姜黃素聯(lián)合吉西他濱對肝癌細(xì)胞HepG2增殖、凋亡的影響

陜西省腫瘤醫(yī)院內(nèi)一科(西安 710061)

李　旭　安改麗△　王玉珍　李　楠▲

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姜黃素聯(lián)合吉西他濱對肝癌細(xì)胞HepG2增殖、凋亡的影響

陜西省腫瘤醫(yī)院內(nèi)一科(西安 710061)

李旭安改麗△王玉珍李楠▲

摘要目的：觀察姜黃素、吉西他濱單藥及聯(lián)合用藥對肝癌細(xì)胞HepG2增殖和凋亡的影響。方法：使用不同濃度的姜黃素、吉西他濱以及兩藥聯(lián)合分別作用肝癌細(xì)胞HepG2 24h、48h、72h。MTT法檢測上述藥物單用或聯(lián)用對HepG2細(xì)胞的生長抑制作用；采用流式細(xì)胞儀檢測其對HepG2細(xì)胞凋亡率的影響。結(jié)果：姜黃素、吉西他濱單藥及聯(lián)合用藥對HepG2細(xì)胞有明顯的生長抑制作用，存在時(shí)間劑量依賴關(guān)系，均可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，聯(lián)合用藥有協(xié)同作用。結(jié)論：姜黃素、吉西他濱能夠抑制HepG2細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，兩藥聯(lián)用有協(xié)同作用。

主題詞肝腫瘤，實(shí)驗(yàn)性細(xì)胞增植細(xì)胞凋亡姜黃素/藥理學(xué)@吉西他濱

惡性腫瘤是影響人類健康的最嚴(yán)重疾病之一，每年有近千萬人死于惡性腫瘤[1]。肝癌是全球常見且惡性程度很高的腫瘤, 也是我國最常見的惡性腫瘤之一，具有發(fā)病率高、病死率高、生存期短等特點(diǎn)[2]。早期肝癌可考慮手術(shù)治療，但因其起病隱匿，早期癥狀不典型，發(fā)現(xiàn)時(shí)多已是晚期，無手術(shù)機(jī)會，治療以藥物治療為主，且療效不佳[3]。祖國醫(yī)學(xué)博大精深，中醫(yī)中藥在腫瘤治療中有毒副作用相對較小、安全性高等特點(diǎn)。中醫(yī)及中西醫(yī)結(jié)合的方法在肝癌治療中也越來越受到重視。姜黃素作為中藥姜黃主要活性提取物, 有類非甾體類抗炎藥(NSAIDs)的作用特點(diǎn)[4]。近年來其抗腫瘤作用被醫(yī)學(xué)專家廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)姜黃素對包括膀胱癌、乳腺癌、肝癌等在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞有增殖抑制作用[5-6]。姜黃素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是其抗腫瘤作用的重要機(jī)制，涉及一系列復(fù)雜的生物學(xué)過程，并受細(xì)胞內(nèi)外多種途徑及信號分子調(diào)控，不同的途徑所表現(xiàn)形式不同，它們之間有交叉，有重疊，構(gòu)成了錯綜復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本研究主要探討姜黃素、吉西他濱單用及聯(lián)合用藥對人肝癌細(xì)胞HepG2體外增殖及凋亡的影響，為臨床中西醫(yī)結(jié)合治療肝癌提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1材料與儀器肝癌細(xì)胞株HepG2(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室惠贈)；RPMI 1640培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)；噻唑蘭(MTT)(美國Sigma公司)；二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma公司)；Annexin-V/PI雙染凋亡試劑盒(深圳晶美生物公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱( 美國Thermo 公司)；Genios 多功能酶標(biāo)儀( 美國TECAN 公司)；倒置顯微鏡( DXM1200) 為日本Nikon 公司產(chǎn)品; 流式細(xì)胞儀為美國BD Calibur 產(chǎn)品。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)：采用含10%小牛血清的RMPI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)肝癌細(xì)胞HepG2，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，其貼壁生長至70%～80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2細(xì)胞增殖檢測：取對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞HepG2以約1×104/ml密度接種于96孔板上，分別加入不同濃度的姜黃素(2.5 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、40mmol/L)、吉西他濱(2.5 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L)和兩藥聯(lián)合(姜黃素10 mmol/L+吉西他濱10 mmol/L)進(jìn)行干預(yù)，每組5個復(fù)孔。以含相同濃度DMSO的培養(yǎng)液為對照，分別于培養(yǎng)24h、48h、72h后每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 ml，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)上清液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min，充分溶解結(jié)晶物。用多功能微板測試系統(tǒng)于490 nm處測定OD值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。抑制率(%)=(1-試驗(yàn)孔平均OD 值/對照孔平均OD值)×100%

