凹葉厚樸低溫脅迫SSH文庫的構建及差異基因的表達分析

陸 寧， 陳劍成， 鄭郁善

(1.福建農林大學林學院，福建福州 350002；2.福建農林大學藝術園林學院,福建福州 350002)

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凹葉厚樸低溫脅迫SSH文庫的構建及差異基因的表達分析

陸 寧1， 陳劍成1， 鄭郁善2*

(1.福建農林大學林學院，福建福州 350002；2.福建農林大學藝術園林學院,福建福州 350002)

摘要[目的]通過凹葉厚樸差減文庫的構建及序列分析，找出其主要抗寒相關功能基因。[方法]隨機挑選單克隆菌落進行PCR檢測，對837個陽性克隆測序后進行拼接得到97個 unigenes，將97個 unigenes在NCBI進行BLAST比對,后進行BLAST2GO功能分類，推定出11個相關基因進行熒光定量PCR。[結果]CHS、APX、TRX、ERF、DREB、LHCB、WRKY、HSP、PP2C、GAPDH 10個基因在凹葉厚樸受到低溫侵害時出現差異表達，推斷這10個基因在低溫時可能表現出防御機制。[結論]該研究為與凹葉厚樸親緣關系相近的植物抗低溫特性遺傳育種提供理論基礎。

關鍵詞凹葉厚樸;低溫脅迫;SSH文庫;基因表達量

溫度是影響凹葉厚樸生長發育的關鍵因素, 探尋低溫脅迫對凹葉厚樸分子機理的影響具有重要的理論和實踐意義。植物為了應對寒冷氣候進化形成了具有抗低溫能力的遺傳特性[1]。當受到低溫傷害時植物的抗寒基因才能被誘導表達啟動。植物在抵御低溫過程中是由多個基因共同參與代謝調控,單個基因無法增加植物的抗寒性[2]。根據抗寒過程中代謝產物的作用歸為兩類：調控基因和保護基因[3]。調控基因是編碼能與操縱序列結合的調控蛋白的基因,能夠起到調節保護基因的表達。保護基因轉錄翻譯而成的蛋白及其他代謝產物可以直接起到抗低溫的作用[4]。

目前，對凹葉厚樸及其親緣相近植物有關抗寒基因的研究鮮見報道。筆者通過凹葉厚樸差減文庫的構建及序列分析，找出其主要抗寒相關功能基因，分析代謝途徑，以期為與凹葉厚樸親緣關系相近的植物抗低溫特性遺傳育種提供理論基礎。

1材料與方法

1.1材料選取11月份生長健壯、粗細接近的2年生凹葉厚樸，來源于三明明溪。

1.2試劑大腸桿菌 DH5α和 Trizol 試劑均購自諾普生物有限公司。逆轉錄試劑盒和載體 pMD18-T vector 均購自寶生物工程有限公司。其余試劑均為國產分析純。

1.3方法

1.3.1植物半致死溫度的測定。幼苗低溫鍛煉后,選取適量材料分別置于-2、-4、-6、-8、-10、-12、-14、-16 ℃的低溫冰箱中低溫脅迫24 h,將頂芽取下，加入 ddH2O后用電導率儀測定第1次內含物滲透值(Ci);然后將其置于沸水中水浴10 min后25 ℃下放置12 h,漩渦振蕩后測定第2次電解質滲透值(Ct),按Y=(Ci-Cw)/(Ct-Cw) 計算試樣的電解質滲透率,每處理重復3次。

對測定后的結果用Logistic方程對溫度與電解質滲透值關系進行擬合,用坐標曲線的拐點溫度作為試樣的臨界溫度。Logistic方程：Y=K/(l+aebt)。

1.3.2植物的低溫脅迫處理。為使driver組和tester組除溫度不同其他生長條件一致，采取如下方法進行試驗：取4棵凹葉厚樸苗,分為2盆,放于25 ℃人工氣候培養箱培養7 d,7 d后將一盆凹葉厚樸留于人工氣候培養箱中,作為driver組；將另一盆凹葉厚樸于生長期轉移至溫度為半致死溫度的人工氣候培養箱中培養3 d,作為tester組。3 d后將2組頂芽采下除去最外層,保存備用。

