一株抗真菌毛霉的分離鑒定及其抗菌活性檢測

程群仙,孫褔琴 ， 吳方方， 張　玉， 王　雅， 楊　成

(皖南醫學院　1.臨床醫學院；2.微生物學與免疫學教研室，安徽　蕪湖　241002)

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一株抗真菌毛霉的分離鑒定及其抗菌活性檢測

程群仙1,孫褔琴1， 吳方方1， 張玉1， 王雅1， 楊成2

(皖南醫學院1.臨床醫學院；2.微生物學與免疫學教研室，安徽蕪湖241002)

【摘要】目的：分離和識別一株抗真菌毛霉菌,并測試其抗菌活性。方法：采用稀釋平板涂布法分離土壤中真菌；以杯碟法初步測定發酵液抗真菌活性；通過菌落及孢子進行形態學鑒定；以薄層色譜-生物自顯影技術分離檢測抗菌活性成分。結果：從土壤中分離出一株對白色念珠菌具有較強抑制活性的菌株F1，抑菌圈直徑為20.5 mm，形態學初步鑒定為毛霉；該毛霉發酵液乙酸乙酯相在甲醇∶三氯甲烷(1∶4)展開系統，結果顯示有兩個組分對白色念珠菌具有抑制活性，其Rf值分別為0.15和0.6。結論：來自土壤的毛霉發酵液乙酸乙酯相具有抑制白色念珠菌的活性組分。

【關鍵詞】毛霉；薄層層析；生物自顯影；抗菌成分檢測

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.03.028

近年來，隨著抗生素、皮質類固醇激素、免疫抑制劑及抗腫瘤藥物的廣泛使用，器官移植、介入性治療手段的開展，惡性腫瘤、艾滋病、糖尿病及人口老年化等原因，念珠菌等深部真菌感染發病率呈迅速上升趨勢，并成為導致這類患者死亡的主要原因之一[1]。隨著大量廣譜性抗真菌藥物的應用，臨床上又出現大量抗藥性的念珠菌等耐藥菌株，因此，尋找新型有效的抗真菌藥物成為研究熱點[2]。另一方面，由于微生物種類及代謝產物種類多，繁殖迅速等特點，一直被認為是發現新型抗菌藥物的重要途徑之一[3]。然而，要從眾多的微生物次生代謝產物中篩選、分離和提取有效的抗菌成分，建立靈敏、方便、快捷的活性檢測方法就顯得尤為重要。為此，本實驗采用稀釋平板涂布法分離來自土壤的腐生真菌，利用杯碟法對分離出的真菌菌株進行抗菌活性初篩，結合薄層層析-生物自顯影 (TLC-Bioautography)技術[4-5]，對其活性成分進行分離并測定，為后期分離純化該活性成分提供實驗依據。

1材料與方法

1.1儀器與試劑MJ-160B型霉菌培養箱(上海躍進醫療器械廠)；GWP-P80A型隔水式恒溫培養箱(合肥華德利科學器材有限公司)；RE-52CS型旋轉蒸發儀(上海亞榮儀器設備有限公司)；81M/SHZ-D(Ⅲ)型循環水式多用真空泵(鞏義市科瑞儀器有限公司)；FA2004型電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)；WFH-203B暗箱式三用紫外分析儀(上海精科實業有限公司)；P-1型薄層色譜雙槽層析缸(上海壘固儀器有限公司)；牛津杯(南京泰勒生物儀器有限公司)。

噻唑藍[3-(4,5-Dimethyl-2-Thiazolyl)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide,MTT]購自美國Amresco公司；氯霉素、制霉菌素購自上海瑞楚生物科技有限公司；GF254薄層硅膠板購自青島海浪硅膠干燥劑有限公司；甲醇、乙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷等均為國產分析純。

1.2指示菌白色念珠菌(Candidaalbicans)，皖南醫學院微生物學與免疫學教研室提供。

1.3培養基分離養基：蛋白胨 5 g，葡萄糖 10 g，磷酸二氫鉀 1 g，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.5 g，瓊脂 20 g，氯霉素 0.1 g(乙醇溶)，水 1000 mL。液體發酵培養基：蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，酵母浸粉10 g，水 1000 mL。固體培養基：蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，瓊脂20 g，酵母浸粉10 g，水 1000 mL。半固體培養基：蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，瓊脂10 g，酵母浸粉10 g，水 1000 mL。