2.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡：取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞消化后2 ml/孔接種至6孔板內(nèi)，細(xì)胞濃度控制在1×106個/ml，分別加入濃度為10mmol/L 的CUR、GEM、CUR+GEM處理組藥物分別處理HepG2細(xì)胞48h 后，收集各處理組HepG2細(xì)胞, 用PBS 洗滌二次收集細(xì)胞, 加入500μl Binding Buffer和FITC標(biāo)記的Annexin V(20mg/ml)10ml，室溫避光30min，再加入PI(50 mg/ml)5ml，避光反應(yīng)5min后，立即用FACS進(jìn)行流式細(xì)胞儀定量檢測(一般不超過1h)，同時(shí)以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為對照。進(jìn)行流式細(xì)胞儀的觀察和檢測。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，組間比較采用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

結(jié)果

1姜黃素對HepG2細(xì)胞增殖的影響分別用不同濃度姜黃素處理肝癌細(xì)胞HepG2 24h、48h、72h后得到濃度-抑制率曲線圖(圖1)：可見姜黃素對肝癌細(xì)胞HepG2增殖具有明顯的抑制作用，隨著藥物濃度的增大，抑制率明顯增高；48h和72h的抑制率明顯高于24h，呈時(shí)間與劑量依賴性。

2吉西他濱對HepG2細(xì)胞增殖的影響分別用不同濃度吉西他濱處理肝癌細(xì)胞HepG2 24h、48h、72h后得到濃度-抑制率曲線圖(如圖2)：可見吉西他濱對肝癌細(xì)胞HepG2增殖具有明顯的抑制作用，隨著藥物濃度的增大，抑制率明顯增高；48h和72h的抑制率明顯高于24h，即呈時(shí)間與劑量依賴性。

3姜黃素聯(lián)合吉西他濱對HepG2細(xì)胞增殖的的影響姜黃素、吉西他濱和姜黃素聯(lián)合吉西他濱對HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用(圖3)：可見姜黃素、吉西他濱及二藥聯(lián)合組對HepG2肝癌細(xì)胞都具有明顯的生長抑制作用，聯(lián)合用藥組的抑制率明顯高于單藥組。

圖1　不同濃度姜黃素對肝癌細(xì)胞的濃度-抑制率曲線

圖2　不同濃度吉西他濱對肝癌細(xì)胞的濃度-抑制率曲線

圖3　不同實(shí)驗(yàn)組對細(xì)胞的時(shí)間-抑制率曲線

4不同實(shí)驗(yàn)組對肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響用流式細(xì)胞儀檢測HepG2細(xì)胞在不同作用條件下48h后的凋亡率。結(jié)果(圖4)：可見對照組與用藥組比較, HepG2 細(xì)胞的凋亡率較低, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。姜黃素、吉西他濱單藥組與聯(lián)合用藥組比較, HepG2細(xì)胞的凋亡率較低, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明姜黃素可誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)凋亡作用不及吉西他濱，但作為天然藥物，通過聯(lián)合用藥可增加其誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的的作用。

圖4　不同實(shí)驗(yàn)組作用于肝癌HepG2細(xì)胞48h后的凋亡圖及凋亡率比較(與CON組相比,*P<0.05；與CUR組相比,# P<0.05；與GEM組相比,ΦP<0.05)

