金針菇與黑木耳醇提物的抗腫瘤和抗氧化作用比較

汪璐，劉明月，謝鯤鵬，謝明杰

(遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點實驗室，遼寧 大連 116081)

金針菇與黑木耳醇提物的抗腫瘤和抗氧化作用比較

汪璐，劉明月，謝鯤鵬，謝明杰Δ

(遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點實驗室，遼寧 大連 116081)

目的 研究比較金針菇和黑木耳醇提物的抗腫瘤作用和抗氧化作用。方法 采用MTT法測定金針菇和黑木耳醇提物對MCF-7、HeLa和A375細胞的抑制作用。DPPH和FRAP法測定金針菇和黑木耳醇提物的抗氧化能力。結(jié)果 MTT結(jié)果顯示，25～400 μg/mL濃度范圍內(nèi)的金針菇和黑木耳醇提物對MCF-7、HeLa和A375細胞均有不同程度的抑制作用，金針菇的抑制作用強于黑木耳，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比，400 μg/mL金針菇醇提物對MCF-7、HeLa和A375的抑制率分別為48.20%、52.61%和50.58%(P<0.01)，相同濃度的黑木耳醇提物對MCF-7、HeLa和A375的抑制率分別為37.62%、50.21%和41.59%(P<0.01)。抗氧化結(jié)果顯示，金針菇和黑木耳醇提物均具有較好的抗氧化活性，金針菇的抗氧化作用強于黑木耳，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與對照組相比，1.6 mg/mL的金針菇和木耳醇提物對DPPH·自由基的清除率分別為60.30%和40.43%(P<0.01)，F(xiàn)RAP值分別為9.5和7.0 mmol/mL(P<0.01)。結(jié)論 金針菇和黑木耳均具有較強的抗腫瘤作用和抗氧化作用，金針菇的藥理活性優(yōu)于黑木耳。

金針菇；黑木耳；抗腫瘤活性；抗氧化活性

食用菌是指能形成大型的肉質(zhì)(或膠質(zhì))子實體或菌核類組織的一類大型真菌[1]。其中金針菇和黑木耳等食用菌因其含有豐富的氨基酸、維生素、纖維素、多種微量元素和多糖等營養(yǎng)成分和生物活性成分，使其具有極高的營養(yǎng)價值和藥用價值，成為百姓餐桌上不可多得的美味佳肴[2-4]。研究結(jié)果顯示，金針菇和黑木耳具有抗腫瘤、消除自由基，抗輻射，調(diào)節(jié)免疫、降血糖和降血脂等生理功能[5-7]。本文主要對金針菇和黑木耳的醇提物的抗腫瘤活性與抗氧化活性進行研究，旨在為指導(dǎo)人們合理膳食，開發(fā)新型食用菌功能食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試細胞株：MCF-7(人乳腺癌細胞株)，Hela(人宮頸癌細胞株)，A375(黑色素瘤細胞株)購自中科院上海細胞庫。

1.1.2 金針菇(F.velutipes)和黑木耳(A.auricula)購于四川省宜賓市食用菌加工有限公司。

1.1.3 試劑：RPMI-1640、新生牛血清購自Gibco公司；四氮唑藍(MTT)購于Sigma公司；DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 金針菇和黑木耳醇提取物的制備[8]：分別稱取一定量的金針菇和黑木耳，以95%乙醇為溶劑，用索氏提取器回流抽提8 h后，將提取液濃縮并制成干粉，用無水乙醇配制成一定濃度的母液，0.22 μm濾器過濾備用。

1.2.2 金針菇和黑木耳醇提物對MCF-7，Hela和A375細胞的抑制作用：用胰酶將培養(yǎng)至對數(shù)期的MCF-7，Hela和A375細胞消化處理，制備單細胞懸液(5×104/mL)。以每孔100 μL接種于96孔板，培養(yǎng)24 h貼壁后加入10 μL食用菌醇提物，使其終濃度依次為25、50、100、200和400 μg/mL，作用24 h，后棄去培養(yǎng)基，每孔加入20 μL MTT，孵育3～4 h，吸去孔內(nèi)上清液，加入150 μL DMSO，振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測490 nm下的吸收值，計算藥物抑制率和食用菌對三種腫瘤細胞的IC50值。以不加食用菌只加培養(yǎng)基為空白組，以食用菌醇提物0 μg/mL的作用濃度為對照組，實驗重復(fù)3次。細胞抑制率(%)=1-(OD實驗組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)。

