人乳頭瘤病毒HPV E6/E7 mRNA檢測在宮頸病變診斷中的價值

徐　多,何蓮芝

(皖南醫學院第一附屬醫院 弋磯山醫院　婦產科，安徽　蕪湖　241001)

?

·臨床醫學·

人乳頭瘤病毒HPV E6/E7 mRNA檢測在宮頸病變診斷中的價值

徐多,何蓮芝

(皖南醫學院第一附屬醫院 弋磯山醫院婦產科，安徽蕪湖241001)

【摘要】目的：評估HPV E6/E7 mRNA在宮頸病變診斷中的價值。方法：選取弋磯山醫院2014年9月～2015年9月HPV DNA陽性且TCT檢測為慢性宮頸炎患者197例，行HPV E6/E7 mRNA及陰道鏡下宮頸組織病理學檢測。結果：197例HPV陽性患者中，HPV E6/E7 mRNA的陽性率為62.44%，敏感度為91.18%，特異度為52.17%，陽性預測值為50.14%，陰性預測值為91.89%。不同組織學分級中，HPV E6/E7 mRNA的陽性表達率在宮頸炎組與CINⅠ組、宮頸炎組與Ⅱ組、宮頸炎組與Ⅲ組均具有統計學差異(P<0.01)。HPV E6/E7 mRNA檢測與病理學診斷符合率為90%。結論：HPV E6/E7mRNA的表達與宮頸病變密切相關，可用于評估宮頸癌的發病風險。在早期或低級別病變中，HPV E6/E7 mRNA檢測對預測高級別宮頸上皮內瘤變的發生有著重要作用。

【關鍵詞】人乳頭瘤病毒；HPV E6/E7 mRNA；子宮頸上皮內瘤樣病變

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.03.007

宮頸癌是目前女性最常見的惡性腫瘤之一，且是目前所有癌癥中唯一病因明確、可以早期預防和治療、并能根除的癌癥[1]。研究表明，高危型人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)的持續感染是導致宮頸癌發生的必要因素[2]。HPV是一組雙鏈DNA病毒，其基因組可分為早期轉錄區(E區)、晚期轉錄區及上游調節區，其中早期轉錄區的E6和E7為病毒的癌基因，可干擾細胞周期，抑制細胞凋亡，與腫瘤的發生與發展密切相關。E6 蛋白通過招募E6AP 泛素酶[4]，與E6 相關蛋白(E6 associated protein，E6-AP) 結合到 p53 ，使p53失活，E7蛋白通過與視網膜母細胞瘤蛋白pRb結合，使停止分裂的細胞重新進入S期，從而促進細胞增殖[5]。目前臨床上較多采用HPV DNA 聯合細胞學檢測篩查宮頸癌，然而此類方法均以病毒DNA為檢測目標，以此判定病毒類型及負荷量。實際上宮頸細胞病變并不僅與病毒類型及負荷量有關，更與致癌基因的活動程度關系密切。HPV E6/E7蛋白作為病毒活動指標，對HPV的致癌活動程度具有非常重要的臨床輔助診斷價值[6]。本文采用支鏈DNA(b-DNA)技術檢測HPV E6/E7 mRNA,對實驗結果進行分析，探討HPV E6/E7 mRNA在宮頸病變診斷中的價值。

1資料與方法

1.1一般資料選取弋磯山醫院2014年9月～2015年9月HPV DNA陽性且TCT檢測為慢性宮頸炎患者197例，排除有免疫抑制、慢性疾病、宮頸上皮內瘤變(CIN)治療史者。所有患者同時行HPV E6/E7 mRNA及陰道鏡下宮頸組織活檢，以組織學結果為金標準進行比較分析。根據宮頸組織病理學結果分為CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組。

1.2方法

1.2.1樣本采集患者檢查前3 d不使用陰道內藥物，不做陰道沖洗，24 h內禁止性生活，并在非經期檢查。窺陰器暴露宮頸后，使用宮頸細胞專用采樣刷插入宮頸口旋轉3～5周，停留10 s,將刷頭放入裝有專用保存液的瓶內并編號。

