福建地區(qū)2株豬嵴病毒VP1基因的克隆及遺傳進(jìn)化分析

張永軍，胡永浩

(1.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅蘭州 730046；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

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福建地區(qū)2株豬嵴病毒VP1基因的克隆及遺傳進(jìn)化分析

張永軍1，胡永浩2*

(1.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅蘭州 730046；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

摘要[目的]調(diào)查豬嵴病毒在福建地區(qū)腹瀉豬群中的流行和變異情況。[方法]根據(jù)GenBank中登陸的豬嵴病毒(porcine kobuvirus，PKoV)結(jié)構(gòu)蛋白VP1基因序列設(shè)計特異性引物，采用RT-PCR方法從某豬場采集腹瀉小腸樣品中擴(kuò)增豬嵴病毒VP1基因，將擴(kuò)增后的目的片段克隆后進(jìn)行序列測定。應(yīng)用生物信息學(xué)軟件，將獲得的2株豬嵴病毒VP1和GenBank的豬嵴病毒株VP1基因序列進(jìn)行對比分析。[結(jié)果]豬嵴病毒CH/FJNP/12L/2015與匈牙利株K-30-HU/2008/HUN(GQ249161)的核苷酸同源性最高，為88.1%，氨基酸同源性為95.3%。 CH/FJNP/12W1/2015與越南株714441/CAOLANH-VH/2012-2-21(KT266058)的核苷酸同源性最高，為88.2%，氨基酸同源性為96.1%，同源重組分析顯示，2株毒株均無明顯同源重組發(fā)生。[結(jié)論]頻繁的畜禽國際貿(mào)易，以及如今便捷的現(xiàn)代化交通工具，人們生活提供方便的同時，也加速了豬嵴病毒毒性的傳播。

關(guān)鍵詞豬嵴病毒；VP1基因；同源性

嵴病毒屬小RNA病毒科嵴病毒屬成員，病毒粒子呈球形，無囊膜，直徑為27～30 nm。其衣殼呈二十面體，由3種結(jié)構(gòu)蛋白(VP0、VP3和VP1)組成的60個不對稱亞單位構(gòu)成。病毒基因組為單股正鏈RNA，其標(biāo)準(zhǔn)毒株人愛知病毒(Aichi virus，AiV)、牛嵴病毒(Bovine kobuvirus，BKoV)、豬嵴病毒(Porcine kobuviruses，PKoV)和已公布羊嵴病毒(Sheep kobuvirus，SKoV)、狗嵴病毒(Canine kobuvirus，CKoV)。2007年匈牙利學(xué)者最早在豬糞便中檢測諾瓦克(Norovirus)和札幌病毒病毒(Sapovirus)時發(fā)現(xiàn)了豬嵴病毒(S-1-HUN/2007/Hungary)，并對其全基因組進(jìn)行生化測序[1]。我國豬庫博病毒的最早報道為2009年，研究者對2006～2007年收集自河北省322份<15日齡仔豬的糞便樣品進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)有97份豬庫博陽性，陽性檢出率為30%[2]。研究發(fā)現(xiàn)，病毒在無腹瀉臨床表現(xiàn)的健康豬中也頻繁被檢出，且隨豬齡的增長，病毒在糞便中的檢出率降低。研究表明，豬庫博病毒的傳播與豬腹瀉直接相關(guān)[3]，豬血清中檢測到病毒RNA和易感病毒粒子也說明庫博病毒病毒血癥的存在，通過對病毒全基因組序列比較分析病毒nt/aa的變異，表明病毒與宿主發(fā)生了很好的相互適應(yīng)[4]。Jin等[5]對江蘇省樣品進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腹瀉樣品豬嵴病毒陽性率為64.8%(59/91)，健康樣品中豬嵴病毒陽性率為19.8%(25/126)，說明豬嵴病毒在江蘇省普遍流行，推測豬嵴病毒是潛在的仔豬腹瀉誘因。