1.2.3 金針菇和黑木耳醇提物對DPPH·自由基清除率的測定[10]：于EP管中加入2 mL兩種食用菌無水甲醇溶液和DPPH無水乙醇溶液[9]，使兩種食用菌的終濃度分別為0.2、0.4、0.8和1.6 mg/mL，混勻后避光孵育35 min，用分光光度計測定517 nm下的吸光值，按照下列公式計算清除率。以不加食用菌為空白組，以食用菌醇提物0 μg/mL的作用濃度為對照組，實驗重復(fù)3次。清除率(%)=1-[(A2-A0)/A1]×100。A0為樣品液的本底值，A1為空白對照的吸光值；A2為加入食用菌溶液的吸光值。

1.2.4 金針菇和黑木耳醇提物總抗氧化能力的測定：采用FRAP法測定[10]。在EP管中加入4mL FRAP工作液(由0.1 mol/L醋酸緩沖液，10 mmol/L TPTZ和20 mmol/L三氯化鐵溶液，按照10:1:1的比例配制，現(xiàn)配現(xiàn)用)和1 mL 2種食用菌無水甲醇溶液，使食用菌終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL。37 ℃避光孵育12 min，用分光光度計測定593 nm下的吸光值。以不加食用菌只加助溶劑為空白組，以食用菌醇提物0 μg/mL的作用濃度為對照組，實驗重復(fù)3次。用FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品抗氧化活性以達到同樣吸光度所需的FeSO4毫摩爾數(shù)表示，定義為FRAP值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計數(shù)資料用率表示，組內(nèi)比較用單因素方差分析，組間用t檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金針菇和黑木耳醇提物對3種腫瘤細胞的抑制作用 MTT結(jié)果顯示，金針菇和黑木耳醇提物均能抑制MCF-7，Hela和A375細胞的增殖，且呈濃度劑量依賴性，見圖1。其中400 μg/mL的金針菇醇提物對3種腫瘤細胞的抑制作用均優(yōu)于黑木耳，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比，400 μg/mL的金針菇和黑木耳對MCF-7細胞的抑制率分別為48.20%和37.62%(P<0.01)，IC50分別為0.37 mg/mL和0.67 mg/mL;對Hela細胞的抑制率分別52.61%和50.21%(P<0.05)，IC50分別為0.20 mg/mL和0.28 mg/mL;對A375細胞的抑制率分別為50.58%和41.59%(P<0.01)，IC50分別為0.39 mg/mL和0.57 mg/mL。

圖1 金針菇和黑木耳醇提物的抗腫瘤作用*P<0.05，與對照組相比Fig.1 Anti-tumor activity of ethanol extracts of F.velutipes and A.auricula(±s)*P<0.05, compared with control group

2.2 金針菇和黑木耳醇提物的抗氧化活性結(jié)果 實驗結(jié)果顯示，金針菇和黑木耳醇提物均具有較強的抗氧化活性，其中金針菇的抗氧化能力優(yōu)于黑木耳，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。DPPH·自由基清除率結(jié)果顯示，1.6mg/mL的金針菇和黑木耳醇提物對DPPH·自由基的清除率分別為60.30%和40.43%，顯著高于對照組(P<0.01)，IC50分別為1.2 mg/mL和2 mg/mL見圖2A。FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示，其濃度在0.1～1.6 mmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，y=0.303 7x+0.003 6，R2=0.999 9。當(dāng)金針菇和黑木耳的濃度為1.6 mg/mL時，F(xiàn)RAP值分別為9.5 mmol/mL和7.0 mmol/mL，顯著高于對照組(P<0.01)，見圖2B。

圖2 金針菇和黑木耳醇提物的抗氧化作用*P<0.05，與對照組相比Fig.2 Antioxidant activity of ethanol extracts of F.velutipes and A.auricula (±s)*P<0.05, compared with control group