1.2.2HPV E6/E7 mRNA檢測將采集樣本倒入15 mL離心管，3000 r/min離心5 min后倒掉上清液，用2 mL蒸餾水清洗后再次離心，去上清液，加入300 μL裂解劑和3 μL蛋白酶K，放入65℃恒溫箱30 min,取出后收集上清液，采用高危HPV E6/E7 mRNA檢測試劑盒進行檢測，操作步驟嚴格按照說明書進行，經計算機軟件自動讀取HPV E6/E7 mRNA拷貝數值。

1.2.3病理組織學檢查所有197例患者均行陰道鏡檢查，先用低倍鏡觀察宮頸外觀、顏色、血管及有無白斑。3%醋酸棉球浸濕宮頸表面，3 min后觀察上皮血管，再用復方碘溶液棉球浸濕宮頸。在陰道鏡圖像異常區或碘實驗陰性區取多點活檢，若鏡下為正常轉化區，則分別在3、6、9、12點處取活檢。

1.3診斷標準

1.3.1組織學診斷按照世界衛生組織2004年病理組織學分類標準，根據細胞異型性程度和范圍的不同，依次診斷為：慢性宮頸炎、宮頸上皮內瘤樣病變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)Ⅰ級(CINⅠ)、宮頸上皮內瘤樣病變Ⅱ級(CIN Ⅱ)、宮頸上皮內瘤樣病變Ⅲ 級(CIN Ⅲ)及鱗癌(SCC)。

1.3.2HPV E6/E7 mRNA的檢測結果由計算機軟件自動讀取，將拷貝值≥1為陽性判斷標準。低危風險(1～4000拷貝)；中危風險(4000～10 000拷貝)；高危風險(﹥10 000拷貝)。

1.4統計學方法采用SPSS 18.0統計軟件對所有數據進行運算，不同病理級別E6/E7 mRNA檢出率差別采用配對χ2檢驗，檢驗標準α=0.05。

2結果

2.1HPV E6/E7 mRNA檢測對宮頸病變的診斷價值197例HPV DNA陽性患者中，HPV E6/E7 mRNA陽性共123例，陰性74例；組織病理結果為慢性宮頸炎129例，CIN 68例，其中HPV E6/E7 mRNA陰性，組織病理結果為CIN 6例。HPV E6/E7 mRNA的敏感度為91.18%(62/68)，特異度為52.17%(68/129)，陽性預測值為50.14%(62/123)，陰性預測值為91.89%(68/74)，相較于HPV DNA34.51%(68/197)的陽性預測值，HPV E6/E7 mRNA的陽性預測值高于HPV DNA，且有較高的敏感度及陰性預測值。

圖1HPV E6/E7 mRNA在正常宮頸組織中的陰性表達(Elivision染色)

圖2HPV E6/E7 mRNA在CIN組織中的陽性表達(Elivision染色)

2.2HPV E6/E7 mRNA檢測與宮頸上皮內瘤變之間的關系197例宮頸組織標本中，檢測出 HPV E6 /E7 mRNA陽性標本123例，陽性率62． 44%，其中宮頸炎組61例(47.29%)，CINⅠ組21例(87.50%)，CINⅡ組18例(94．74%)，CINⅢ組23例(92．00%)。見表1。

表1各組宮頸病變中HPV E6/E7 mRNA的表達率

病理分型例數陽性數陽性率/%炎癥組1296147.29CINⅠ組242187.50CINⅡ組191894.74CINⅢ組252392.00

由表1可知，炎癥組分別與CIN各組陽性率差異具有統計學意義(χ2值依次為11.59、13.14、15.11,P均<0． 01)；而CIN各組兩兩之間陽性率差異無明顯統計學意義(P>0．05)。

2.3HPV E6/E7 mRNA風險程度與宮頸病變之間的關系197例HPV DNA陽性患者中，根據組織病理結果，上皮內瘤樣病變Ⅰ級(CIN Ⅰ)為低級別病變，上皮內瘤樣病變Ⅱ級(CIN Ⅱ)及以上為高級別病變。根據HPV E6/E7 mRNA檢測拷貝值 ，低危風險103例(其中病理組織學正常60例，低級別病變 20例，高級別病變23例)，中危風險組 13例(病理組織學結果低級別病變1例，高級別病變12例)，高危風險組7 例(病理組織學結果正常1例，高級別病變6例)陽性率85.71%。其中病理診斷為高級別病變20例，HPV E6/E7 mRNA檢測為中危組以上為18例，HPV E6/E7 mRNA檢測與病理學診斷符合率為90%。

