一株鍶高效富集真菌的篩選、鑒定及富集特性

盧 紅，賴金龍，劉 聰，付 倩，吳 國，陶宗婭

(四川師范大學生命科學學院，四川成都610101)

一株鍶高效富集真菌的篩選、鑒定及富集特性

盧 紅，賴金龍，劉 聰，付 倩，吳 國，陶宗婭*

(四川師范大學生命科學學院，四川成都610101)

為利用微生物技術修復環境中的鍶(Sr)污染，通過從鍶污染的土壤中分離、篩選Sr的高效富集菌種，采用響應曲面法優化該菌對Sr的富集條件．結果顯示，通過富集培養、稀釋平板涂布篩選出一株對Sr具有較強富集能力的真菌，經鑒定該菌為Talaromyces sp．．利用響應曲面法優化后，各因素的最佳水平組合為:培養溫度35℃，pH值3．0，Sr初始質量濃度50 mg/L，該菌(干重)對Sr的富集量達到1 815．21 mg/kg，優化后的富集量與理論預測值較接近，說明響應曲面法建立的模型可用于預測該菌對Sr2+的富集特性．結果表明，篩選得到的Talaromyces sp．對Sr的富集能力強，可用于環境中的Sr污染修復．

鍶;真菌;富集;響應曲面法

隨著核工業、核技術的發展與廣泛應用，它們在給人類帶來巨大社會經濟效益的同時，也產生了大量放射性廢物排入環境中形成放射性污染［1］．這些放射性廢物包括90Sr、54Mn、55Fe、60Co、63Ni、129I、134Cs、234U等［2］．其中90Sr作為主要的放射性核廢物，其化學性質與Ca2+相似，具有半衰期長(28．9 a)、危害性大等特點［3］，使90Sr極易通過食物鏈進入動物或人體內，替換骨骼中的Ca2+，形成內輻射，導致血細胞、骨細胞和皮膚細胞大量死亡，對健康帶來危害．因此，放射性Sr2+的環境生物學效應已受到廣泛關注［4－6］．

近年來，利用生物修復技術清除土壤中放射性核素的應用研究已取得一些成果，如利用植物修復技術，在90Sr的污染區種植超富集植物(如向日葵、粗根大戟、毛蕊花和黃耆)，通過此類植物的吸收和富集以達到清除土壤中的90Sr，修復效果較好［7－9］．然而，利用植物修復技術治理水中的90Sr污染存在一定局限，目前研究顯示，采用微生物修復技術吸收溶液中的90Sr，如固定化的耐輻射奇球菌［10］、啤酒酵母［11］等微生物對Sr的吸收率最高可達98%，表明該技術的修復效果理想．同時，該技術具有投入低，操作簡便，無二次污染等優點，應用范圍已越來越廣［12－13］．但現階段，篩選出的耐受性強、吸收效果好的微生物菌種仍較為缺乏，在一定程度上限制了該技術的應用．因此，本研究擬從88Sr污染的盆栽土壤中分離篩選Sr2+的高效富集菌，并通過單因素富集優化實驗及響應曲面法提供菌株對Sr2+的富集能力，旨在為環境修復治理中微生物資源的高效利用提供實驗依據和新的菌株資源．

1 材料與方法

1．1 主要儀器設備 原子吸收分光光度計(TAS－990，北京普析通用儀器有限責任公司);PCR儀(S1000，美國伯樂公司);瓊脂糖水平電泳槽(DYCP 31DN型，北京澤蘭西科技有限公司);穩壓電泳儀(DYY－6C型，南京科弋創生物科技有限公司);凝膠成像分析系統(Gel Doc XR+，美國伯樂公司);酸度計(PHS－4C+，深圳市三利化學品有限公司);立式壓力蒸汽滅菌器(LDZX－50FBS，上海申安醫療器械廠);電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG－9245A，上海金璃儀器設備有限公司);天平(精度0．001g);恒溫搖床(DHZ－CA，上海市百典儀器廠);1～10 μL、10～100 μL、100～1 000 μL移液器及槍頭;超凈工作臺;水浴恒溫震蕩儀等．

