采用微衛星DNA標記分析皖南中蜂小群保種效果

孟祥金++吉挺++沈芳

摘要：利用篩選后的12對熒光標記微衛星引物分析皖南中蜂野生群與皖南中蜂保種場保種群，探討小群保種效果。共檢測確定60個個體基因型，通過計算2 個群體的優勢等位基因頻率（Pi）、期望雜合度（He）、多態信息含量（PIC）、群體內近交系數（Fis）分析了皖南中蜂群體內和群體間的遺傳變異，采用配對試驗均數差異t檢驗，比較了保種群體與野生群體的遺傳差異。結果表明：保種群體與野生群體間的Pi 無顯著性差異（P=0.440>0.05）；He略高于野生群體，差異均不顯著（P=0.122），PIC 顯著高于野生群體（P=0.047>0.05）；Fis顯著高于野生群體（P=0.019<0.05）。結果說明，皖南中蜂采用小群保種效果良好。

關鍵詞：皖南中蜂；微衛星DNA；遺傳多樣性；保種效果

中圖分類號： S892文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0062-03

皖南中蜂是中華蜜蜂的重要組成，皖南中蜂具有適應性強、嗅覺靈敏、善于利用零星蜜粉源、抗病蟲害、群勢強、產量高等優良性狀[1]。皖南中蜂已被農業部和安徽省列入第一批“地方畜禽保護品種名錄”。但是長期以來，由于保種經費不足，加上西方蜜蜂的大量飼養，皖南中蜂群數銳減[2]。近幾年安徽中鋒開始實行小群保種。

微衛星是目前普遍使用的分子遺傳標記方法，具有多態性好、共顯性、易于鑒定、檢測重復性好以及基因組中分布廣泛等優點。聯合國糧農組織（FAO）在其持續發展和管理動物遺傳資源的戰略計劃中，推薦將微衛星標記作為優先考慮的分析工具[2-3]。近幾年來微衛星標記已廣泛應用于我國各地蜜蜂種質資源分析，但是目前普遍采用聚丙烯酰胺電泳加放射顯影或銀染的方法，不僅費時費力效率低，而且誤差較大[4-6]。本研究利用篩選后的12對熒光標記微衛星引物，對保種場與野生種群遺傳多樣性進行比較分析，旨在初步評價小群保種的效果，繼而探討小群保種的可能性。

1材料和方法

1.1試驗材料

本研究所用皖南中蜂為皖南地區保種場群體和原產地野生群體，各隨機選取30群，每群隨機采集成年工蜂10只，用無水乙醇溶液浸泡保存。

1.2試驗方法

1.2.1基因組DNA提取基因組DNA提取參照吉挺等所建立的方法[7]，提取的基因組DNA用微量紫外可見分光光度計（NanoDrop ND-1000）測定含量與純度，-20 ℃保存備用。

1.2.2常規引物的篩選根據課題組成員對中華蜜蜂轉錄組測序結果[8]所獲得的3 000多個微衛星位點進行篩選，選擇的原則為等位基因數目多，具有高度多態性，結合GenBank和相應文獻提供的微衛星引物對所選54對引物進行優化，進一步篩選出30對擴增效果較好的微衛星引物。引物均由生工（上海）生物工程服務有限公司（Sangon）提供。

1.2.3PCR反應體系與產物擴增由于PCR反應中影響因素較多，試驗分別設計了以DNA模板濃度、Mg2+濃度、Taq酶用量、退火溫度為因素的梯度試驗，最終確定PCR的反應體系。PCR反應體系：10×buffer 2.0 μL，25 mmol/L MgCl2 1.0 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，10 pmol/μL 上游引物 1.0 μL，10 pmol/μL下游引物1.0 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL，100 ng/μL DNA模板 1.0 μL，超純水 13.3 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性50 s，（59～62） ℃（因不同引物而異）退火50 s，72 ℃延伸 50 s，共30個循環；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存（Eppendorf，Mastercycler pro S）。

1.2.4聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測和硝酸銀染色配制3%瓊脂糖凝膠，點樣6 μL，120 V電泳20 min，檢查產物的有無。如有產物，配制8%聚丙烯酰胺凝膠80 mL體系，100 V預電泳5 min，點樣10 μL，120 V電泳3 h。進行硝酸銀染色，直至出現清晰的等位基因條帶。

1.2.5熒光引物的篩選和組合根據聚丙烯酰胺凝膠電泳的結果，盡量選擇不同染色體上的引物進行標記，淘汰掉無法擴增以及無多態性的引物，最終選出相對較理想的12對多態性較豐富的微衛星引物（表1）。每對引物的上游 5′ 端分別用熒光染料FAM（藍色）、HEX（綠色）、TAMRA（黃色）進行標記，獲得的熒光標記引物避光保存。按照微衛星引物的堿基長度進行組合，為了區分得精確一些，組合的引物長度至少相差20 bp，獲得的5個熒光標記微衛星引物組合信息見表1。

1.2.6熒光PCR產物STR分型PCR熒光產物送至生工（上海）生物工程有限公司進行STR分型，使用ABI-3730XL DNA Analyzer全自動測序儀檢測。上樣的總體積為13 μL， 其中的上樣液Hi-Di Formamide 10 μL，GS-500 Size Standard 0.5 μL，另外的3 μL為混合PCR產物。將Hi-Di Formamide 和GS-500 Size Standard混合均勻后與等量的同一個體的PCR產物進行混合，然后進行個體編號，依次加樣到96孔板，接著變性和檢測。檢測結束后，使用GeneMapper 4.0軟件自動生成獨立的圖譜文件，讀取出片段長度、峰值和峰面積，判斷純合子和雜合子（單峰為純合子，雙峰為雜合子），最后導出Excel數據表格。

