需進行深入研究。Ali等[18]選取50例胰腺癌患者血漿行miRNA分析，發現miR-21的表達顯著升高，同時還發現化療耐藥的胰腺癌細胞株中，miR-21明顯高表達，與血漿中miR-21結果一致，提示血漿miR-21表達水平可作為腫瘤侵襲的潛在生物指標，有望用于高?；颊叩暮Y查以及胰腺癌化學治療新的靶點。

Hwang[19]和Frampton等[20]研究證實miR-21高表達的胰腺癌患者預后更差，可能與吉西他濱的耐藥性有關，高表達miR-21的患者術后生存率明顯降低。Bhatti[21]和Liu等[22]發現胰腺癌患者血清中miR-21為高表達，并且其水平與疾病分期有關，可有效區分胰腺癌的不同階段，并且具有較高的靈敏性和特異性。Abue等[23]應用定量RT-PCR方法檢測32例PDAC患者、12例胰腺導管內乳頭狀黏液瘤(intraductalpapillarymucinousneoplasm,IPMN)患者及30位健康對照者血漿樣本中miR-21和miR-483-3p表達水平。結果顯示PDAC患者血漿中miR-21和miR-483-3p水平相對健康對照組顯著升高(P<0.01)。血漿miR-21水平與PDAC患者疾病分期(P<0.05)、肝臟及淋巴結轉移(P<0.01)和短生存期(P<0.01)密切相關，因而血漿miR-21水平具有預測PDAC預后的潛能。Ren等[24]在對1例胰腺癌肝臟及胸腔轉移合并胸腔積液的診治中，檢測患者血漿miR-21水平為正常人群的8.3倍，并認為胰腺癌患者血漿miR-21水平升高是提示肝臟轉移的有效預測指標，聯合檢測血漿miR-21水平和CA19-9對診斷胰腺癌具有重要臨床價值。

3.3外周血中miR-21與胰腺癌化學治療藥物敏感性/耐藥性評估

目前，已研發的腫瘤化療藥物在肺癌、乳腺癌、胃癌等實體腫瘤的臨床研究中顯示出明確的療效，而對胰腺癌患者療效卻受到限制，這與胰腺癌細胞對相關化學治療藥物耐藥性增強密不可分。因此，明確胰腺癌化療耐藥機制、尋找耐藥相關基因作為指導個體化治療的標記物和潛在治療靶點是扭轉化療耐藥、提高治療效果并改善胰腺癌預后的關鍵，多項研究顯示外周血miR-21水平與胰腺癌化學治療藥物敏感性/耐藥性密切相關。

Park等[9]應用反義寡核苷酸(antisenseoligonucleotides,ASO)治療胰腺癌并觀察miR-21和miR-221的生物學功能，發現miR-21及miR-221的ASO干預能增加腫瘤細胞化療敏感性。Hwang[19]和Song等[25]在臨床中發現低表達miR-21的患者對吉西他濱化療更加敏感，而進一步體外實驗表明轉染抗miR-21可以增加腫瘤組織對化療藥物的敏感度。Wang等[26]選擇177例以吉西他濱為主的胰腺癌化療患者的血清miR-21進行研究，證明血清miR-21高表達與腫瘤進展快、腫瘤進展時間短和總生存期短相關，血清miR-21水平是預測胰腺癌進程和總生存期的獨立因素。功能分析提示吉西他濱化療降低了miR-21的表達水平，上調了Fas配體(FasLigand，FasL) 的表達，吉西他濱化療后FasL的表達上調誘導了胰腺癌細胞凋亡，而miR-21可保護胰腺癌細胞免受吉西他濱化療誘導的凋亡，且FasL是miR-21的直接靶標，研究表明血清miR-21水平可以預測進展期胰腺癌的化療療效并發現了miR-21作用于FasL/Fas途徑介導的化療耐藥新機制。Passadouro等[27]研究證實小劑量化療藥物舒尼替尼聯合miR-21沉默可以大幅增加抗腫瘤療效，對于PDAC的治療具有良好的應用價值。

3.4外周血miR-21與其他生化指標聯合檢測

將一種或多種外周血miRNA與其他類型腫瘤標志物進行聯合檢測，可有望顯著提高診斷的準確性。Kong等[15]檢測49例PDAC患者和36例正常人外周血標本中miR-21、miR-210、miR-155和miR-196a作為PDAC血清標志物的可能性，發現此4種miRNA在PDAC患者血漿中含量明顯增多，單獨作為診斷標志物的診斷效能分別為0.62、0.65、0.67和0.69，并且4種miRNA聯合診斷的效能為0.82，敏感性和特異性分別為64%和89%，提示多個miRNA聯合診斷比單個miRNA的診斷效能明顯提高。最新研究發現聯合檢測血清中7種miRNAs(miR-20a、miR-21、miR-24、miR-25、miR-99a、miR-185及miR-191)鑒別胰腺癌患者和健康對照者的準確率為86.8 %，明顯高于CA19-9(76.0 %)和CEA(55.8 %)；對懷疑為胰腺癌的55例患者的血清中的7種miRNA進行檢測與病理診斷后的準確性進行比較，發現聯合這7種miRNA作為標志物檢測準確率可達83.6 %(26例I期胰腺癌患者聯合診斷率為96.2%，48例II期胰腺癌患者聯合診斷率91.7%)，而CA19-9和CEA的準確性分別為56.4%和36.4%[28]。

4結語及展望

外周血與組織中多種miRNAs在胰腺癌中均有異常表達，并且其水平隨著胰腺癌病情進展而相應改變。研究表明外周血與組織中miR-21水平可作為胰腺癌診斷、病情進展、化療藥物敏感性/耐藥性預測及預后評估的新型生化指標，并有望為胰腺癌的治療提供新的靶點。

近年來，針對miRNA的研究已成為國際上熱點研究內容之一，對外周血與組織中miRNA的研究也逐漸開展，但目前miRNA的臨床相關研究還缺乏大樣本、多中心的數據論證，缺乏統一的檢測方法及嚴格的質控標準。由于miRNA作用的多重性，使有關外周血與組織中miRNA的研究方向得以不斷擴展。但其特異性作用機制等尚需進一步探討，以期早日應用于臨床。隨著研究內容不斷深入，外周血miRNAs檢測將在胰腺癌的早期診斷、鑒別診斷、化學治療效果及預后判斷等諸多方面展現出更為廣泛的應用價值，并且對胰腺癌的診斷、治療及預后評估起到推動作用。

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*通訊作者

文章編號：1007-4287(2016)06-1038-05

(收稿日期：2015-11-24)