1．2 培養基及主要成分 液體無機鹽培養基: CaCO30．5 g，K2HPO42．0 g，(NH4)2SO41．0 g，MgSO4·7H2O 0．5 g，NaCl 0．1 g，SrCl 20．01 g，酵母膏0．5 g，蔗糖10．0 g，質量濃度為 870 mg/L的Sr2+，蒸餾水1 L．馬丁培養基(篩選培養基):蛋白胨5 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0．5 g，葡萄糖10 g，瓊脂18 g，10 g/L孟加拉紅溶液3．3 mL，10 g/L鏈霉素0．3 mL，不同質量濃度的Sr2+，蒸餾水1 L．

富集培養基(液體培養基):CaCO30．5 g，K2HPO42．0 g，(NH4)2SO41．0 g，MgSO4·7H2O 0．5 g，NaCl 0．1 g，酵母膏0．5 g，蔗糖10．0 g，不同質量濃度的Sr2+，蒸餾水1 L．所有化學試劑均為分析純．

1．3 抗性真菌的分離純化 選用的土壤是本研究室模擬Sr2+污染的盆栽土壤，該盆栽土壤已栽種一季印度芥菜，土壤質地為:壤土，其理化性質如表1所示．其中，Sr2+的污染水平為870 mg/kg，是我國土壤背景值的5倍(目前我國土壤中Sr2+的背景值平均水平為167 mg/kg)［14］，屬于Sr2+的重度污染土壤．

表1 土壤樣本的理化性質Table 1 The physical and chemical properties of tested pot－soil samples

樣品采樣及預處理:去除表層土3 cm，避免地面微生物與土樣混合，再采用多點混合采樣法．將土樣裝入保鮮袋中，自然風干后，過2 mm篩除去植物殘渣，過篩土樣裝入保鮮袋于4℃保存．

稱取2．000 g土樣，接種至100 mL液體無機鹽培養基中，于28℃，150 r/min恒溫震蕩培養6 d，將處理后的土壤懸液靜置10 min后，吸取1．0 mL上清液，轉接至新鮮的液體無機鹽培養基中，繼續富集培養6 d．

分離純化:富集培養后，吸取0．1 mL菌懸液，梯度稀釋至10－1～10－6，分別涂布到馬丁固體培養基上，28℃倒置培養6 d后，挑選單菌落，反復劃線純化并鏡檢，純化的菌株保藏于斜面培養基中．

1．4 高效富集菌的篩選 將分離純化后得到的抗性菌株分別接種到ρ(Sr2+)為350 mg/L富集培養基中，于28℃，150 r/min恒溫震蕩培養6 d后，4 500 r/ min離心10 min，棄上清液，沉淀中加入20 mmol/L EDTA－Na210 mL離心10 min，棄上清液，沉淀中再加入10 mL蒸餾水離心10 min，棄上清液，取沉淀烘干至恒重，加入消解液(硝酸∶高氯酸的體積比為3∶1)，消解澄清后，定容，原子吸收分光光度計(TAS－990，北京普析)測定Sr2+含量，分析比較各菌株對Sr2+的富集能力，篩選出高效富集菌株．

1．5 高效富集菌的抗性及分子鑒定 將篩選出的高效富集菌接種至ρ(Sr2+)為1 000 mg/L馬丁培養基中，28℃倒置培養6 d后，觀察菌株生長情況．

真菌ITS鑒定:采用植物總DNA提取試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)提取菌株總DNA后，擴增真菌ITS序列．送樣測序(成都擎科梓熙生物技術有限公司完成)．將基因序列提交至GenBank數據庫，利用BLAST將菌株的基因序列與GenBank數據庫中已登錄的基因序列進行對比，采用Neighbor Joining法構建系統發育樹．