1.3.3RNA 的提取和 cDNA 的合成。采用天根RNApreppure植物總試劑盒法提取凹葉厚樸頂芽總RNA,取得到的2管driver組(常溫)總RNA提取液與2管tester組(低溫)RNA提取液各5μL于PCR管中進行質量檢測。

使用 clontech公司In-Fusion SMARTer DirectionalcDNA Library Construction Kit合成cDNA，操作步驟按照使用說明書進行。加入小于1 μg的起始模板總RNA,當進行至10個循環后暫停程序,取出反應液30 μL至新的PCR管,作為探尋最佳循環數的試驗液體,剩余70 μL反應液置于4 ℃冰箱備用,當進行至13、16、19、22個循環，取出反應液5 μL至新的PCR管,將上述各循環產物取出5 μL通過電泳得到的條帶尋找最佳循環數。之后將剩下的第一鏈產物全部進行至最佳循環數。

1.3.4抑制SSH文庫的構建。 抑制SSH雜交具體操作按照 PCR Select TM cDNA Subtraction Kit(Clontech 公司)的使用說明書進行。以低溫條件下凹葉厚樸cDNA作為試驗組(tester),25 ℃凹葉厚樸cDNA 作為驅動組(driver)。經 Rsa I 酶切消化、接頭連接、2 次SSH雜交和 2 次 PCR 完成整個抑制SSH雜交過程。利用看家基因CBC18的特異引物:上游引物TGATACAGATGGAACTAAC，下游引物GGAACTCTATACGCTAAC。對SSH和未SSH的第 2 次 PCR 產物進行 PCR 擴增,以檢測 SSH 成功與否。

用分級柱對SSH PCR 產物進行純化回收,與pMD-18T Easy載體(TaKaRa 公司)連接。利用電轉化法將連接好的載體導入大腸桿菌菌株 DH5a(Tian公司)中,取一些原始文庫稀釋不同倍數混勻后移至培養皿中涂板,將培養皿放入37 ℃恒溫培養箱過夜培養后檢查菌落形成與否。經藍白斑篩選,挑取所有白色克隆至含有LB 液體培養基中,37 ℃振蕩過夜培養。 第2天每管取1 μL采用質粒引物進行陽性克隆PCR檢測。將陽性克隆送伯尚生物公司進行測序。

1.3.5序列分析和功能分類。 將測序的序列進行去載體、聚類拼接得到unigenes序列,將序列在NCBI蛋白數據庫中進行BLAST比對,得到序列相關的相似核酸序列和相似蛋白質。在BLAST比對結果中,將對齊分(Score)>80,同一性(Ident)>35%的序列進行相關作用注釋,將對齊分值(Score)<80的序列利用BLASTN進行同源性比對。將序列用BLAST2GO進行功能分類。

1.3.6熒光定量 PCR 分析候選基因的表達。 將供試幼苗分為4組放入培養箱，溫度分別設為25、6、-2、-8 ℃。脅迫處理24 h后取各處理凹葉厚樸頂芽,提取總RNA,取各樣品RNA 1 μg,按TaKaRa公司PrimerScriptTM RT reagent Kit說明書進行反轉錄。基因的特異引物設計按照熒光定量PCR引物原則使用Primer 5.0軟件對選定的11個低溫相關的候選基因設計特異引物,內參基因選用UBC18基因。

反應在ABI7500實時熒光定量PCR儀上進行,循環數為40。每個樣品3個重復,相對表達量的計算：△△Ct= (CT,gene-CT,UBC18)低溫處理-(CT,gene - CT,UBC18)常溫處理。