豬嵴病毒與小RNA病毒科其他病毒相似，蛋白之間的裂解位點(diǎn)多位于Glu和Gly、Ala之間，據(jù)此劃分了已知的各嵴病毒標(biāo)準(zhǔn)株基因組。所有嵴病毒都有相似的基因組結(jié)構(gòu)：VPg-5′UTR-(L蛋白)-結(jié)構(gòu)蛋白P1(VP0-VP3-VP1)-非結(jié)構(gòu)蛋白(P2-P3)-3′UTR-poly(A)。VP1蛋白是小RNA病毒科變異最為頻繁的結(jié)構(gòu)蛋白，其含有主要的抗原表位。筆者以2015年福建地區(qū)腹瀉嚴(yán)重的規(guī)?；i場為研究對象，選取代表性豬場豬嵴病毒的VP1基因序列與參考序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，以期為該病毒在自然界進(jìn)行和流行病學(xué)研究提供參考。

1材料與方法

1.1樣品采集與處理2015年收集福建2個不同地區(qū)的規(guī)?；i場4～7日齡表現(xiàn)嘔吐、水樣腹瀉和嚴(yán)重脫水的仔豬腸內(nèi)容物，按照1∶5比例加入PBS，然后置于QIAGEN TissueLyserII研磨，-80 ℃反復(fù)凍溶2次，8 000 r/min離心10 min，吸取上清，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑PrimeSTAR HS DNA Polymerase、T4 DNA快速連接酶購自Promega公司；MiniBest Plasmid Purification Kit、Agarose Gel DNA Purification Kit、DH5α大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)細(xì)胞限制性內(nèi)切酶等均為大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)產(chǎn)品。

1.3豬嵴病毒Real-time PCR檢測根據(jù)已建立的豬嵴病毒Real-time PCR檢測方法。Kub-F：5′-AGATATGGACAAACCCTGGCCC-3′，Kub-R：5′-GATCGCCTCCTCCATTGTCAGA-3′。Kub-Probe：5′-ACTCGAGGCGGCCGCCGACG-3′(5′HEX，3′TAMRA)。以RNA提取物為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，25 μL反應(yīng)體系：2×One Step RT-PCR BufferⅢ(含dNTP Mixture，Mg2+)12.5 μL，TaKaRa ExTaqHS(5 U/μL)0.5 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ 0.5 μL，RNase Free dH2O 7.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，Probe 1.0 μL，RNA 2.0 μL。PCR擴(kuò)增采用Agilent Techologies-Mx3005pPCR擴(kuò)增儀，反應(yīng)程序：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，1個循環(huán)(反轉(zhuǎn)錄)95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃30 s，40個循環(huán)(PCR擴(kuò)增)，其中，熒光信號收集設(shè)置在每一循環(huán)的72 ℃ 30 s末。

1.4豬嵴病毒VP1基因擴(kuò)增及測序?qū)⑸鲜鰴z測為陽性的不同豬場RNA樣品各選取3份，參考文獻(xiàn)[6]引物及PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行VP1基因擴(kuò)增，用一步法反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增試劑盒，50 μL體系用擴(kuò)增VP1引物得到預(yù)期1 100 bp大小的目的基因，并將其克隆到pMD20-T載體，每個克隆不少于3個克隆進(jìn)行測序。

1.5遺傳進(jìn)化分析 用DNAStar軟件將豬嵴病毒VP1基因和GenBank數(shù)據(jù)庫中參考株的VP1基因進(jìn)行比對分析，利用MEGA 6.0中的NJ(Neighbor-joining)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.6重組分析用simplot 3.5.1軟件將分離的2株豬嵴病毒VP1基因和比對同源性最高的參考序列進(jìn)行同源重組分析，分析毒株間是否發(fā)生同源重組。

2結(jié)果與分析

2.1豬嵴病毒檢測 檢測樣品均為福建2個不同地區(qū)的規(guī)?；i場4～7日齡的腹瀉仔豬腸內(nèi)容物，每個地區(qū)選取10份病料，用Real-time PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)病料均為豬嵴病毒陽性。