1．6 抗性菌株對Sr2+富集效果的單因素條件優化優化實驗采用三因素三水平全組合實驗，見表2．將1 mL菌懸液接種至滅菌后的ρ(Sr2+)100 mg/L富集培養基中，在相應的培養溫度、初始濃度和pH值條件下，150 r/min恒溫震蕩培養6 d后，參照1．4，測定菌株對Sr2+的富集量．

表2 實驗因素和水平Table 2 The experimental factors and levels

1．7 響應曲面法優化菌株對Sr2+的富集效果依據單因素實驗結果，挑選富集效果最佳的單因素范圍，利用Design－Expert 8．0．6 Trial軟件對富集條件進行優化，實驗設計如表2所示．將1 mL菌懸液接種至滅菌后的各富集培養基中，依據實驗設計需設置的培養條件，于150 r/min恒溫震蕩培養6 d后，參照1．4，測定菌株對Sr2+的富集量．

1．8 數據分析與處理 采用SPSS 18．0對數據進行方差分析，Duncan法多重比較，Origin 9．0作圖．

2 結果與分析

2．1 高效富集菌的篩選及鑒定 經過富集培養后，從土壤中共分離純化得到10株對Sr2+具有抗性的真菌，對其進行二次篩選，即篩選出高效富集菌株．結果顯示，當富集培養基中ρ(Sr2+)為350 mg/L時，富集培養6 d后，菌株B3富集Sr2+的能力最強，達到28．78 mg/g，顯著高于其他菌株的Sr2+富集量(P＜0．05)(圖1)．抗性實驗顯示，當ρ(Sr2+)為1 000 mg/L時(圖2，II)，菌株B3單菌落的形態結構與ρ(Sr2+)0 mg/L無明顯的差異(圖2，I)．將菌株B3的ITS序列在NCBI上進行blast檢索比較，通過MEGA6．0軟件，采用N－J法構建系統發育樹，結果如圖3所示．結果表明，B3與Talaromyces的基因序列具有100%的同源性，因此，鑒定B3為Talaromyces sp．．

2．2 B3對Sr2+富集效果的優化 培養溫度:當富集培養基中ρ(Sr2+)為100 mg/L時，隨著培養溫度升高(20～40℃)，B3對Sr2+的富集量呈先升后降的趨勢;當溫度為35℃，富集量顯著高于其他溫度培養組(P＜0．05)，達到725．43 mg/kg(圖4(A))．因此，B3富集Sr2+的最佳培養溫度為35℃．

pH:當培養溫度為28℃，Sr2+初始質量濃度為100 mg/L時，隨著培養基pH值增加(pH 3～8)，B3對Sr2+的富集量呈現先升后降的趨勢;當pH值為4時，B3對Sr2+的富集量顯著高于其他處理組(P＜0．05)，富集量達到1 556．76 mg/kg(圖4(B))．因此，B3富集Sr2+的最佳pH值為4．

Sr2+初始質量濃度:當培養溫度為28℃，隨著富集培養基中Sr2+初始質量濃度提高到50 mg/L，B3對Sr2+的富集量呈先升后降的趨勢;當ρ(Sr2+)為40 mg/L時，B3對Sr2+的富集量顯著高于其他Sr2+初始質量濃度組(P＜0．05)，達到1 535．22 mg/kg(圖4(C))．因此，B3富集Sr2+的最佳初始質量濃度為40 mg/L．

2．3 響應曲面法優化富集效果 根據單因素優化結果，即最佳培養溫度(A)35℃、最佳Sr2+初始質量濃度(B)mg/L、最佳pH值(C)4時，采用響應曲面法，對B3的富集效果進行優化，確定最佳富集條件，結果如表3所示．利用Design Expert 8．0．6 Trial軟件對表3數據進行統計分析，選擇Quadratic模型對數據進行多元回歸擬合，得到多元回歸模型:

經檢驗，回歸模型顯著(P＜0．01)，模型確定系數為R2=0．909 3，表明此模型能解釋90．93%的響應值變化，與實際實驗擬合程度較好．模型失擬性分析顯示，失擬性不顯著(P＞0．05)，表明所擬合的回歸方程在整個回歸區域內擬合度較好，符合實驗要求，可用該回歸模型對Sr2+富集量進行估算(表4)．各參數(A、B、C)顯著性檢驗顯示，該模型一次項參數B影響極顯著(P＜0．01)，參數C影響顯著(P＜0．05)，參數A影響不顯著(P＞0．05);交互項AB，AC，BC和二次項 A2、B2、C2均不顯著(P＞0．05)(表5)．依據回歸模型，利用Origin 9．0軟件建立矩陣，繪制3D響應曲面圖．結果顯示，當pH值固定為4時，隨著Sr2+初始質量濃度增加，B3對Sr2+的富集量先升后降;隨著培養溫度增加，富集量逐漸上升;當培養溫度為35℃、初始質量濃度為48．06 mg/L時，富集量最大，達到1 006．47 mg/kg (圖5)．當濃度固定為40 mg/L時，隨著培養溫度升高和pH值降低，B3對Sr2+的富集量逐漸增加，當培養溫度為35℃、pH值為3．0時，富集量最大，達到1 531．09 mg/kg(圖6)．當培養溫度固定為35℃時，隨著Sr2+初始質量濃度增加，富集量呈現先升后降的趨勢;隨著pH值提高，富集量逐漸降低．當Sr2+初始質量濃度為49．032 mg/L，pH值為3．0時，Sr2+富集量最大，達到1 230．59 mg/kg(圖7)．

經Design Expert 8．0．6 Trial軟件分析，得到B3富集Sr2+的最優條件為:培養溫度35℃，Sr2+初始質量濃度49．69 mg/L，pH值3．0時，B3對Sr2+富集量的理論值為1 715．17 mg/kg．

模型驗證:考慮到實際操作的可行性，將模擬得到的最佳富集條件調整為:溫度35℃，Sr2+初始質量濃度50 mg/L，pH值3．0．在此條件下進行驗證實驗，實測3次平行試驗的平均富集量為1 815．21 mg/kg，與模型理論預測值1 715．17 mg/kg相差不大，表明該模型預測性好，利用響應曲面法優化富集條件具有一定的可靠性．

3 討論

近年來，利用細菌類、真菌類以及藻類作為生物吸附劑處理放射性核素已取得一定研究成果，如篩選出的耐輻射奇球菌對 輻照耐受性強，對鈾(U)、鍶(Sr)具有較強的富集能力［15－16］;以廢棄啤酒酵母作為生物吸附劑，啤酒酵母菌對Sr的理論飽和吸附量可達到29．67 mg/g［17］．采用固定化技術，通過海藻酸鈉(SA)及聚乙烯醇(PVA)－SA固定化載體包埋、固定耐輻射奇球菌，對Sr吸附率最高達到98%左右［10］．本文通過將高濃度 Sr(10 mmol/kg)添加到土壤中，通過模擬Sr污染環境，經過長期馴化后，從土壤中分離得到一株鍶高效富集真菌Talaromyces sp．，該菌株與已有報道的耐受性菌株(如:啤酒酵母、耐輻射奇球菌、面包酵母、枯草芽孢桿)具有類似特性［18］，具有富集量大，耐受性強等特點．通過優化實驗，其富集能力最高可達到115．21 mg/kg，活菌的富集能力較強．

表3 BOX－Behnken實驗設計及結果Table 3 BOX－Behnken design and the experimental results

表4 二次回歸模型方差分析結果Table 4 Analysis of variance(ANOVA)results of the second－order regression model

表5 回歸方程系數顯著性檢驗Table 5 Regression coefficient and their significance for the quadratic polynomial model

