微量肉湯稀釋法在腸桿菌科細菌藥敏試驗中的應用研究

吳倩倩孫銘艷王保強王 楠陶元勇*

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微量肉湯稀釋法在腸桿菌科細菌藥敏試驗中的應用研究

吳倩倩①孫銘艷②王保強②王 楠②陶元勇②*

［摘要］目的：對微量肉湯稀釋法檢測抗菌藥物最低抑菌濃度（MIC）的準確性進行評價，為其應用推廣奠定基礎。方法：收集351株腸桿菌科細菌，采用微量肉湯稀釋法和自動化儀器法檢測抗菌藥物的MIC，比較兩者藥敏結(jié)果的一致性。結(jié)果：微量肉湯稀釋法與自動化儀器法的藥敏結(jié)果比較差異無統(tǒng)計學意義，兩種方法的藥敏檢測結(jié)果無明顯的差異。結(jié)論：微量肉湯稀釋法具有較高的準確性，利用該方法檢測抗菌藥物MIC的成本低于自動化儀器法，藥物選擇更加靈活，可應用于常規(guī)工作，為臨床合理使用抗生素提供依據(jù)。

［關鍵詞］微量肉湯稀釋法；自動化儀器法；腸桿菌科細菌

吳倩倩，女，（1990- ），碩士研究生。濰坊醫(yī)學院醫(yī)學檢驗學系，研究方向：感染性疾病實驗診斷、細菌分類鑒定及耐藥性。

［First-author’s address］ Department of Medical Laboratory， Weifang Medical University， Weifang， Shandong 261053，China.

腸桿菌科細菌是引起醫(yī)院感染的重要病原菌，其分離率＞50%，可致化膿性疾病、肺炎、腦膜炎、菌血癥以及傷口、泌尿道和腸道的感染。然而近年來隨著抗生素的廣泛應用，腸桿菌科細菌的耐藥率持續(xù)上升［1］。細菌藥敏試驗是檢測抗菌藥物在體外對細菌有無抑制的方法，細菌藥敏試驗的方法有紙片擴散法、肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法、Etest法以及自動藥敏儀法。由于紙片擴散法、稀釋法等傳統(tǒng)方法具有操作簡單、成本低廉的特點，是目前常用的藥敏試驗方法，但是檢測結(jié)果容易受到多方面因素的影響［2］。自動化儀器法具有便捷、快速的特點，但其成本較高［3］。本研究對351株腸桿菌科細菌，分別采用微量肉湯稀釋法、自動化儀器法測定其藥敏結(jié)果，測定抗菌藥物的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），并統(tǒng)計分析兩種方法檢測藥敏結(jié)果的一致性。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院2015年1-6月的351株腸桿菌科，去除同一患者相同部位的重復菌株，經(jīng)細菌分析儀鑒定確認。質(zhì)量控制菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希菌ATCC25922和大腸埃希菌ATCC35218（為監(jiān)控β-內(nèi)酰胺類/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑紙片用），肺炎克雷伯菌ATCC70060、陰溝腸桿菌ATCC700323均購自國家衛(wèi)生計生委臨檢中心。

1.2 儀器及試劑

采用梅里埃VITEK2 compact自動細菌鑒定儀（法國）；HNTD5-TDR比濁儀（北京）和xk細菌鑒定分析儀（鑫科生物技術股份有限公司，山東）。使用的10 ml樣本稀釋液、15 ml肉湯稀釋液、微量肉湯稀釋法藥敏反應板（96孔）、鹽水分配器、無菌試管、移液器、GN革蘭陰性細菌鑒定卡以及AST-GN革蘭陰性細菌藥敏卡均來自法國梅里埃公司。

