刺絡瀉血對原發性肝癌大鼠血清AFP、SF的影響

吳　云　趙慧玲　劉新燕　魏　珂　陳子晨　譚　麗　戰慧敏

(1 北京中醫藥大學針灸推拿學院，北京，100029； 2 豐臺中西醫結合醫院，北京,100072)

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實驗研究

刺絡瀉血對原發性肝癌大鼠血清AFP、SF的影響

吳云1趙慧玲1劉新燕1魏珂2陳子晨1譚麗1戰慧敏1

(1 北京中醫藥大學針灸推拿學院，北京，100029； 2 豐臺中西醫結合醫院，北京,100072)

摘要目的：觀察刺絡瀉血對原發性肝癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)模型大鼠甲胎蛋白(Alpha-Fetoprotein，AFP)、鐵蛋白(Serum Ferritsn，SF)及肝功能相關指標的影響，探究刺絡瀉血對HCC的預防作用及相關機制。方法：將40只健康Wistar大鼠隨機分為正常對照組(10只)、模型組(15只)、刺血預防組(15只)。除正常對照組外，其余兩組均采用二乙基亞硝胺(Diethylnitrosamine，DEN)腹腔注射建立HCC模型，刺血預防組在造模開始同時取肝經淺表絡脈刺血，0.5 mL/次，2次/周，至13周。第13周末，腹主動脈取血5 mL，采用ELESA法測定3組大鼠血清肝功能丙氨酸氨基轉移酶(Alamine Aminotransferase，ALT)、堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，ALP)、谷氨酰轉肽酶(Gamma Glutamyl Transpeptidase，GGT)和腫瘤標志物AFP、SF含量。結果：與正常對照組比較，模型組大鼠血清ALT、ALP、GGT、AFP、SF含量均明顯升高(P<0.05)，差異具有統計學意義。與模型組比較，刺血預防組大鼠血清ALT、ALP、GGT、AFP、SF含量均降低(P<0.05)，差異有統計學意義。結論：刺絡瀉血療法對HCC的發展有一定程度的抑制作用，其作用機制可能與降低血清肝功能指標，保護肝臟，下調腫瘤標志物AFP、SF水平有關。

關鍵詞刺絡瀉血；原發性肝癌；甲胎蛋白；鐵蛋白；大鼠

原發性肝癌是指肝細胞或肝內膽管細胞發生的癌腫，該病一般起病隱匿，發展迅速，且致死率高，因此有“癌中之王”之稱[1]。目前臨床上針對HCC的治療西醫主要采用手術切除或放、化療法，價格昂貴且不良反應較大，近年來研究顯示，中醫針灸在防治HCC方面有很好的療效[2-5]。刺絡瀉血作為針灸療法的一種，系通過三棱針或其他針具刺破人體血絡或腧穴，放出適量血液，以治療或防治疾病的方法，擁有上千年歷史，近年來在肝病防治方面，取得了一定進展，日益受到國內外的廣泛關注。

研究表明[6]，刺絡瀉血療法具有祛瘀生新、清熱解毒、消癥散結等作用，可以有效降低血清肝功及肝纖四樣的含量，促進肝星狀細胞凋亡，防治肝纖維化，而肝纖維化是肝癌癌前病變[7]，本研究擬建立DEN誘發大鼠肝癌模型，觀察肝經淺表絡脈刺血對肝功ALT、AST、GGT，及腫瘤標志物AFP、SF的影響，初步探究刺絡瀉血對HCC的預防作用及相關機制。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組清潔級雄性Wistar大鼠40只，體重(200±10)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。許可證號:SCXK(京)2012-0001。于室溫22 ℃，相對濕度45 %清潔條件下適應性喂養7 d后，采用隨機數字表將大鼠分為3組，即A.正常對照組10只；B.模型組15只；C.刺血預防組15只，實驗過程符合實驗動物倫理學相關規定。

1.2主要試劑DEN(美國Sigma公司，批號:Sigma-N0756)；ALT、ALP、GGT測定試劑盒(北京環宇金科生物醫學技術有限公司)；10%水合氯醛(北京中醫藥大學實驗室配制)；4%多聚甲醛溶液(北京百諾威生物科技有限公司)。