1.3群體內遺傳多樣性分析

1.3.1等位基因頻率

Pi=（2nii+nij1+nij2+…+nijn）/（2N）。

式中，Pi為第i個等位基因頻率，nii為第i個等位基因純合個數，jn為與i共顯的第n個等位基因，nijn為含i與jn共顯的等位基因個體數，N為群體中個體數。

1.3.2雜合度

He=1-∑ki=1Pi2。

式中：k為等位基因數，Pi為第i個等位基因頻率。

1.3.3多態信息含量

PIC=1-∑ki-1Pi2-∑k-ti-1∑kj=i+12Pi2Pj2=2∑k-ji=1∑kj=i+1PiPj（1-PiPj），

式中：k為等位基因數，Pi為第i個等位基因頻率，Pj為第j個等位基因頻率。

1.3.4群體內近交系數

Fis=（Hs-Ho）/Hs。

式中：Ho為觀察雜合度，Hs為平均期望雜合度。

1.6.5統計分析利用Microsatellite-Toolkit軟件根據GeneMapper 4.0軟件導出的Excel表格來計算等位基因頻率與期望雜合度，根據Botestein等的公式[9]設計、計算群體的多態信息含量，再根據FSTAT程序[10]計算群體內近交系數。

2結果與分析

2.1中華蜜蜂基因組DNA提取結果

將提取的基因組DNA經TE過夜溶解后，用DanoDrop-1000濃度檢測儀測定其吸光曲線與濃度。由圖1可見，曲線平滑單峰，D260 nm/D280 nm介于1.8～20之間，滿足微衛星位點序列擴增的要求。

2.2熒光PCR擴增產物檢測分型結果

圖2-A中個體G位點核心序列相差7 bp，表現為雙峰，為雜合子，基因型為133/140。圖2-B圖中個體為單峰，純合子，基因型為142。均無雜峰污染，擴增效果良好。

2.3保種場群體與原產地野生群體優勢等位基因的比較

2個中蜂群體優勢等位基因及其頻率見表2。由表2可見，利用配對試驗均數差異雙尾t檢驗對2個群體優勢等位基因頻率進行處理，結果P=0.44>0.05，即2個群體在這12個微衛星標記檢測出的優勢等位基因上的差異不顯著。

2.4基因庫保種群體與保種場He、PIC、Fis

由表3可見，保種場的平均He為0.530 9，略高于原產地野生群（0.473 5）、對2個群體的He進行t檢驗，結果顯示，2個群體間無顯著差異（P=0.122）。保種場群體PIC、Fis 分別為0.530 9、0.407 2，均高于原產地野生群（0.422 5、0.123 8），t檢驗結果顯示，保種場群體和野生群體之間差異顯著（P值分別為0.047、0.019）。

3討論

當前保種方法有活體保種、冷凍保種和生物技術保種3種方法，活體保種包括原產地保種和異地保種2種方式，活體保種是目前中華蜜蜂保種的唯一方式。本研究對皖南中蜂保種場和原產地野生群進行分析研究，旨在為今后中華蜜蜂的保種工作提供參考依據。

群體中的優勢等位基因是物種中最原始、最保守的等位基因，其余等位基因均是由該等位基因突變形成的，因此微衛星的多態性可以反映物種的進化史[11]。本研究中保種場和原產地野生群之間優勢等位基因頻率存在差異，但是差異不顯著（P=0.440>0.05），表明保種場保種方式有效地保存了皖南中蜂的種質特征。期望雜合度是衡量遺傳變異程度的最佳參數；多態信息含量表示微衛星DNA變異程度的高低，反映群體內個體遺傳變異的程度，數值越高表明變異程度越高。本研究中保種場He、PIC均高于原產地野生群，表明保種場群體的遺傳多樣性得到了很好的保存。

本研究對皖南中蜂保種場和原產地野生群進行遺傳多樣性檢測分析。結果表明，皖南中蜂保種場和原產地野生群之間的Pi、He均差異不顯著，PIC顯著增加，Fis顯著上升。其中，保種場群體的He略高于原產地，PIC顯著高于原產地；表明基因庫通過利用群體內隨機交配和家系間隨機交配高效保持了保種群體的多樣性。出眾的飛翔能力使得蜂王在野生狀態獨特的自然環境中可以和其他起源的雄蜂發生基因交流，所以Fis很低；但是保種場群體有限，蜂王雄蜂的交配又難以控制，最終導致Fis顯著升高；這提醒我們在以后的保種工作中應該擴大群體規模，采用人工授精技術，準確記錄系譜資料，并且根據群體的具體情況適當引入雄蜂血統，避免近交對保種效果的不利影響，降低Fis，有效避免近交衰退。

綜上所述，本研究利用篩選的12對微衛星DNA標記分析皖南中蜂保種群和原產地群體的遺傳多樣性，對皖南中蜂保種效果進行評價。結果表明，皖南中蜂遺傳多樣性豐富，具有很高的保種價值；同時也表明對地方中蜂品種進行小群保種是可行的，為更好地評價、保護和利用我國的中蜂資源提供一定的科學依據。

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