圖1　Real-time PCR病料檢測結(jié)果Fig.1　Result of Epidemic Material with Real-time PCR

2.2豬嵴病毒VP1基因的擴(kuò)增及酶切鑒定應(yīng)用特異性引物，以提取的病毒總RNA為模板，對上述毒株進(jìn)行RT-PCR，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增出大小為762 bp的特異性目的條帶，純化回收后與pMD20-T克隆載體連接、轉(zhuǎn)化，用NdeI/BamHI進(jìn)行雙酶切后，得到2個大小約2.7 kb與762 bp的片段，對應(yīng)于載體和目的基因VP1的大小(圖2)，表明重組質(zhì)粒為陽性。

注：1.重組質(zhì)粒單酶對照；2.重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物；M.5 000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。Note：1.Recombinant plasmid with NdeI 2.Recombinant plasmid with NdeI and BamHI M.DL DNA Marker(5 000 3 000 2 000 1 500 1 000 750 500 250 100)圖2　含有VP1的重組質(zhì)粒NdeI/BamHI雙酶切鑒定結(jié)果Fig.2　Result of Recombinant Plasmid with NdeI and BamHI

2.3豬嵴病毒VP1基因分析及遺傳進(jìn)化分析從4～7日齡的腹瀉仔豬腸內(nèi)容物樣品中各選取一株為代表株，分別命名為CH/FJNP/12W1/2015和CH/FJNP/12L/2015，其序列登陸至GenBank。將上述2株分別與已公布的我國其他地區(qū)的豬嵴病毒VP1序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，CH/FJNP/12W1/2015與我國其他地區(qū)的核苷酸同源性81.1%～87.5%，與GS-2/2012-CH的同源性最高為87.5%。CH/FJNP/12L/2015與我國其他地區(qū)的核苷酸同源性為81.2%～87.3%，與CH/DX/2012的同源性最高為87.3%。遺傳進(jìn)化分析顯示所有已知的豬嵴病毒VP1序列形成2個主要分支，分離自福建2株毒株分別位于2個分支(圖3)。

圖3　基于豬嵴病毒已公布和福建地區(qū)毒株VP1基因遺傳進(jìn)化分析Fig.3　Genetic evolution analysis of VP1 in Fujian based on swine viruses published

2.4同源重組分析將分離的2株豬嵴病毒VP1基因CH/FJNP/12L/2015和CH/FJNP/12W1/2015，和進(jìn)化分析比對同源性最高的714441/CAOLANH-VH/2012-2-21(KT266058)、K-30-HU/2008/HUN(GQ249161)和S-1-HUN 2007 Hungary(EU787450)進(jìn)行同源重組分析，結(jié)果顯示，CH/FJNP/12L/2015和CH/FJNP/12W1/2015分別作為研究父本，與參考序列同源重組比對均無明顯重組。

注：A.CH/FJNP/12L/2015作為父本，B.CH/FJNP/12W1/2015作為父本。Note：CH/FJNP/12L/2015 as parental strain in A，CH/FJNP/12W1/2015 as parental strain in B.圖4　同源重組分析Fig.4　Analysis of homologous recombination

3結(jié)論與討論

豬嵴病毒屬于小RNA病毒科的成員，其基因組序列在與外界環(huán)境適應(yīng)的過程中容易發(fā)生變異，國內(nèi)外研究表明，發(fā)生腹瀉的仔豬其豬嵴病毒檢出率明顯高于未發(fā)生腹瀉的豬群，因此推測豬嵴病毒在仔豬腹瀉中扮演著一定的作用，但是因?yàn)樨i流行性腹瀉病毒的大規(guī)模流行，加速豬嵴病毒在豬群中的感染，還是豬嵴病毒協(xié)同豬流行性腹瀉病毒從而導(dǎo)致仔豬腹瀉的大范圍暴發(fā)，仍需要2種病毒的分離及致病性試驗(yàn)才能定論。

