尾巨桉DH32-26組培快繁技術

盧開成

(廣西國有派陽山林場,廣西寧明 532500)

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尾巨桉DH32-26組培快繁技術

盧開成

(廣西國有派陽山林場,廣西寧明 532500)

摘要[目的]探索尾巨桉DH32-26組培快繁技術，為其規模化生產提供參考。[方法]采用組織培養手段，以尾巨桉DH32-26半木質化萌發莖段為材料，對外植體誘導及無菌組織培養體系進行研究。[結果]最佳外植體誘導培養基為改良MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，發芽率為92.3%；最佳增殖培養基為改良MS+6-BA 0.4 mg/L+NAA 0.2 mg/L，增殖個數為3.7；最佳生根培養基為改良1/2MS+IBA 0.2 mg/L +ABT 0.3 mg/L，生根率可達98.3%。[結論]該研究獲得了尾巨桉初代誘導、增殖和生根適宜培養基和培養條件，初步達到工廠化生產要求。

關鍵詞尾巨桉DH32-26; 外植體; 組織培養

尾巨桉DH32-26是廣西國有東門林場從純種子代測試試驗和雜交育種試驗中選育的優良單株之一，具有年儲蓄量高、性狀穩定優良、抗逆性和適用性強等優點，通過區域試驗及營林生產中的大規模推廣應用，已通過國家林木良種審定，確定為全國林木良種，并產生了顯著的經濟、社會及生態效應[1-2]。隨著社會經濟的迅猛發展，木材纖維等原料需求量的日益提升，林木良種選育工作的逐步成熟，我國先后在桉樹、松樹、柚木、杉木和油棕等木本植物的良種選育和組培擴繁技術上取得了很大進步，獲得了長足的經濟社會效益，為林業發展作出了突出的貢獻。組培擴繁技術在速度、質量以及遺傳穩定性方面都具有明顯的優勢，目前關于尾巨桉DH32-26組培技術的研究鮮見報道。筆者以尾巨桉DH32-26半木質化萌發莖段為材料，對外植體誘導及無菌組織培養體系進行了研究，旨在為尾巨桉的大規模生產提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料尾巨桉DH32-26(Eucalyptusgrandis×E.urophyllaDH32-26)是廣西國有東門林場選育的林木良種。

1.2試驗方法選用15年生巨尾桉DH32-26砍伐后樹干基部萌發的半木質化莖段做外植體，取材時間宜天氣晴朗3 d后，取樣前7 d每日噴淋10%新潔爾滅溶液，10：00采集萌芽條，材料用飽和洗衣粉溶液刷洗干凈后備用。外植體消毒采用3個處理： A 75%乙醇30 s + 0.1%氯化汞7 min；B 75%乙醇30 s + 10%次氯酸鈉10 min；C 75%乙醇30 s +飽和次氯酸鈣12 min。 外植體滅菌處理后的材料切成1～2 cm長的莖段，每段帶1個節接種至培養基上誘導不定芽。

外植體初代誘導培養基分別設3個處理：A 改良MS+6-BA 1.2 mg/L+NA A 0.6 mg/L； B 改良MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L； C改良MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.4 mg/L。增殖培養基分別設3個處理： A 改良MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.25 mg/L； B 改良MS+6-BA 0.4 mg/L+NAA 0.2 mg/L； C 改良MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.15 mg/L。生根培養基分別設3個處理： A 改良1/2MS+IBA 0.3 mg/L+ABT 0.4 mg/L； B 改良1/2MS+IBA 0.2 mg/L+ABT 0.3 mg/L；C 改良1/2MS+IBA 0.1 mg/L+ABT 0.2 mg/L。所有培養基中均添加瓊脂7 g/L，蔗糖30 g/L，pH為5.5～5.6，在121 ℃高溫滅菌15 min。培養條件為溫度22～26 ℃，光照時間12～14 h/d，光照強度2 500～3 500 lx。

