NOD小鼠調節性T細胞的功能表型分析

吳　玲

(宣城市中心醫院　內三科，安徽　宣城　242000)

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·基礎醫學·

NOD小鼠調節性T細胞的功能表型分析

吳玲

(宣城市中心醫院內三科，安徽宣城242000)

【摘要】目的：比較和探討NOD(Non-Obese Diabetic)小鼠與正常BALB/C小鼠脾臟中CD4+CD25+調節性T細胞(regulatory T cell，Treg)的功能表型分子、抑制性細胞因子的表達差異及意義。方法：采用流式細胞檢測技術，測定NOD小鼠(實驗組)和正常BALB/C小鼠(對照組)脾臟中 Treg細胞(CD4+CD25+Foxp3+)的比例、功能表型分子(CTLA-4、GITR)和抑制性細胞因子(IL-10、TGF-β)的表達比例和平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)。結果：NOD小鼠脾臟中 CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例與對照組相比無顯著差異,但Foxp3+的MFI顯著降低；NOD小鼠Treg細胞表達CTLA-4、GITR、IL-10、TGF-β均發生不同程度降低。結論：NOD小鼠Treg細胞功能表型分子表達下降，提示其免疫抑制功能降低，這可能與Ⅰ型糖尿病(type Ⅰ diabetes mellitus，T1DM)的發病有一定關系。

【關鍵詞】1型糖尿病；NOD小鼠；調節性T細胞

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.03.004

Ⅰ型糖尿病(type Ⅰ diabetes mellitus，T1DM)是一種自身免疫性疾病，其免疫學致病機制主要是由于自身反應性T細胞的活化導致胰島β細胞的破壞，造成胰島素的絕對缺乏最終引起血糖升高。全球Ⅰ型糖尿病發病率逐年增加，主要好發于兒童及青少年[1-2]，我國2010年成年人群患病率高達11.6%，是發病率增長最快的國家之一[3]。T1DM嚴重危害患者的健康，可引起機體多器官功能障礙，甚至器官衰竭；此外，患者須進行持續性治療，也是其終生沉重的經濟負擔。因此，Ⅰ型糖尿病的研究十分重要。

CD4+CD25+調節性T細胞(Treg細胞)是1995年發現的一類重要的T細胞亞群，其對于機體維持耐受，保持免疫平衡至關重要。Treg細胞大致可分為2群：胸腺來源的天然Treg細胞(natural Treg，nTreg)和外周誘導的Treg細胞(induced Treg，iTreg)。Foxp3+(transcription factor forkhead box p3)是Treg細胞極其重要的標志性核心轉錄因子，對于誘導Treg細胞形成調節性表型，啟動其各類抑制性細胞因子的表達和分泌，從而發揮免疫學抑制作用至關重要[4-6]。

一系列研究結果表明，在一些自身免疫性疾病中，Treg細胞數量或免疫抑制功能顯著下降，從而導致免疫效應細胞過度活化，促進了自身免疫性疾病的進展。亦有研究表明，T1DM的發病與Treg細胞功能受到抑制相關。因此本文以NOD小鼠為T1DM模型，主要采用流式細胞術檢測小鼠脾臟Treg細胞的表型和功能相關分子，進一步闡明Treg細胞在T1DM發病過程中的確切作用，希望將來能夠為T1DM的免疫治療提供可能的靶點。

1材料與方法

1.1實驗動物和主要試劑SPF級雌性BALB/C小鼠、NOD小鼠均購自上海斯萊克實驗動物有限公司。以下用于流式細胞術的抗小鼠的熒光標記抗體均購自eBioscience公司：PerCP-cy5.5-anti-CD3、FITC-anti-CD4、APC-anti-CD25、PE-anti-Foxp3+、PE-anti-CTLA-4、PE-anti-GITR、PE-anti-IL-10、PE-anti- TGF-β、同型對照抗體；RPMI 1640及胎牛血清(FBS)購自GIBCO公司；離子霉素(ionomycin)和佛波酯(PMA)購自Sigma公司；破膜固定試劑盒購自BD公司。

1.2制備脾的單細胞懸液15周齡的NOD小鼠及BALB/C小鼠麻醉后，無菌分離小鼠脾臟，研磨后用200目尼龍濾膜過濾。用紅細胞裂解液(KHCO3，10.0 mmol/L；NH4Cl，155 mmol/L；EDTA，0.1 mmol/L；pH 7.2～7.4)去除紅細胞，再用PBS重懸后計數。