該研究分離的2015年福建豬嵴病毒VP1序列CH/FJNP/12W1/2015與越南株714441/CAOLANH-VH/2012-2-21(KT266058)的核苷酸同源性最高，為88.2%，氨基酸同源性為96.1%。越南為我國鄰國，CH/FJNP/12W1/2015與越南毒株高度同源，推測可能是兩國頻繁的畜禽貿(mào)易，促進(jìn)了豬嵴病毒毒株的傳播。另一株豬嵴病毒CH/FJNP/12L/2015與匈牙利株K-30-HU/2008/HUN(GQ249161)的核苷酸同源性最高，為88.1%，氨基酸同源性為95.3%。匈牙利為歐洲中部內(nèi)陸國家，2015年出現(xiàn)與匈牙利具有高度同源性的豬嵴病毒，推測可能也是頻繁的畜禽國際貿(mào)易，及如今便捷的現(xiàn)代化交通工具，在給人們生活提供方便的同時，也為豬嵴病毒毒株的傳播提供了條件。該研究對我國福建地區(qū)腹瀉仔豬豬嵴病毒的感染狀況進(jìn)行初步調(diào)查，并對VP1基因序列遺傳進(jìn)化生物分析，以期為該病毒在自然界進(jìn)化和流行病學(xué)研究提供參考。

參考文獻(xiàn)

[1] REUTER G，BOLDIZSAR A，PANKOVICS P.Complete nucleotide and amino acid sequences and genetic organization of porcine kobuvirus，a member of a new species in the genus Kobuvirus，family Picornaviridae[J].Archives of virology 2009，154(1)：101-108.

[2] YU J M，JIN M，ZHANG Q，et al.Candidate porcine Kobuvirus，China[J].Emerging infectious diseases，2009，15(5)：823-825.

[3] PARK S J，KIM H K，MOON H J，et al.Molecular detection of porcine kobuviruses in pigs in Korea and their association with diarrhea[J].Archives of virology，2010，155(11)：1803-1811.

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[6] WANG C，LAN D，CUI L，et al.Molecular characterization of a porcine kobuvirus strain in China[J].Archives of virology，2012，157(3)：573-578.

基金項(xiàng)目中國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)體系(CARS-39)。

作者簡介張永軍(1982- )，男，甘肅靖遠(yuǎn)人，獸醫(yī)師，從事動物疫病監(jiān)測與防治研究。*通訊作者，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究。

收稿日期2016-04-22

中圖分類號S 852.65+1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)14-149-03

Cloning of Porcine KobuvirusVP1 in Fujian province and Phylogenetic analysis

ZHANG Yong-jun1, HU Yong-hao2*

(1.China Agricultural Vet.Bio.Science and Technology Co.,Lanzhou,Gansu 730046;2.College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou,Gansu 730070)

Abstract[Objective] The current situation of the epidemic and genetic variation of the porcine Kobuvirus (PKV) in diarrhea pigs in Fujian province were investigated. [Method] The special primer was designed according to the sequence of PKV deposited in GenBank. The VP1 gene of PKV in intestinal samples collected from pig-raising farm was amplified with RT-PCR method, and then, the amplified target fragment was cloned and sequenced. The sequences of two PKV strains were analyzed and compared by means of bioinformatics software. [Results] The results showed that there was high nucleotide homology between VP1 gene of CH/FJNP/12L/2015and K-30-HU/2008/HUN, which was 88.1%; amino acid homology, 95.3%. The homology in the nucleotide and amino acid of CH/FJNP/12W1/2015 with 714441/CAOLANH-VH/2012-2-21 was 88.2% and 96.1%, respectively. The two isolates had no obvious homologus recombination occurred with other strains. [Conclusion] speculated that the frequent international livestock trade, and is now a modern and convenient means of transport, in convenience to our lives, but also accelerate the spread of swine crest virus strains. [Conclusion] It is speculated that it resulted from the frequent international trade of livestock and poultry, and convenient modern transportation tools, which also accelerated the transmission of PKV.

Key wordsPorcine kobuviruses; VP1 gene; Homology