2結果與分析

2.1半致死溫度在4個溫度梯度下將凹葉厚樸幼苗脅迫24 h后，電導率檢測結果見圖1。從圖1可以看出，在-8～-10 ℃電導率直線上升,在-10 ℃時電導率為65.35%，膜透性幾乎完全破壞。運用SPSS軟件對內含物滲透值進行分析,得回歸方程：y=0.752 6/(1+18.925e-0.372x) ,半致死溫度為-7.93，與預測值相近,可以代表凹葉厚樸頂芽的半致死溫度。

圖1　電導率隨溫度的變化規律Fig.1　The variation law of conductivity with temperature

2.2cDNA的合成結果

2.2.1RNA提取結果。提取的4組凹葉厚樸RNA的OD260/OD280均高于2.0且小于2.2,認為RNA中蛋白質或其他有機物的污染在許可范圍內。OD260/OD230均大于1.8,表明RNA溶液中的鹽類等無機物污染較小,且充分去除了漂洗殘留的乙醇。由圖2可知,4組提取的凹葉厚樸RNA經電泳檢測28S、18S條帶明亮,且28S的亮度接近于18S的2倍,說明RNA的完整度較高,比例適當。試驗中選取tester1與driver1進行下一步試驗。

圖2　RNA電泳檢測圖譜Fig.2　RNA electrophoresis detection

2.2.2雙鏈cDNA的合成。從圖3可以看出,隨著擴增循環數的增加,dscDNA的300～3 000 bp的亮度呈由淺到深到淺的變化,且dscDNA的片段大小也呈向上集中的趨勢。選取分布較集中、亮度最高、含量最多的19循環為最優循環數,其產物集中分布在0.3～3.0 kb,可以滿足下一步試驗的需要,將tester和driver剩余的70 μL反應液通過PCR進一步擴增到19循環,再進行下一步的反應。

圖3　dscDNA的電泳結果Fig.3　dscDNA electrophoresis results

2.3SSH文庫的構建結果

2.3.1雙鏈cDNA(dscDNA)的酶切。由圖4可知，合成的dscDNA分布在0.2～3.0 kb,酶切后的dscDNA分布在0.1～2.0 kb,條帶下移說明dscDNA的RsaI酶切比較完全。

注：M為DNA分子量標準；driverB與testerB為RsaI酶切產物；driverA與testerA為合成的試驗組雙鏈cDNA。Note: M. DNA molecular weight marker; driverB and testerB. RsaI enzyme products; driverA and testerA. Synthetic test group double-stranded cDNA. 圖4　driver與tester組雙鏈cDNA合成與酶切結果Fig.4　driver and tester group double-stranded cDNA synthesis and enzyme digestion

2.3.2接頭連接效率分析。由圖5可知，看家基因UBC18 的3′端引物與primer1的5′端引物共同擴增的片段大于看家基因UBC18 3′端、5′端引物擴增的片段,與預期結果一致。

注：M.DNA分子量標準;1、2.以Tested-1與Adaptor1連接為模板PCR的產物;3、4.以Tested-2與Adaptor2R連接為模板PCR的產物;1、3.以PCRprimer1與看家基因3′引物PCR的產物;2、4.以看家基因3′與5′引物PCR的產物。Note: M. DNA molecular weight marker; 1, 2. PCR products with Tested-1 Adaptor1 connection as template; 3, 4. PCR products with Tested-2 Adaptor2R connection as template; 1, 3. With PCRprimer1 and housekeeping gene 3′primer PCR products; 2, 4. With housekeeping gene 3′ and 5′primer PCR product.圖5　接頭連接效率檢測Fig.5　Joint connection detection efficiency

2.3.3消減產物2次PCR結果。第2次PCR擴增結束后,取陽性對照擴增產物、未消減抑制性擴增產物、消減抑制性擴增產物進行電泳檢測,結果見圖6。由圖6可知，消減產物2次抑制性PCR擴增出的條帶較亮且完整,由此可知，接頭連接效率較高。因為沒有兩端連有接頭的DNA是無法在特定引物下進行擴增。第2次PCR擴增產物主要分布在0.3～1.0 kb,且分布均勻,未見明顯的主帶,與預期結果符合。