1.3 藥敏試驗方法

1.3.1 微量肉湯稀釋法

取樣本稀釋液（10 ml/瓶）1支，使用無菌接種環(huán)，從待檢細菌的平板中挑取待檢菌落，加入樣本稀釋液中，制成約0.5麥氏單位均勻的菌懸液備用。使用微量移液器吸取已制備好的菌懸液30 μl加入至對應的培養(yǎng)基內(nèi)（15 ml/瓶的培養(yǎng)液），進行稀釋并混勻，配制成藥敏增菌液，再按每孔100 μl的量，使用微量移液器吸取藥敏增菌液加入到其余各孔內(nèi)，蓋好盒蓋。將接種完畢的試劑盒放入37 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18～24 h后取出試劑盒，打開細菌鑒定和（或）藥敏分析儀軟件點擊“鑒定”鍵，選擇與生化鑒定組一致的“患者的檢驗編號”，打開試劑盒進出倉蓋，放在試劑盒托盒上并固定，蓋上試劑盒進出倉蓋；點擊“自動分析”后儀器自動分析結(jié)果。

1.3.2 自動化儀器法

取無菌試管2支，使用鹽水分配器各取3 ml的生理鹽水加入試管中，使用無菌接種環(huán)，從待檢細菌的平板中挑取待檢菌落，比濁儀配制0.5麥氏單位均勻的菌液。使用微量移液器吸取145 μl的菌液到藥敏管中，配成藥敏菌液，將菌液管和藥敏管中分別放入相應的GN革蘭陰性細菌鑒定卡及AST-GN革蘭陰性細菌藥敏卡，經(jīng)VITEK2 compact自動細菌鑒定儀檢測鑒定其藥敏結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0對檢測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，兩種方法的準確性比較采用x2檢驗，α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腸桿菌科細菌的分布及構成比

本研究共分離非重復性腸桿菌科細菌351株，前6位細菌依次為大腸埃希菌（占57.55%）、肺炎克雷伯菌（占13.96%）、奇異變形桿菌（占9.12%）、陰溝腸桿菌（占6.84%）、產(chǎn)酸克雷伯菌（占3.99%）以及普通變形桿菌（占%1.99），菌株的分布及構成比見表1。

表1 腸桿菌科細菌的分布及構成比(%)

2.2 質(zhì)量控制菌株的MIC測定

藥敏試驗孔濁度100%落于質(zhì)量控制范圍內(nèi)，抑菌圈直徑相差≤2 mm，總的敏感、中介和耐藥的符合率為100%。采用微量肉湯稀釋法與自動化儀器法檢測351株腸桿菌科細菌對13種抗菌藥物進行質(zhì)量控制菌株的MIC測定，其中第6號抗菌藥物的兩種方法比較差異有統(tǒng)計學意義（x2=6.029，P＜0.05），其余12種抗菌藥物均無差異，見表2。

表2 微量肉湯稀釋法及自動化儀器法檢測13種抗菌藥物的藥敏試驗結(jié)果

3 討論

微量肉湯稀釋法是將抗菌藥物包被在反應孔中，每種抗菌藥物按從高到低的濃度梯度排列，不同抗菌藥物采用不同的濃度梯度，抗菌藥物濃度以2的倍數(shù)遞增。反應板中均設有陽性對照孔和陰性對照孔，以幫助判斷結(jié)果，保證結(jié)果的準確性。加入菌液孵育18～24 h后，通過檢測反應孔中菌液的濁度，判斷是否有細菌生長，從而測得該藥物的MIC。

WHO推薦使用的藥敏試驗是K-B法，其優(yōu)點是簡單及藥物選擇靈活性強［4］。K-B法是通過測量抗菌藥物抑菌環(huán)的大小來判斷抗菌藥物的敏感情況，是一種定性試驗，耗時長，不能及時報告細菌的藥敏結(jié)果［5］。20世紀末，Craig［6］的一項調(diào)查表明，藥敏方法的選擇趨向于定量技術，即測定MIC。微量肉湯稀釋法是通過測定MIC來判斷細菌對抗菌藥物敏感情況，是一種定量的方法，既快速又準確。