3討論

宮頸病變的主要原因是HPV感染，研究發現，99.7%的宮頸癌患者均具有HPV的感染[6]。然而從HPV感染進展到宮頸癌需經過很長一段時間。HPV感染后可在體內長期處于潛伏狀態，90%的 HPV感染者可通過自身免疫功能進行清除，只有5%～10%的高危持續感染者進展為宮頸癌[7]。宮頸上皮內瘤變反映了宮頸癌發生發展的連續過程，HPV 感染也是 CIN 進展為宮頸癌的重要誘因[8]。高危型HPV可產生E6和E7兩種癌蛋白，E6蛋白使p53失活，從而使細胞轉向惡性增殖。同時E6 蛋白與PDZ 蛋白結合,介導PDZ 蛋白的降解，PDZ蛋白功能與細胞信號轉導、細胞黏附等相關。PDZ蛋白水平的降低被認為在宮頸癌的發展過程中起了重要作用。E6蛋白也可以直接激活端粒酶，導致細胞永生化，從而導致宮頸癌的發生。E7蛋白可與pRb結合，降低抑癌基因的活性，使pRb/E2F 復合物分解，釋放E2F1，促進細胞增殖[9]。

本研究采用b-DNA 技術檢測了HPV陽性患者中HPV E6/E7 mRNA的表達。結果表明，宮頸炎癥組的HPV E6/E7 mRNA 陽性表達率顯著低于宮頸病變組，在高級別病變中(CINⅡ及以上)的表達率也明顯高于低級別病變(CIN Ⅰ)。宮頸組織標本病理分級與 HPV E6/E7 mRNA 表達量成正相關。由此可見，HPV E6/E7 mRNA能夠更好評估宮頸癌發病風險。Ratnam等[10]研究發現HPV E6/E7 mRNA陽性率隨著宮頸病變的加重而增加，本研究中HPV E6/E7 mRNA在炎癥組、CINⅠ～ Ⅲ 組中的陽性率分別為47.29%、87.50%%、94.74%、92.00%，炎癥組和CINⅠ組、CIN Ⅱ組、CIN Ⅲ組之間陽性率差異具有統計學意義；且在陽性預測值上，HPV E6/E7 mRNA優于HPV DNA檢測，本文結論與相關文獻報道相符[11]。HPV感染人群中，有80%的感染者兩年內會自行消退，從HPV感染到宮頸病變的發生，需歷經數年。HPV E6/E7 mRNA是病毒癌基因轉錄產物，表現癌基因活性，故相對于HPV DNA檢測，有更精準更直接的意義。有研究表明，在鑒別短暫的宮頸異常與可能進一步發展的宮頸病變中，HPV E6/E7 mRNA檢測相比HPV DNA檢測有著更高的特異度，可以降低HPV DNA檢測陽性給患者所帶來的心理負擔[12]。可以預見，經過大規模樣本累計后，對于存在HPV感染的患者，而細胞學檢測正常時，HPV E6/E7 mRNA 表達量的高低對是否經行陰道鏡檢查甚至宮頸組織活檢具有重要臨床應用價值，可以達到分流門診HPV感染及早期或低級別宮頸病變患者的目的。因此， HPV E6/E7 mRNA 表達量的定量檢測，對于早期及時發現、預防、治療宮頸癌、協助臨床診斷、評估宮頸癌發病風險及預后有著重要的意義。

【參考文獻】

[1]郎景和．子宮頸上皮內瘤變的診斷與治療[J]．中華婦產科雜志，2001，36(5)：261-263．

[2]SCHIFFMAN M，WENTZENSEN N．Human papillomavirus infection and the multistage carcinogenesis of cervical cancer[J]．Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2013，22：553-560．

[3]GOLDBERG RM，MEROPOL NJ，TABERNERO J，etal．Ac-complishments in 2008 in the treatment of advanced metastatic colorectal cancer[J]．Gastrointest Cancer Res，2009，3(Suppl 2)：S23-S27.