注：M.DNA分了量標準;1.陽性對照擴增產物，2.未消減抑制性擴增產物，3.消減抑制性擴增產物。Note: M. DNA molecular weight marker; 1. Positive contrast amplification products, 2. Not cutting inhibitory amplification products, 3. Cutting inhibitory amplification products. 圖6　消減產物2次PCR結果Fig.6　Reduction product twice PCR results

2.3.4消減效率檢測。以消減雜交的產物為模板PCR檢測UBC18看家基因,28個循環后才有條帶出現,而以未經消減雜交的產物為模板擴增,在第18個循環處即有條帶出現。UBC18看家基因18S在消減cDNA和未消減cDNA中含量差異顯著,表明tester和driver中共有的cDNA已被有效消除,同時也表明低溫組和常溫組的特異性差異表達基因也相應得到富集(圖7)。

注：1～4分別為未經消減雜交產物的18、23、28、33循環，5～8分別為消減雜交產物的18、23、28、33循環。Note: 1-4 are 18, 23, 33 and 28 cycles of not cutting hybrid products, and 5-8 are 18, 23, 28 and 33 cycles of cutting hybrid products. 圖7　PCR檢測看家基因cDNA的消減效率Fig.7　PCR detection of housekeeping gene cDNA abatement efficiency

圖8　差減原始文庫菌落Fig.8　Differential reduced original library colony plate

2.3.5文庫質量評價。通過IPTG誘導，經X-Gal染色測定原始文庫的重組率,統計藍白斑比例，結果表明文庫重組率為99.3%(圖8)，隨機挑選的23個陽性克隆插入片段在0.2～1.0 kb,平均值約為0.65 kb,菌液PCR檢測得到的陽性克隆重組率為100%(圖9)。

圖9　差減cDNA文庫部分隨機插入片段電泳圖譜Fig.9　Subtraction cDNA library partial random insertion fragment electrophoresis

2.4測序結果

2.4.1片段長度。消減文庫共測序900個陽性克隆,通過 SEQMAN 軟件分析,去除低質量及污染序列,共得到高質量序列837個。

經聚類拼接共得到126個conting。經SEQMAN 軟件組裝,最后得到 97個 unigenes(包括病毒或污染的 unigenes)。其中，unigenes最長的序列為 5 849 bp,最短的為 523 bp,序列長度集中在 1 000～3 000 bp,79%的序列長度大于 1 000 bp,43%的序列長度大于2 000 bp,22%的序列長度大于3 000 bp。由此可知，消減文庫中的序列分布全面。

2.4.2NCBI蛋白數據庫注釋。從GenBank中對編碼區進行注釋,通過與NCBI蛋白數據庫進行比對注釋,得到與unigenes序列編碼同源性相近的蛋白信息。將97個拼接完成的unigenes與NCBI蛋白數據庫進行BLAST比對注釋,有76條unigenes在數據庫中得到注釋。其中，來自于蓮的基因有29條、葡萄12條、可可7、海棗5、油棕4,表明凹葉厚樸抗寒基因具有與上述植物較高的同源性。

2.4.3GO功能分類。將具有已知或推定功能蛋白的98條unigeness在BLAST2GO進行功能分類,成功對58條unigeness進行了分類,共獲得114個GO terms。其中，生物學過程最多(67)，占46.52%，其次是分子功能(42)和細胞組件(35)，分別占29.17%和24.31%。

分類結果顯示,凹葉厚樸抗寒抵御機制主要靠生物學過程的調控方式進行,而細胞組件的調控相對較少。測序的ESTs涵蓋的功能較齊全,且能反映特定時期細胞表達信息(低溫脅迫),表明文庫構建成功,可用于后續抗寒相關基因的篩選。