討論

腫瘤細(xì)胞是體內(nèi)具有無限增殖能力的細(xì)胞，腫瘤的發(fā)生不僅與細(xì)胞增殖有關(guān)，也與細(xì)胞凋亡失衡有關(guān)。抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)凋亡是目前抗腫瘤治療的熱點(diǎn)。中藥及其提取物的抗腫瘤作用已經(jīng)得到醫(yī)學(xué)專家的的廣泛認(rèn)可，開展其抗癌機(jī)制研究，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和理論價(jià)值。姜黃素作為從姜科植物黃姜根莖中提取的黃色酸性多酚類物質(zhì)，不僅具有降脂、抗炎、抗氧化、抗病毒和預(yù)防突變等多種藥理活性，也具有明顯的抗腫瘤活性[8],且具安全性高、不良反應(yīng)小等特點(diǎn)。目前,研究者普遍認(rèn)為姜黃素抗腫瘤機(jī)制可能主要與抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)，通過調(diào)控線粒體凋亡通路及死亡受體通路在內(nèi)的多條信號傳導(dǎo)通路，引起腫瘤細(xì)胞凋亡；其抗腫瘤療效確切，通過多個環(huán)節(jié)作為作用靶點(diǎn)起到抗腫瘤作用。他們各種途徑之間存在著直接或間接的聯(lián)系，單獨(dú)或協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用。王威等[9]研究現(xiàn)實(shí)，通過MTT法檢測姜黃素對肝癌細(xì)胞有明顯的生長抑制作用，隨著劑量增加，其效應(yīng)也相應(yīng)增加，電鏡結(jié)果顯示經(jīng)姜黃素作用后癌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，凋亡多見。胡慶華[10]等研究顯示，姜黃素對宮頸癌HeLa有明顯的抑制作用，作用機(jī)制可能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡有關(guān)。趙琳琳[11]等研究顯示，姜黃素對肝癌細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，并能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與下調(diào)Wnt /β-catenin信號通路有關(guān)。邱偉等[12]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素不僅抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖，并且可以通過下調(diào)COX-2及侵襲相關(guān)分子MMP-2及MMP-9的表達(dá)來抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。研究發(fā)現(xiàn)姜黃素對多種腫瘤有顯著的抑制作用。姜黃素在發(fā)揮抗腫瘤治療效果的同時(shí)，對正常細(xì)胞并無明顯毒副作用，應(yīng)用于人類十分安全，因而具有良好的臨床應(yīng)用潛力。

我們的實(shí)驗(yàn)通過MTT法檢測姜黃素、吉西他濱單藥及聯(lián)合用藥干預(yù)肝癌HepG2細(xì)胞的抑制率，結(jié)果顯示單用及聯(lián)合用藥都對HepG2細(xì)胞有明顯的生長抑制作用，且存在時(shí)間-劑量等效應(yīng)關(guān)系。采用 AnnexinV/FITC雙染色法檢測細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示姜黃素、吉西他濱可以誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡，聯(lián)合時(shí)作用更為明顯，存在協(xié)同作用。姜黃素對肝癌HepG2細(xì)胞有明顯的生長抑制作用，其作用機(jī)制可能與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)，然而姜黃素對肝癌HepG2細(xì)胞具體的抗癌機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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(收稿:2016-01-08)

通訊作者：▲西安市兒童醫(yī)院

【中圖分類號】R392.5

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.07.05

Effects of curcumin combined with gemcitabine on the proliferation and apoptosis of hepatocarcinoma cells HepG2 in vitro

Department of First Internal Medicine, Shaanxi Province Tumor Hospital(Xi’an 710061)

Li XuAn Gaili Wang Yuzhenet al

ABSTRACTObjective：To study the effect of curcumin (CUR), gemcitabine(GEM)and their synergergistic(CUR+GEM) effect on proliferation and apoptosis of Hepatocarcinoma cells HepG2. Methods:HepG2 was treated with CUR,GEM and CUR+GEM at different concentration and different time,HepG2 cells were tested for proliferation activity by MTT assay, and analyzed for apoptosis rate by flow cytometry. Results:CUR, GEM and CUR+GEM produced time-and dose-dependent inhibition of HepG2cells. CUR+GEM showed a higher apoptosis rate induction than CUR or GEM alone (P <0.05). Conclusion: CUR and GEM both have the effect of inhibition on the proliferation and induction of apoptosis in Hepatocarcinoma cells HepG2. Combining application can enhance apoptosis.

KEY WORDSLiver neoplasms,ExperimentalCell proliferationApoptosisCurcumin/pharmacology@Gemcitabine

△ 陜西省人民醫(yī)院