1.4方法

1.4.1土壤真菌分離、純化及形態學鑒定采用稀釋涂布平板法[6]，取土樣稀釋程度為10-3、10-4、10-5各200 μL涂布到分離培養基上，每個濃度重復1次，將平板倒置于28 ℃霉菌培養箱中培養5 d。利用固體培養基對分離的真菌進行純化培養，保存待篩。并依據參考文獻[7-8]，對篩選后活性菌株進行形態學鑒定。

1.4.2抗真菌活性菌株篩選

1.4.2.1活性菌株代謝產物粗提物樣品制備采用液體培養基，將純化待篩的菌株接種于裝液為200 mL的500 mL 三角搖瓶中，靜置于28 ℃霉菌培養箱中培養20 d。采用真空抽濾法將菌絲與發酵液分離，濾液50 ℃減壓旋轉蒸發濃縮至20 mL、4 ℃保存待測。

1.4.2.2杯碟法篩選活性真菌無菌操作臺內，以白色念珠菌為指示菌，將白色念珠菌菌苔刮入無菌水后，配成108個/mL 的菌懸液。取該菌懸液200 μL均勻涂布于固體平板培養基上。用鑷子夾取牛津杯放置平皿菌層上，加入待測樣品(樣品量與杯面平齊為準)。最后將平皿放入37 ℃ 恒溫培養箱中培養24 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑的大小，以確定樣品抑菌活性。

1.4.3薄層色譜-生物自顯影技術分離篩檢活性菌株中活性成分

1.4.3.1活性菌株薄層色譜樣品準備利用液體培養基對活性菌株進一步放大到1000 mL進行培養，取濾液50 ℃減壓旋轉蒸發濃縮至200 mL，用乙酸乙酯等體積萃取2次，合并萃取液，并分別對乙酸乙酯相和水相進行減壓旋轉蒸發濃縮至干，加少許甲醇溶解，并采用杯碟法以甲醇為空白對照，測試水相和乙酸乙酯相抗菌活性。

1.4.3.2薄層色譜層析展開劑篩選與優化參照文獻[9]方法，選擇和優化展開劑。

1.4.3.3薄層色譜-生物自顯影技術篩檢抗真菌活性成分以2 mg/mL的制霉菌素甲醇溶液為陽性對照，對提取物點樣進行薄層層析展開，自然揮發干，其中一塊薄層板5%濃硫酸乙醇105 ℃顯色下觀察各成分分離情況。另一塊薄層板，無菌條件下，置入無菌直徑為13 cm平皿中，并將半固體培養基倒入其中，使培養基高出硅膠板面2 mm，待培養基在硅膠板凝固后，取108個/mL濃度的指示菌，采用玻璃噴壺向其表面噴灑指示菌，之后將平皿置于4 ℃冰箱放置2 h以利于抗菌物質擴散。然后于37 ℃培養箱中培養24 h后，取出，向上面噴施外源顯色劑噻唑藍30 min后，觀察并拍照實驗結果。

2結果

2.1抗真菌活性菌株篩選體外杯碟法抑菌實驗表明，分離的真菌中有一株真菌代謝物對指示菌白色念珠菌具有較強的抑制作用，抑菌圈分別為20.5 mm，結果如圖1A所示，命名為F1。

A：初篩實驗結果；B：提取物抑菌效果，1為發酵液乙酸乙酯相、2為水相、3為對照組甲醇相。

圖1F1提取物對白色念珠菌抑菌效果

2.2活性菌株分離、純化及鑒定利用固體培養基對F1進行培養1周，菌落直徑為7.5 cm左右，菌叢白色如棉絮，高度4 mm，菌落底部呈花瓣狀疊加，不產生色素(見圖2)；菌絲無假根，孢囊單生，繁密呈松絮狀，孢子囊頂生，呈球形，囊軸灰色，內含孢子呈橢圓形，同宗配合，生接合孢子(見圖3)。經形態分類學鑒定，該F1與毛霉屬(MucorMicheiexFries)、多籽毛霉(M.parvisporusKanouse)形態描述相似。

2.3展開劑篩選與優化經杯碟法抑菌實驗比較了F1水相和乙酸乙酯相甲醇溶解物的抗菌效果，結果表明，乙酸乙酯相的活性明顯好于水相，抑菌圈分別為23.8 mm和15.5 mm，甲醇對照組沒有出現抑菌圈，結果如圖1B所示。因此，選擇乙酸乙酯相作用薄層色譜分離對象，并對展開劑系統進行選擇優化，采用5%濃硫酸乙醇105 ℃顯色分析，獲得效果比較理想的展開溶劑系統即甲醇∶三氯甲烷=1∶4，結果如圖4A所示。