3 討論

我國中醫(yī)認(rèn)為，許多食物和藥物一樣具有防治疾病的作用[11]。其中食用菌以其可食、可藥、可補的良好特性，被列入中國居民膳食指南，成為21世紀(jì)人們首選的健康食品之一[12]。本實驗結(jié)果顯示，金針菇和黑木耳對MCF-7，Hela和A375細胞的增殖均有顯著的抑制作用，且呈濃度劑量依賴性。目前的研究結(jié)果顯示，食用菌的抗腫瘤功效成分主要為多糖[13-14]，而金針菇除多糖外，有研究顯示其功效成分還包括火菇素[15]，火菇素是金針菇中一種結(jié)構(gòu)簡單的堿性蛋白質(zhì)，具有抗癌活性與增強免疫等功能。

研究表明，人們衰老以及罹患癌癥等疾病大都與體內(nèi)產(chǎn)生的過量自由基有關(guān)[16]。但人體因呼吸、放射線照射和環(huán)境污染等因素的影響，不可避免地會在機體內(nèi)持續(xù)的產(chǎn)生自由基，因此能夠抗氧化的保健食品備受人們推崇，也是醫(yī)療、保健品和化妝品企業(yè)的研究方向之一[16]。測定抗氧化活性的方法很多，本文采用DPPH法和FRAP法對金針菇和黑木耳的抗氧化活性進行了測定，結(jié)果顯示，兩種食用菌均有自由基清除活性和還原能力，其中金針菇的抗氧化活性優(yōu)于黑木耳。由于金針菇和黑木耳既具有較高的營養(yǎng)價值又具有較強的抗腫瘤作用和抗氧化作用，因此經(jīng)常食用金針菇和黑木耳等食用菌，可防病治病、增進人們的體質(zhì)，在促進人類健康方面發(fā)揮著重要的作用。關(guān)于這兩種食用菌發(fā)揮作用的活性成分和藥理作用機制尚有待于進一步研究。

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(編校：師維康)

Compare anti-tumor activity and antioxidant activity ofF.velutipesandA.auricula

WANG Lu?, LIU Ming-Yue?, XIE Kun-Peng, XIE Ming-JieΔ

(College of Life Sciences, Liaoning Normal University, Key Laboratory of Biotechnology and Drug Discovery of Liaoning Province, Dalian 116081, China)

ObjectiveTo compare the anti-tumor activity and antioxidant activity of ethanol extracts ofF.velutiesandA.auricula.MethodsThree human carcinoma cell lines, including MCF-7, HeLa and A375 were assessed by MTT assay to measure cell viability.The antioxidant activity was detected with a DPPH and RFAP assays.ResultsTwo domestic fungus have different anti-tumor activity on the inhibition of MCF-7, HeLa and A375 cells at 25-400 μg/mL concentration rage.F.velutipeswas better than theA.auricula.The difference was statistically significant (P<0.05).Compared with the control group, the inhibition ofF.velutipeswere 48.20%, 52.61%and 50.58%at the concentration of 400 μg/mL, respectively (P<0.01).At the same concentration, the inhibition ofA.auriculawere 37.62%、50.21%and 41.59%, respectively (P<0.01).The ethanol extracts of two domestic fungus have significant antioxidant activity.F.velutipeswas better than theA.auricula.The difference was statistically significant (P<0.01).Compared with the control group, the scavenging radical capacities on DPPH of ethanol extracts ofF.velutipesandA.auriculawere 60.30%and 40.43%at the concentration of 1.6 mg/mL, respectively (P<0.01).At the same concentration FRAP value were 9.5 and 7.0 mmol/mL(P<0.01).ConclusionTheF.velutipesandA.auriculaboth have strong anti-tumor and antioxidant activities,F.velutipesis better thanA.auricula.

F.velutipes;A.auricula; anti-tumor activity; antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.12.011

國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201610165042)；省級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201610165000042)；遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項目(L201683675)

汪璐，女，學(xué)士在讀，研究方向：生物科學(xué)，E-mail：1796245927@qq.com；劉明月，共同第一作者，女，碩士在讀，研究方向：微生物生化，E-mail：liumymoon@163.com；謝明杰，通信作者，女，博士，教授，研究方向：微生物生化，E-mail：xmj1222@sina.com。

S646.1+5；S646.6；R979.1

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