本研究選用兩種方法檢測351株腸桿菌科細菌的藥敏結(jié)果，經(jīng)x2檢驗，微量肉湯稀釋法與自動化儀器法測定12種抗生素的藥敏結(jié)果的差異無統(tǒng)計學意義，僅有1種抗生素有差異，可認為兩者的結(jié)果具有一致性，即微量肉湯稀釋法的藥敏結(jié)果基本可靠。自動化檢測系統(tǒng)其優(yōu)點是快速，并具有強大的統(tǒng)計分析功能，但自動化儀器也有一定的局限性，首先儀器的成本高，其次藥物的選擇缺乏靈活性，再者檢測一些特殊菌的耐藥性時有困難［7］。微量肉湯稀釋法較自動化法成本低，可根據(jù)臨床用藥習慣選擇藥物，能夠檢測一些厭氧菌及苛養(yǎng)菌。微量肉湯稀釋法的試劑板基本能滿足臨床常見細菌的鑒定和藥敏試驗，可根據(jù)CLSI標準設計藥敏板和報告軟件［8］。

本研究結(jié)果顯示，分離菌中居前6位的分別是大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、奇異變形桿菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)酸克雷伯菌以及普通變形桿菌，與呂媛等［9］2010年原衛(wèi)生部全國細菌耐藥檢測報告一致，表明以上6種細菌是腸桿菌科最常見的分離菌。

研究表明，革蘭陰性菌的臨床分離率高于革蘭陽性菌，其中革蘭陰性菌中腸桿菌科的分離率最高，故本研究選用腸桿菌科細菌作為研究對象，可使研究結(jié)果更具有臨床價值［10］。大腸埃希菌是腸桿菌科細菌中分離率最高的細菌，近年來隨著抗生素的濫用，產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌不斷增加，大腸埃希菌的高分離率和產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的增多，要求藥敏檢測應準確可靠［11］。

4 結(jié)語

隨著抗生素的廣泛應用，臨床耐藥菌株不斷的增加，藥敏試驗的作用顯得十分重要。藥敏試驗結(jié)果直接指導臨床用藥，故其準確性至關重要［12］。本研究結(jié)果表明，微量肉湯稀釋法檢測抗菌藥物的MIC，是一種操作簡便、成本低、準確性高和適合于常規(guī)檢測的方法。

參考文獻

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①濰坊醫(yī)學院醫(yī)學檢驗學系 山東 濰坊 261053

②濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科 山東 濰坊 261053

［文章編號］1672-8270（2016）05-0097-03 ［中圖分類號］ R446.5

［文獻標識碼］A

DOI:10.3969/J.ISSN.1672-8270.2016.05.030

作者簡介

收稿日期：2016-01-20

*通訊作者：taoyuanyong@163.com

Application of micro broth dilution method in the drug sensitivity test of enterobacteriaceae bacteria

WU Qian-qian， SUN Ming-yan， WANG Bao-qiang， et al

China Medical Equipment，2016，13（5）:97-99.

［Abstract］ Objective: To evaluate the accuracy of minimal inhibitory concentration（MIC） of anti-microbial agents by micro broth dilution method to popularize in application. Methods: 351 strains of enterobacteriaceae bacteria were collected in our hospital from January 2015 to June. The MIC of antibacterial drugs was measured by the two methods， including micro broth dilution method and automatic instrument method， in order to compare the consistency of the results of drug sensitivity. Results: There is no significant difference between the results of the drug sensitivity of the micro broth dilution method and the automatic instrument method. Conclusion: It shows that the micro broth dilution method has higher accuracy. The cost of detecting the MIC of antibacterial drugs is lower than that of automatic instrument. And it is more flexible in drug election. This method can provide the basis for rational use of antibiotics in clinic and can be used in regular work.

［Key words］Micro broth dilution method； Automatic instrument method； Enterobacteriaceae bacteria