1.3實驗方法

1.3.1造模方法采用改良型DEN誘導的原發性肝癌大鼠模型[8]，將劑量為50 mg/kg的DEN溶于100 mg/kg生理鹽水中，配置成濃度為50.00 mg/kg的溶液，每次腹腔注射前進行大鼠體重測量，以確定注射量，2次/周，每次間隔3～4 d(約84 h)，連續4周后改為1次/周，以保證大鼠生存率，連續13周誘癌成功。造模成功指征：造模大鼠出現精神萎靡，毛發黃，體重減輕，鼻腔出血、貧血、尿血、腸脹氣、腹水等并發癥，解剖肉眼觀察肝臟形態出現質地變硬，萎縮變小，表面出現大小不一的結節；肝臟組織病理切片顯示肝細胞深染、細胞核多形、腫瘤灶誘導形成。

1.3.2干預方法刺血預防組在造模開始同時，取后肢肝經淺表絡脈刺血，75%乙醇消毒。持針法：拇、食指持針，中指抵住針尖上方，一是控制針刺方向，二是控制針刺深度；進針法：小號三棱針直刺進針，迅速出針，以出血為度；出血量：少量，兩穴總計0.5 mL，3次/周。模型組腹腔注射DEN，正常組同一部位注射生理鹽水，3組予相同時間相同方法抓取固定。

1.3.3標本采集與檢測13周后，各組大鼠禁食、不禁水12 h，10 %水合氯醛麻醉，腹主動脈取血5 mL，靜置離心(4 ℃，3 500 r/min，10 min)后取上層血清送肝功及相關腫瘤標志物指標檢測，采用ELISA法測定。脫頸、開腹，觀察記錄各組肝臟的形態、顏色、質地。取肝組織用4%多聚甲醛緩沖液固定24 h，常規石蠟包埋，切片，HE染色。

2結果

2.1各組大鼠血清肝功能ALT、ALP、GGT比較與正常對照組相比，模型組大鼠血清ALT、ALP、GGT含量顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，刺血預防組大鼠血清ALT、ALP、GGT含量均降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1　各組大鼠血清肝功能指標比較±s)

注:與正常對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

圖1　各組大鼠血清肝功能指標比較

2.2各組大鼠血清腫瘤標志物AFP、SF比較與正常對照組相比，模型組大鼠血清AFP、SF含量顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，刺血預防組大鼠血清AFP、SF含量均降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

3討論

中醫以辨證論治為核心，是目前治療HCC的重要方法之一，將其與手術，放、化療有機結合，有助于減少放、化療的毒副反應，穩定病情，提高生存質量。此外，中醫提倡未病先防，既病防變，其重在調體，在癌癥的預防和抗復發方面優勢亦顯著。HCC可歸屬于中醫“脅痛、積聚、鼓脹”等范疇，其基本病理變化為正氣不足，氣滯、血瘀、痰結、濕聚、熱毒等相互膠著，日久漸積成塊。而“久病必瘀”，瘀血貫穿肝癌發病始終，本虛標實是其基本病機[9]。張從正認為：“出血者，乃所以養血也”，瀉血即為扶正，瘀血不除，新血難生，刺血療法可以祛瘀生新,祛邪扶正，正好針對原發性肝癌的病因病機。

表2　各組大鼠血清腫瘤標志物指標比較±s)

注:與正常對照組比較,**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

圖2　各組大鼠血清腫瘤標志物指標比較

按照世界衛生組織關于疾病和有關健康問題的國際統計分類(ICD10)對疾病的分類，發現刺血療法適宜病種共涉及18大類系統，262個病種。其中包括“癥瘕”“積聚”，而原發性肝癌屬于中醫學“癥瘕”“積聚”范疇，所以可以認為是刺血療法的適應證之一。刺血治療腫瘤病，早在《黃帝內經》年代就有記載，《靈樞?九針論》曰：“八風之客于經絡之中，為瘤病者也，故為之治針，必甬其身而鋒其末，令可以瀉熱出血而癌病竭”。