已有研究表明，活菌對核素(如:鈾)的吸收方式主要包括細胞壁結合和胞內富集兩條途徑［18］，如微生物的細胞壁主要由多聚糖構成，可有效阻滯、結合重金屬［19］;假單胞菌屬、硫桿菌屬微生物可通過自身代謝過程將鈾富集于細胞內［18］．本文篩選出的Talaromyces sp．，屬于黃絲曲霉屬真菌，其細胞壁主要含有幾丁質、甘露聚糖及糖蛋白等［20］，這些多聚糖可與細胞膜結合，結合后的蛋白中含有許多活性基團，如:羧基、磷酸基、氨基和羥基［21－22］，能與 Sr共價結合、絡合后，固定在細胞壁．同時，依賴于細胞膜轉運系統，通過自身代謝過程也可將部分Sr富集到細胞內．

綜上，本研究篩選出一株對Sr富集能力很強的真菌，經鑒定，菌種為Talaromyces sp．．根據單因素條件優化、響應曲面法建立模型以及模型驗證，得到該菌對Sr2+的最佳富集條件為:培養溫度35℃，pH值3．0，Sr2+初始質量濃度50 mg/L，其對Sr2+的富集量可達到1 815．21 mg/kg．優化后的實際富集量與理論預測值較接近，表明響應曲面法建立的模型可用于預測該菌對Sr2+富集特性．然而，較多研究者認為微生物死細胞的吸附行為與細胞本身的新陳代謝沒有關系，對核素具有更好的吸附力［23］．因此，后續將以該菌為生物吸附劑，驗證死細胞對Sr2+的吸附能力．

致謝 四川師范大學校級青年項目(14QN07);四川師范大學重點培育項目(ZP1609);四川省生物質改性材料工程技術研究中心開放課題(12ZXBK03)對本文給予了資助，謹致謝意．

［1］TODOROV P T，ILIEVA E N．Contamination with uranium from natural and anthropological sources［J］．Romanian J Physics，2006，51(1/2):27．

［2］唐世榮，商照榮，宋正國，等．放射性核素污染土壤修復標準的若干問題［J］．農業環境科學學報，2007，6(2):407－412．

［3］NIELSEN S P．The biological role of strontium［J］．Bone，2004，35(3):583－588．

［4］ACHAL V，PAN X L，ZHANG D Y．Bioremediation of strontium(Sr)contaminated aquifer quartz sand based on carbonate precipitation induced by Sr resistant Halomonas sp．［J］．Chemosphere，2012，89(6):764－768．

［5］SINGH S，EAPEN S，THORA V，et al．Phytoremediation of 137 cesium and 90 strontium from solutions and low－level nuclear waste by Vetiveria zizanoides［J］．Ecotoxicol Environ Safety，2007，69(2):306－311．

［6］MOYEN C，BONMORT J，ROBLIN G．Early Sr2+－induced effects on membrane potential，proton pumping－and ATP hydrolysis activities of plasma membrane vesicles from maize root cells［J］．Environmental and Experimental Botany，2011，70(2/3): 289－296．

［7］MOYEN C，ROBLIN G．Uptake and translocation of strontium in hydroponically grown maize plants，and subsequent effects ontissue ion content，growth and chlorophyll a/b ratio:comparison with Ca effects［J］．Environmental and Experimental Botany，2010，68(3):247－257．

［8］SOUDEK P，VALENOVA S，VAVRIKOVA Z，et al．137Cs and90Sr uptake by sunflower cultivated under hydroponic conditions［J］．J Environmental Radioactivity，2006，88(3):236－250．