1.3細胞染色及檢測分析每只小鼠取脾細胞(2×106個)于15 mL離心管中，離心(4℃、1500 r/min、5 min)，去上清；用100 μL Staining Buffer重懸細胞沉淀，加入1 μg PerCP-cy5.5-anti-CD3、0.25 μg FITC-anti-CD4、0.125 μg APC-anti-CD25，4℃，避光孵育30 min。以下操作視檢測指標而定：①檢測細胞核內轉錄因子Foxp3+：加入破膜固定試劑，4℃，避光孵育1 h；再加入1 μg Fc阻斷劑，4℃，避光孵育15 min；最后加入1 μg PE-anti-Foxp3+，4℃，避光孵育30 min。②檢測功能表型分子CTLA-4和GITR：分別加入0.25 μg PE-anti-CTLA-4或0.04 μg PE-anti-GITR，4℃，避光孵育30 min。③檢測細胞因子IL-10和TGF-β：在所有熒光抗體染色前，須先加入離子霉素(1 μg/mL)、佛波酯(50 ng/mL)、Golgistop(1 μL/mL)刺激脾細胞6 h；然后再按如上方法標記表面分子CD3、CD4、CD25；再按如下方法進行破膜固定；最后分別加入0.125 μg PE-anti-IL-10或0.5 μg PE-anti-TGF-β。所有染色步驟的最后用500 μL Staining Buffer重懸細胞沉淀，上流式細胞儀(FACSCalibur，BD公司)進行檢測，并用Flowjo 7.6.5軟件分析。分析時，先通過FSC/SSC設門于淋巴細胞，然后再設門于CD3+CD4+CD25+T細胞，最后在此設定門內分別分析Foxp3+、CTLA-4、GITR、IL-10、TGF-β。

1.4統計學分析數據表達以均數±標準差表示。采用SPSS 11.5統計軟件分析，兩組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1CD3+CD4+CD25+Treg細胞設門方法先通過散射光組合設門法(前向/側向散射光)圈定淋巴細胞群(主要含T、B淋巴細胞)，再分別通過細胞分子標記進一步圈定CD3+T細胞、CD3+CD4+CD25+Treg細胞(圖1)。

圖1CD3+CD4+CD25+Treg細胞設門方法

2.2NOD小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例及Foxp3+的MFINOD小鼠脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例與正常BALB/C小鼠相比并無顯著性差異(圖2A、2B；t=0.888，P=0.409)；但是NOD鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的Foxp3+的MFI顯著低于正常BALB/C小鼠(圖2A、2C；t=6.172，P=0.001)。

2.3NOD小鼠CD4+CD25+CTLA-4+Treg細胞、CD4+CD25+GITR+Treg細胞比例及CTLA-4、GITR的MFICTLA-4和GITR是與Treg細胞免疫抑制功能密切相關的重要分子標記。NOD小鼠脾臟中CD4+CD25+CTLA-4+Treg及CD4+CD25+GITR+Treg細胞比例均顯著低于正常BALB/C小鼠(圖3A、3B、3D、3E；t=6.167、P=0.001vst=4.902、P=0.003)；而且，這兩群細胞CTLA-4及GITR的MFI同樣顯著低于正常BALB/C小鼠(圖3C、3F；t=4.922、P=0.003vst=9.204、P=0.000)。

A. CD4+CD25+Foxp3+Treg的代表性流式結果圖；B.比例統計圖；C.MFI 統計圖。

圖2NOD小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例及Foxp3+的MFI

A.CD4+CD25+CTLA-4+Treg的代表性流式結果圖；B.比例統計圖；C.MFI 統計圖；D.CD4+CD25+GITR+Treg的代表性流式結果圖；E.比例統計圖；F.MFI 統計圖。

圖3NOD小鼠CD4+CD25+CTLA-4+Treg、CD4+CD25+GITR+Treg細胞比例及CTLA-4、GITR的MFI

2.4NOD小鼠CD4+CD25+IL-10+Treg細胞、CD4+CD25+TGF-β+Treg細胞比例及IL-10、TGF-β的MFIIL-10、TGF-β是Treg細胞發揮免疫抑制功能的主要效應細胞因子。NOD小鼠脾臟中CD4+CD25+IL-10+Treg及CD4+CD25+TGF-β+Treg細胞比例均顯著低于正常BALB/C小鼠(圖4A、4B、4D、4E；t=4.824、P=0.003vst=5.483、P=0.002)；而且，這兩群細胞IL-10和TGF-β的MFI也同樣顯著低于正常BALB/C小鼠(圖4C、4F；t=5.074、P=0.002vst=4.057、P=0.007)。

A.CD4+CD25+IL-10+Treg的代表性流式結果圖；B.比例統計圖；C.MFI 統計圖；D.CD4+CD25+TGF-β+Treg的代表性流式結果圖；E.比例統計圖；F.MFI 統計圖。