1.3數據統計與分析試驗數據采用SPSS(SPSS 19.0)軟件進行數據統計和方差分析。

污染率=(污染的穗條數/接種的穗條數)×100%

萌發率=(萌發的穗條數/接種的穗條數)×100%

褐化率=(褐化的穗條數/接種的穗條數)×100%

出芽率=(出芽的穗條數/接種的穗條數)×100%

2結果與分析

2.1不同消毒方式比較由表1可知，滅菌方式B存活率和出芽率最高，滅菌后的外植體生長較好、萌發較快且出芽較多，優勢明顯，為最佳消毒方案。滅菌方式A雖然污染率低，但存活率和出芽率分別較B低42.9%和29.4%，褐化率是B和C的5.9和15.1倍，這說明該方式可有效降低外植體的污染率，但外植體受消毒劑的影響最為敏感，易出現嚴重的褐化現象，甚至導致其死亡。滅菌方式C污染率最高，褐化率最低，存活率和出芽率分別較B低25.2%和7.3%，是次之的處理選擇。試驗中還發現使用10%次氯酸鈉滅菌時，可將10 min滅菌過程分成2次5 min滅菌過程(中間使用無菌水清洗數次)，對黃化、白化和不萌發現象有一定的抑制作用，且滅菌效果不變。

表1　3種外植體消毒方式對比

注：每個處理接種100株，取3次以上平均數。

Note: There were 100 plants for each treatment. The data were the mean value of three repetitions.

2.2桉樹無菌組培體系的建立

2.2.1誘導培養基。由表2可知，初代誘導培養基的細胞分裂素6-BA和生長素NAA濃度配比以處理B效果最佳，生長快速旺盛，有效芽多且長勢及狀態良好，莖粗葉壯；處理A激素濃度過高，萌芽率較B低28.2%，外植體基部易形成愈傷團塊，葉片卷曲，莖桿矮小；處理C激素濃度偏低，萌芽率較B低15.5%，萌芽正常但長勢較弱。因此，處理B為最佳初代誘導培養基。

表2　不同外植體誘導培養基對比

注：每個處理接種100株，取3次重復平均數。

Note: There were 100 plants for each treatment. The data were the mean value of three repetitions.

2.2.2增殖培養基。由表3可知，增殖培養基的細胞分裂素6-BA和生長素NAA濃度配比以B處理效果最佳，增殖倍數適宜，為2.3，芽長勢良好，有效芽多且生長較快；處理A激素濃度過高，增殖倍數較B低37.8%，莖芽伸長較B短26.9%，且易出現愈傷團和玻璃化，難以馴化，即使很快擴大繁殖，也會成為無效芽；處理C激素濃度偏低，增殖倍數較B低67.6%，莖芽伸長較B短15.4%，萌芽正常，但生長慢數量少，降低了擴繁速度，對育苗生產進度有很大影響。因此，處理B為最佳增殖培養基。

2.2.3生根培養基。由表4可知，生根培養基的生長素IBA和NAA濃度配比以處理B效果最佳，根系發達，側根繁多，平均根長可達2.45 cm，苗木生長旺盛、長勢均一，移栽后成活率可達85%；處理A生長素濃度過高，生根率較B低8.4%，平均生根條數較B低31.1%，易出現培養基褐化、根基部膨大現象，部分不生根，苗木較弱且長勢參差不齊，移栽后成活率較低、長勢較弱；處理C生長素濃度偏低，生根率較B低12.2%，平均生根條數較B低40.0%，根系較弱，側根少，苗木生長緩慢，細弱，長勢參差不齊，移栽后成活率較低且生長較慢。因此，處理B為最佳生根培養基。

表3　不同增殖培養基對比

注：試驗結果取3次平均數。

Note: The data were the mean value of three repetitions.

表4　不同生根培養基對比

注：試驗結果取3次平均數，試驗時間為接種后15 d。

Note: The data were the mean value of three repetitions. Test time as 15 d after inoculation.