［9］唐永金，羅學剛，曾峰，等．不同植物對高濃度Sr、Cs脅迫的響應與修復植物篩選［J］．農業環境科學學報，2013，32(5): 960－965．

［10］劉明學，董發勤，李姝，等．固定化耐輻射奇球菌對鍶柱吸附與減量化研究［J］．環境科學與技術，2014，37(6):32－37．

［11］楊玉山，董發勤，羅順忠，等．固定化啤酒酵母對鍶離子的吸附［J］．化工進展，2012，31(3):639－642．

［12］李兆輝，王光明，徐云明，等．鎘、汞、鉛污染及其微生物修復研究進展［J］．中國畜牧獸醫，2010，37(9):39－43．

［13］肖湘竹，竹文坤，張友魁，等．微生物礦化法固結模擬放射性核素鍶的研究［J］．輻射防護，2015，35(2):65－70．

［14］中國環境監測總站．中國土壤元素背景值［M］．北京:中國科學出版社，1990:87．

［15］LIU M X，DONG F Q，ZHANG W，et al．Biosorption of Uranium by Deinococcus radiodurans Cells under Culture Conditions［J］．Advanced Materials Research，2012，535/536/537:2446－2449．

［16］劉明學．微生物與鍶鈾相互作用及其機理研究［D］．成都:電子科技大學，2011．

［17］張偉，董發勤，代群威．啤酒酵母菌對溶液中鍶離子的吸附行為［J］．環境污染與防治，2009，31(8):11－15．

［18］邱亮，豐俊東．微生物對放射性核素吸附行為的研究進展［J］．環境工程，2015，34(6):30－34．

［19］韓鵬飛，賀稚非，李洪軍，等．微生物細胞壁結構及結合真菌毒素的研究進展［J］．食品科學，2012，33(11):294－298．

［20］歐陽浩淼，金城．煙曲霉細胞壁及其GPI錨定結構研究進展［J］．廣西科學，2014，21(2):99－102．

［21］HERNANDEZ－ALLICA J，GARBISU C，BECERRIL J M，et al．Synthesis of low molecular weight thiols in response to Cd exposure in Thlaspi caerulescens［J］．Plant Cell Environment，2006，29(7):1422－1429．

［22］KUPPER H，LOMBI E，ZHAO F J，et al．Cellular compartmentation of cadmium and zinc in relation to other elements in the hyperaccumulator Arabidopsis halleri［J］．Planta，2000，212(1):75－84．

［23］劉明學，董發勤，李瓊芳，等．酵母菌固定化及對鍶吸附的影響［J］．工業水處理，2009，5(5):19－23．

A Research on the Screening，Identification，and Enrichment Characteristics of a Fungi Strain with Efficient Enrichment to Strontium

LU Hong，LAI Jinlong，LIU Cong，FU Qian，WU Guo，TAO Zongya

(College of Life Science，Sichuan Normal University，Chengdu 610101，Sichuan)

In order to use microorganism removing environment of strontium，this paper obtained an efficient enrichment of fungi strain by screening of microorganisms from Sr2+polluted soil．Meanwhile，Sr enrichment conditions of the fungi strain was optimized by using response surface method．The results showed a fungi strain has obtained，which has efficient enrichment ability for Sr，identifying as Talaromyces sp．．After the optimizing by response surface method，the best combination of various factors was:a culture temperature of 35℃，a pH value of 3 and a initial concentration of 50 mg/L，the enrichment value was up to 1815．21 mg/kg，which was closed to the prediction．It showed that the model established from response surface method can be used to predict the fungus enrichment characteristics of Sr2+．In general，Talaromyces sp．had stronger capacity of enriching Sr，it should have a great application potential to remove environment of strontium．

strontium;fungi;enrichment;response surface method

Q939．96

A

1001－8395(2016)04－0581－07

10．3969/j．issn．1001－8395．2016．04．023

(編輯 陶志寧)

2015－07－17

四川省教育廳自然科學重點課題(14ZA0030)

*通信作者簡介:陶宗婭(1957—)，女，教授，主要從事植物逆境生物化學與分子生物學方面的研究，E－mail:t89807596@163．com