圖4NOD小鼠CD4+CD25+IL-10+Treg細胞、CD4+CD25+TGF-β+Treg細胞比例及IL-10、TGF-β的MFI

3討論

T1DM主要是由于T細胞進行性損傷胰島β細胞導致的自身免疫性疾病。不同于其他自身免疫性疾病模型，NOD小鼠與人類T1DM發病極其類似，其T1DM的發生、發展均為自發性，80%的雌性NOD小鼠在出生12周后發生自發性糖尿病，因此是一種非常好的研究人類T1DM的動物模型[7]。

Treg細胞是免疫系統中一群具有廣泛免疫抑制力的細胞，可對多種免疫細胞發揮抑制作用，屬于免疫系統中非常關鍵的負調節機制之一[8-9]。Treg細胞功能若受到損害，會導致機體喪失免疫平衡，從而促進多種自身免疫病或炎癥性疾病的發生，如T1DM、類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡等[9-12]。先前已有研究發現，與正常人相比，T1DM病人外周血中Treg細胞的抑制能力是減弱的[10]。本研究通過NOD小鼠模型，進一步從核心功能轉錄因子Foxp3+、功能表型分子、抑制性細胞因子多個層面證明了NOD小鼠脾臟中Treg的抑制功能的不足。

Foxp3+是Treg細胞最重要的特征性標記，也是最為關鍵的核轉錄因子，對于Treg細胞的發育、分化、功能維持都很重要。Foxp3+可誘導Treg細胞表達一系列免疫抑制功能相關分子，如CD25、CTLA-4(cytotoxic T lymphocyte antigen-4)、GITR(glucocorticoid-induced TNF-receptor-related protein)，提示Treg具有免疫抑制活性[13-14]。具有免疫抑制活性Treg細胞既能以細胞接觸的方式通過CTLA-4發揮抑制效應，又可通過分泌抑制性細胞因子IL-10、TGF-β、IL-35發揮抑制效應[15]。本研究與別的學者研究結果一致[10]，NOD小鼠脾臟中CD4+CD25+Treg細胞中Foxp3+的細胞比例，與正常對照組小鼠相比并無顯著差異，但是Foxp3+的MFI卻顯著低于對照組小鼠。此結果提示，雖然NOD小鼠脾臟中Treg細胞比例(或數量)未發生變化，但是Treg細胞的免疫抑制功能是降低的。進一步實驗證明，與Treg細胞功能有關的兩個主要的表面分子CTLA-4和GITR，兩者在Treg細胞中的比例和表達水平均顯著降低。最后，本研究還檢測了Treg細胞的IL-10和TGF-β表達水平，結果均與前面一致，NOD小鼠的Treg細胞表達此兩種抑制性細胞因子的水平均顯著降低。

總之，本研究從分子水平上進一步證實了NOD小鼠體內Treg細胞的免疫抑制功能有所降低，這無疑有利于自身反應性T細胞的激活和擴增，促進細胞免疫所介導T1DM的發生和進展，有效彌補Treg細胞的抑制功能不足，對T1DM的預防和治療起重要作用。

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Analysis on the function and phenotype of regulatory T cells in non-obese diabetic mice

WU Ling

Department of 3rd Internal Medicine,Xuancheng Central Hospital,Xuancheng 242000,China

【Abstract】Objective：To compare the expression of surface functional molecules and immunosuppressive cytokines(CD4+CD25+) of regulatory T cells(Tregs) in non-obese diabetic(NOD) mice and BALB/C mice.Methods:The percentage and expression intensity of key transcription factor Foxp3+,surface molecules (CTLA-4,GITR) and cytokines (IL-10 and TGF-β) of CD4+CD25+ Tregs in spleen of mice were determined with fluorescent antibody staining and analyzed by flow cytometry.Results:There was no significant difference in the percentage of CD4+CD25+Foxp3+ Tregs between NOD and control mice.However,CD4+CD25+ Tregs in NOD mice had led to significantly reduced expression levels of Foxp3+,surface molecules (CTLA-4,GITR) and cytokines (IL-10 and TGF-β),when expressed as the mean fluorescence intensity (MFI) respectively.Conclusion:Our findings confirmed impaired function of CD4+CD25+ Tregs in NOD mice that may facilitate the pathogenesis of T1DM.

【Key words】type 1 diabetes mellitus; non-obese diabetic mice; regulatory T cell

文章編號：1002-0217(2016)03-0219-04

收稿日期：2015-11-25

作者簡介：吳玲(1983-)，女，住院醫師，(電話)18956308288，(電子信箱)xcwuling@163.com.

【文獻標識碼】【中圖號】R 392;R 587.1A