3討論與結論

該研究采用75%乙醇和10%次氯酸鈉分別消毒處理30 s和10 min效果最好，存活率可達39.7%，出芽率為82.7%。外植體采集后應及時進行清洗消毒并接種至初代誘導培養基中，可最大程度地保持枝條活性、減少創口污染、提高萌芽率，其他桉樹外植體研究也得到類似結論[3]。外植體木質化程度對污染率、出芽率和褐化程度有很大影響，木質化程度越高，消毒后受消毒劑影響傷害越小，但內生菌生長旺盛，容易產生二次污染；新生頂芽材料嬌嫩，受消毒劑傷害最大，但活性高、內生菌含量少，成活后污染率低；枝條中上部半木質化的莖段介于二者之間，消毒劑耐受力強，出芽率高，污染率低，是最佳的外植體材料[4]。

不同細胞分裂素6-BA和生長素NAA濃度配比對外植體誘導馴化有顯著影響，初代和增殖培養均以處理B最佳，初代培養接種5～7 d后芽開始萌動，10 d左右基部有綠色突起，25～20 d誘導出芽。該試驗結果表明，初代和增殖培養中激素濃度過高均易導致變異畸形和玻璃化；濃度過低導致生長緩慢甚至無法萌動；激素濃度適宜時有效芽最多，生長水平達到最佳。其他樹種組織培養也得到一致的結論[5-7]，即細胞分裂素和生長素濃度配比對保證較高增殖倍數和較好質量嫩芽極其重要，細胞分裂素濃度過高時增殖倍數較高，但芽長勢下降，愈傷褐化玻璃化程度加劇，有效芽減少，配比適宜時效果最佳。

在生根培養試驗中，處理B最佳，接種4 d后芽基部開始形成根原基突起，5～8 d后出現小根，10～15 d長出發達的根系。在良好的光照條件下，根系莖葉發達健壯，苗木木質化程度好，25 d后移栽成活率可達95%，這與其他研究結果一致[8-10]。在工廠化生產中，為了抑制培養基褐化現象，可適當加入抗壞血酸(0.01～0.02 mg/L為宜)和活性炭(40 mg/L為宜)，加入過少無法抑制褐化，加入過量則容易影響到pH調控和培養基固化。

外植體誘導、無菌體系以及工業化生產模式的建立，是一個復雜艱難的過程，隨著技術瓶頸的突破和工業城市的進展，如何加快誘導速度、縮短培養周期、降低生產成本和選育推廣優良品系等都成為亟待解決的問題，有待于更多的試驗研究和應用推廣。

參考文獻

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作者簡介盧開成(1972- )，男，廣西那坡人，工程師，從事植物組織培養研究。

收稿日期2016-04-10

中圖分類號S 722.3+7

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)14-133-03

Rapid Propagation Technology ofEucalyptusgrandis×E.urophyllaDH32-26

LU Kai-cheng

(Guangxi Paiyangshan State Forest Farm,Ningming,Guangxi 532500)

Abstract[Objective] To research the rapid propagation technology of Eucalyptus grandis × E. urophylla DH32-26,and to provide references for the large-scale production. [Method] Half lignification ger mination stem section of Eucalyptus grandis × E. urophylla DH32-26was used as the research material. By using the means of tissue culture,we carried out explant induction and sterile tissue culture system in order. [Result] The optimal explant induction medium was improved MS + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.5 mg/L,with the ger mination rate being more than 92.3%. The optimal proliferation medium was improved MS+6-BA 0.4 mg/L+NAA 0.2 mg/L,with number of bud proliferates was 3.7. The best medium that the root induce was improved 1/2 MS + IBA 0.2 mg/L+ABT 0.3 mg/L,the rooting rate was 98.3%. [Conclusion] This research obtains the optimal culture mediums and cultivation conditions of initial induction,proliferation and rooting of Eucalyptus grandis × E. urophylla DH32-26,so as to preli minarily meet the requirements of industrialized production.

Key wordsEucalyptus grandis × E. urophylla DH32-26; Explant; Tissue culture