2.4.4可能在逆境環境中有響應的基因。在對97條unigenes信息處理后，最終推定出有可能參與抗寒應激防御的11個基因(表1)。

表1　推定出的11條抗寒基因

2.5熒光定量PCR結果由圖10可知，除FLS基因外,其他基因均比常溫表達量較高。其中，CHS、APX、TRX、DREB等基因均隨溫度的降低表達量不斷增加,LHCB、WRKY、HSP、PP2C等基因在-8 ℃時由于溫度過低代謝受到抑制，從而使表達量有所下降。ERF、GAPDH基因表達量隨溫度的降低而升高，這2個基因與溫度的相關性較強。但在溫度過低時植物代謝受到阻礙,基因的表達受到抑制,這是由于低溫破壞了基因正常的代謝途徑。因而判定CHS、APX、TRX、ERF、DREB、LHCB、WRKY、HSP、PP2C、GAPDH10個基因在凹葉厚樸受到低溫侵害時出現差異表達，由此推斷這10個基因在低溫時可能表現出防御機制。

圖10　熒光定量PCR測定基因表達量Fig.10　Gene expression measured by fluorescence quantitative PCR

3討論

3.1文庫構建注意事項 cDNA文庫是生物在某一時期基因所表達的文庫，即DNA所轉錄出的RNA序列，因此，文庫中大部分為相同的高峰度序列，對于尋找低峰度的功能基因較為困難。差減cDNA文庫可以有效較少文庫中的高峰度基因，保留低峰度差異基因，有利于篩選出目的基因，是較為理想的基因篩選方法。但差減文庫相比全長文庫試驗步驟多而復雜，因此需要注意以下幾點：①植物的低溫脅迫臨界值受季節氣候的影響較大，在測定脅迫臨界值后應盡快開始差減文庫的構建過程。此外，植物抗寒基因的表達量也會隨季節氣候的變化而變化，因此，為了能準確反映凹葉厚樸11月份抗寒基因的表達情況，在進行熒光定量PCR驗證基因表達量時宜選擇與11月份溫度相近的冬季進行為宜。②植物取材。為了減少原始tester組和driver組在遺傳背景和基因表達上的差異，在植株取材上應選擇相同年份、同一種源且生長環境相同的植株。挑取形態外觀相近的植株，取同一部位作為試驗材料。取材部位以嫩葉或嫩芽為宜。凹葉厚樸為落葉植物，受到低溫侵害時植物葉片自然掉落，葉片中的抗寒基因較少。頂芽在低溫下可存活，證明頂芽具有較多的抗寒基因表達，因此，頂芽為凹葉厚樸構建差減文庫較好的取材。③RNA的提取和cDNA的合成。在操作過程中RNA與DNA的降解都會造成差減文庫假陽性的產生，加大數據分析難度。因此，在試驗過程中應盡量保持樣品的低溫以避免外界污染，可以選擇在冰上對試劑進行添加，且保持周圍環境潔凈，在超凈工作臺上操作可以減少外界環境的干擾，所有與樣品有直接或間接接觸的儀器和試劑都應消毒殺菌。

3.22種cDNA合成方法的比較差減文庫所用的cDNA是用Oligo d法合成的cDNA,因為Oligo d(T)15和基因特異性引物(GSP)比隨機引物的特異性低。隨機引物在轉錄過程中會有多個退火位點,產物短且只有部分長度的cDNA。但Oligo d法的起始模板是mRNA,加大了試驗難度。

該試驗最終采用clontech 公司的 in-fusion SMARTer cDNA Construction Kit 合成差減文庫構建所需要的cDNA,這是由于：①在總RNA中僅含有2%左右的poly(A)RNA，即mRNA,且在mRNA提取過程中會有大量mRNA的損耗。因此，需要100 μg左右總RNA才可以滿足后續試驗的需求,而10株左右的凹葉厚樸幼苗頂芽可提取出100 μg總RNA。②用Oligo d法合成的cDNA未進行擴增,產物總量較少,在進行純化后又會有部分損失。下一步進行酶切后需要進行純化,還會損失一部分。最終因量太少在進行瓊脂糖凝膠電泳后無法顯示出明顯條帶,不利于后續試驗操作。③使用磁珠提取mRNA步驟繁瑣,且成功率較低，而過柱法提取mRNA較為簡單高效,但價格相對較高。