[4]MASSIMI P,SHAI A,LAMBERT P,etal.HPV E6 degradat ion of p53and PDZ containingsubstrat es in anE6AP null background [J].Oncogene,2008,27(12):1800-1804.

[5]DARNELL GA,SCHRODER WA,ANTALIS TM,etal.Human papillomavirus E7 requires the protease calpain to degrade the retinoblastoma protein[J].J Biol Chem,2007,282(52):37492-34500.

[6]KRAUS I，MOLDEN T，HOLM R，etal．Presenee of E6 and E7 mRNA from human papillomavirus types 16，18，31，33 and 45 in the majority of cervical carcinomas [J]．J Clin Microbiol，2006，44：1310-1331.

[7]DOORBAR J.Molecular biology of human papillomavirus infection and cervical cancer[J].Clin Sc(Lond),2006,110(5):525-541.

[8]CASTLE PE，SHABER R，LA MERE BJ，etal．Human papillomavirus(HPV) genotypes in women with cervical precancer and cancer at Kaiser Permanente Northern California [J]．Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2011，20(5):946-953．

[9]賈政軍，周玉春，胡蓉，等．HPV mRNA 實時熒光定量 PCR檢測及其與宮頸癌發生的關系[J]．實用預防醫學，2012，19(3):354 - 358．

[10] RATNAM S,C′OUTLEE F,FONTAINE D,etal.Clinical performance of the PreTect HPV-Proofer E6/E7 mRNA assay in comparison with that of the Hybrid Capture 2 test for identification of women at risk of cervical cancer[J].Journal of clinical microbiology,2010,48(8):2779.

[11] SPATIS A,KOTTARIDI C,CHRANIOTI A,etal.mRNA and DNA detection of human papillomaviruses in women of all ages attending two colposcopy clinics [J].PloS One,2012,7(11):e49205.

[12] M?CKEL J,QUASS J,MEISEL H,etal.Human papillomavirus E6/E7 mRNA testing has higher specificity than liquid-based DNA testing in the evaluation of cervical intraepithelial neoplasia[J].Anal Quant Cytol Histol,2011,33(6):311-315.

Value of human papillomavirus E6/E7 mRNA detection in diagnosis of cervical lesions

XU Duo,HE Lianzhi

Department of Gynecology & Obstetrics,The First Affiliated Hospital of Wannan Medical College,Wuhu 241001,China

【Abstract】Objective：To assess the value of human papilloma virus(HPV) E6/E7 mRNA detection in the diagnosis of cervical lesions.Methods:A total of 197 HPV positive cases confirmed as chronic cervicitis by Thin-prep liquid-based Cytology Test(TCT) were included from Yijishan Hospital of Wannan Medical College between September of 2014 and 2015,and all patients were given further detection of HPV E6/E7 mRNA as well as colposcopy and cervical biopsy.Results:In the 197 cases,positive HPV E6/E7 mRNA was 62.44%,and mRNA sensitivity was 91.18%; specificity,52.17%; positive predictive value,50.14%; negative predictive value,91.89%.By histological grading,the difference was significant regarding the positive rate of HPV E6/E7 mRNA between inflammatory group and cervical intraepithelial neoplasia(CIN)Ⅰ,CIN Ⅱor CIN Ⅲ(P<0.01).The result of HPV E6/E7 mRNA expression was consistent with that of pathological findings in 90% of the cases.Conclusion:HPV E6/E7 mRNA expression is closely correlated with cervical lesions,and can be a useful tool to assess the risks of malignancy.Particularly,HPV E6/E7 mRNA detection can competently predict high grade CIN from early or low grade cervical lesions.

【Key words】human papillomavirus; HPV E6/E7 mRNA; cervical intraepithelial neoplasia

文章編號：1002-0217(2016)03-0230-04

收稿日期：2015-12-06

作者簡介：徐多(1989-)，女，2013級碩士研究生，(電話)13866372153，(電子信箱)xdwnyxy@163.com;

【文獻標識碼】【中圖號】R 737.33A

何蓮芝，女，主任醫師，(電子信箱)429094335@qq.com，通訊作者.