AFP、SF等是當前HCC實驗室診斷常用指標[10-11]，AFP被認為是HCC診斷和預后的首選標志物[12]。SF為第二肝癌腫瘤標志物，特別是對AFP陰性者[13]。SF在肝臟合成，肝病肝細胞受損，清除SF障礙，或癌細胞合成SF量增加，均可導致血清SF高濃度表達[14-15]。本研究結果顯示，相較正常對照組，模型組與預防組大鼠AFP、SF含量均有不同程度升高，說明兩組大鼠肝臟都存在不同程度的惡變；但與模型組比較，刺血預防組AFP、SF水平均顯著降低，且差異有統計學意義，提示刺絡瀉血在一定程度上起到了有效減輕并預防肝癌發生發展的作用，其機制可能與降低AFP、SF含量，祛瘀生新，促使癌毒及代謝產物排泄有關。ALT、ALP、GGT最能反映肝細胞受損程度，是目前最常用的肝功能指標,血清GGT主要來源于肝臟，具有癌胚蛋白的性質，與AFP聯合檢測對HCC早期診斷具有較高的準確性[16-17]。本實驗采用幾項指標聯合檢測方法，可有效提高診斷靈敏度，減少單一檢測漏診率。

現代醫學研究表明，刺絡放血可使瘀滯在局部的病理性產物得以清除，改善微循環障礙，保護肝臟，提高機體免疫力，緩解疼痛[18]。田葉紅[19]等采用刺血拔罐治療癌性不全性腸梗阻21例，有效率達71.4%。本研究結果也顯示刺絡瀉血療法可使侵入機體的毒邪隨血排出，通過祛瘀生新，理血調氣，調節臟腑功能，激發機體免疫力，從而抑制毒邪的擴展與再生，一定程度上降低腫瘤標志物相關指標，保護肝臟，對HCC發生發展起到預防并延緩的作用。刺絡瀉血療法是一種天然針刺療法，因其“簡、便、廉、驗”的特點而應用于臨床各個系統百余種疾病的防治和保健[20-22]，值得進一步繼承和發展，但刺絡瀉血療法的操作方法缺乏統一規范，其作用機理仍待深入探討。

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(2015-12-05收稿責任編輯：張文婷)

Research on the Influence of Pricking Blood on Colleterals Therapy on Serum AFP and SF in the Rat Model of Primary Liver Cancer

Wu Yun1,Zhao Huiling1,Liu Xinyan1,Wei Ke2,Chen Zichen1,Tan Li1,Zhan Huimin1

(1SchoolofAcupuncture-MoxibustionandTuina,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China;2FengtaiIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicineHospital,Beijing100072,China)

AbstractObjective:To observe the effect of pricking blood on colleterals therapy on AFP and SF in rats model of primary liver cancer (HCC),and explore its preventive effect and related mechanism.Methods:Forty healthy Wistar rats were randomly divided into control group (n=10),model group (n=15) and pricking blood group (n=15).In addition to the control group,the other two groups were injected with DEN (Diethylnitrosamine) intraperitoneally to establish liver cancer model.Rats in pricking blood group was performed of blood letting on the superficial veins of hind leg along the liver meridian,0.5 mL each time and 2 times per week,till the eighteenth week.At the end of the week,taking 5 mL blood from the abdominal aorta and using ELESA method to determine ALT (Alamine Amino Transferase),ALP (Alkaline Phosphatase),GGT (Gamma Glutamyl Transpeptidase),AFP and SF levels in serum.Results:Compared with the control group,the serum levels of ALT,ALP,GGT,AFP and SF in model group were significantly increased,and the difference was statistically significant (P<0.05).Compared with the model group,the serum levels of ALT,ALP,GGT,AFP and SF in the prevention group were lower,and the difference was statistically significant (P<0.05).Conclusion:Blood pricking on colleterals therapy has inhibitory effect on HCC,which might due to the fact that it can decrease the liver serum levels and tumor signals AFP and SF.

Key WordsBlood pricking on colleterals therapy; Primary liver cancer; AFP; SF; Rats

作者簡介:吳云(1988.11—)，女，碩士，北京中醫藥大學，研究方向：刺絡瀉血療法作用機理研究，E-mail：1002375051@qq.com 通信作者：趙慧玲(1957.7—)，女，主任醫師，教授，北京中醫藥大學，研究方向：刺絡瀉血療法的文獻、實驗及臨床研究，E-mail：zhaohuiling3895@sohu.com

中圖分類號：R245

文獻標識碼：A

doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.06.032