A：正面圖；B：反面圖。

圖2F1培養特征

圖3F1孢子囊與接合孢子形態(×400)

2.4薄層色譜-生物自顯影技術分離篩檢活性菌株中活性成分以制菌霉素為陽性對照，展開劑為甲醇∶三氯甲烷=1∶4，對乙酸乙酯相進行展開分離，其中一塊5%濃硫酸乙醇105 ℃顯色，結果如圖4A所示。另一塊等溶劑揮發后，進行抑菌實驗，結果如圖4B所示，指示菌對制霉菌素耐藥，沒有出現被抑制現象，而F1乙酸乙酯相具有2個明顯的活性成分，Rf值分別在0.15和0.6，提示Rf=0.15的活性成分極性相對較大，分離顯色結果推斷可能為單一成分，而Rf在0.6活性組分極性相對較小，從分離顯色效果看，效果也不是非常理想，相比于Rf為0.15組分，活性也相對較低。

A：5%H2SO4-乙醇處理加熱顯色TLC結果；B：提取物對白色念珠菌抑菌效果TLC結果；Ext：提取物乙酸乙酯相；CK+：制霉菌素陽性對照。

圖4薄層層析-生物自顯影法檢測F1提取物中抗菌成分

3討論

為有效篩選出土壤中具有抗真菌活性菌株及其中的抗菌活性成分，選擇土樣和簡單、靈敏、適用的活性篩選模型是成功的關鍵。本實驗結合以往文獻報道和腐生真菌的生境，隨機選取了濕度適中、有機質相對較為豐富的土壤樣品，采用稀釋涂布平板法分離純化并以杯碟法為活性菌株的初篩模型，以白色念珠菌為指示菌，篩選出具有抗真菌活性的菌株1株，又采用薄層層析-生物自顯影法作為活性菌株的復篩模型及其抗真菌活性組分的模型[10]。為了較全面了解活性菌株抗真菌活性，防止活性組分漏篩，采用活性追蹤方法，先對活性菌株發酵液進行乙酸乙酯萃取，將其分為水相和乙酸乙酯相，經低溫減壓濃縮甲醇溶解后再進行活性比較；在此基礎上進行活性復篩，較以往對每一種成分進行分離，再逐一生物活性測定，工作量減少了很多。結果表明，在展開劑為甲醇∶三氯甲烷=1∶4下活性菌株乙酸乙酯分離到2個具有明顯抑制白色念珠菌的活性成分，Rf值計算結果表明其中一個活性物質極性較低，Rf為0.6；另一個活性組分Rf為0.15，極性較大。因此，薄層層析-生物自顯影法對活性菌株代謝產物中抑菌活性組分的篩選測定提供了快速便捷的測試模型，也為后期柱層析分離提供參考基礎。

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Isolation and identification of an antifungal mucor and antibacterial activity test

CHENG Qunxian，SUN Fuqin， WU Fangfang， ZHANG Yu， WANG Ya， YANG Cheng

College of Clinical Medicine， Wannan Medical College，Wuhu 241002,China

【Abstract】Objective：To isolate and identify an antifungal mucor,and test its antibacterial activity.Methods：Dilution spread plate method was used to isolate the fungi from soils,and plate method was applied to determining the antifungal activity of fermentation broth.The strain was identified in compliance with the morphology and spore configuration.Thin-layer chromatography-bioautography assay was performed to detect antibacterial compound in the isolated fungi.Results：One strain mucor capable of inhibiting the growth of C.albicans with an inhibition diameter of 20.5 mm was obtained by initial morphological identification.Two antimicrobial components were extracted in ethyl acetate with expand system of methanol and chloroform(ratio:1∶4),and showed inhibitory activity against C.albicans.The retardation factor(Rf)value was 0.15 and 0.6,respectively.Conclusion：The mucor,an extraction with ethyl acetate,yields active compound against C.albicans.

【Key words】mucor; Thin-layer chromatography; bioatuography; antibacterial component; detection

文章編號：1002-0217(2016)03-0294-03

基金項目:安徽省大學生創新創業計劃訓練項目(Ap01410368083)

收稿日期：2015-11-12

作者簡介：程群仙(1993-)，女， 2012級臨床醫學專業本科生，(電話)18356975969，(電子信箱)1058969710@qq.com；

【文獻標識碼】【中圖號】R 392.33A

·大學生科技園地·

楊成，男，副教授，(電子信箱)yangcheng2003@126.com，通訊作者.