3.3抗寒基因評價通過對所得到的97條基因比對，結果表明，凹葉厚樸的低溫脅迫信號途徑為不依賴ABA的信號途徑，研究表明有CBF/DRE參與的信號途徑不依賴ABA。該試驗通過對差減文庫序列片段的深入分析得到10個有關脅迫響應的基因,并通過熒光定量PCR驗證了基因的差異表達，包括：①WRKY基因屬于鋅指家族蛋白家族[5]，在多種植物的抗性基因中均有發現，是抵御逆境的重要基因，但尚未有關于WRKY基因分子機制的相關資料[6]。②DREB/CBF轉錄因子[7]通過調控凹葉厚樸的磷酸肌醇代謝、膜運輸、細胞新陳代謝、脅迫信號轉導等來抵御低溫[8]傷害。③ERF基因是AP2/ERF[9]蛋白基因家族的其中一員[10]，AP2/ERF蛋白基因與植物抗逆有關，其通過蠟質合成、激素合成以及ROS清除來抵御低溫[11]。④HSP基因轉錄[12]得到的熱激蛋白在植物受到低溫侵害時可以減少溶質滲漏保護植物細胞膜的完整性，減少細胞的脫水進而保護植物在低溫下不受侵害。⑤LHCB1基因轉錄得到的捕光葉綠素結合蛋白與光能的吸收和多余能量的消耗有關[13]，可以提高植物在低溫下細胞膜的穩定性，且減少因低溫產生的過氧化物的積累。⑥APX可以在植物受到逆境傷害時減少過氧化物[14]和羥基自由基的積累，保護植物葉綠體和其他細胞組分，是植物抗逆過程中重要的酶[15]。⑦Trx硫氧[16]還蛋白可以調控酶活性，并使可逆的二硫鍵及硫醇變化起氧化還原載體的功能，是維持細胞膜內環境穩定的重要因子。⑨GAPDH基因[17]是與細胞膜抗滲透脅迫及穩定性有關的基因。

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基金項目國家科技支撐計劃項目(2011BAI01B06)；福建省科技重點項目(2009Y0003)。

作者簡介陸寧(1988- ),男,福建漳州人,碩士研究生，研究方向：分子生物學與基因工程。*通訊作者,教授,博士，博士生導師,從事藥用植物分子生物學方面的研究。

收稿日期2016-04-26

中圖分類號Q 781

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)14-141-05

Construction ofMagnoliaofficinalisLow Temperature Stress SSH Library and Differential Gene Expression Analysis

LU Ning1, CHEN Jian-cheng1, ZHENG Yu-shan2*

(1. College of Forestry, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002; 2 College of Art and Landscape, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002)

Abstract[Objective] The aim was to obtain cold resistance relevant genes through construction of Magnolia officinalis subtractive library and sequence analysis. [Method] PCR detection was conducted on randomly selected monoclonal colony, after 837 positive clone sequencing, 97 unigenes were obtained, BLAST comparison was conducted on NCBI, then BLAST2GO functional classification was carried out. [Result] Fluorescence quantitative PCR was conducted on 11 relevant genes. CHS, APX, TRX, ERF, DREB, LHCB, WRKY, HSP, PP2C, GAPDH exhibited the defense mechanism when Magnolia officinalis was damaged by low temperature. [Conclusion] The study can provide theoretical basis for cold resistance genetic breeding of plants with similar affinities to Magnolia officinalis.

Key wordsMagnolia officinalis; Low temperature stress; SSH library; Gene expression