芯片法和培養法對結核分枝桿菌耐藥檢測的對比研究

周 覓，李青峰，曹 玲，趙 麗，左浩江，裴曉方*

(1．四川大學華西公共衛生學院，四川成都610100; 2．成都市公共衛生臨床醫療中心，四川成都610061; 3．成都市婦女兒童中心醫院，四川成都610091)

芯片法和培養法對結核分枝桿菌耐藥檢測的對比研究

周 覓1，2，李青峰1，曹 玲2，趙 麗3，左浩江1，裴曉方1*

(1．四川大學華西公共衛生學院，四川成都610100; 2．成都市公共衛生臨床醫療中心，四川成都610061; 3．成都市婦女兒童中心醫院，四川成都610091)

選取臨床疑似結核病患者聚合酶鏈反應(PCR)檢測陽性標本，分別用芯片法和培養法檢測其耐藥性以探討這2種方法對結核分枝桿菌耐藥檢出率的差異．實驗中共選取了228例標本，以異煙肼和利福平為研究對象，利用芯片法和培養法分別統計了樣本對這兩種藥物的耐藥性．研究結果表明芯片法和培養法對異煙肼耐藥檢出率存在統計學差異(P＜0．05)，對利福平耐藥檢出率沒有統計學差異(P＞0．05)．與培養法相比，芯片法有效縮短了對利福平耐藥檢出率的檢測時間，具有快速簡便等優點，但對異煙肼耐藥檢出率存在一定差異．

結核;耐藥檢出率;芯片法;培養法

結核病是一種經呼吸道傳播的慢性傳染病，在全球廣泛流行．我國結核病疫情屬全世界22個高負擔國家之一［1－3］．

近年來結核菌耐藥已經成為困擾臨床影響預后的主要因素．結核耐藥按照耐一線藥物的不同分為以下4種:單耐藥、多耐藥、耐多藥(MDR－TB)以及廣泛耐多藥(XDR－TB)．世界衛生組織(WHO)2008年報道顯示，全球結核病總耐藥率為20．0%．耐藥結核病發生大致有以下3點原因:

1)用藥方案不合理，包括藥物聯合的不合理、不恰當、用藥劑量不足和服藥方法不當以及經濟困難或藥物不良反應造成間斷、不規則用藥等;

2)大量結核病患者不能早期被發現，被發現的結核病患者中仍有相當一部分得不到有效的治療;

3)新的抗結核藥物開發和研制的嚴重滯后也是耐藥結核病形成的一個原因，由于耐藥結核病不能得到及時治愈，久而久之耐藥程度越來越嚴重，最終也就產生了XDR－TB［4－6］．

利用分子生物技術檢測結核分枝桿菌耐藥基因，是目前結核病防治領域的一個研究熱點．通過聚合酶鏈反應－單鏈構象多態性(PCR－SSCP)檢測結核菌rpoB基因、katG基因、ahpC基因、pncA基因、rpsL基因和inhA基因突變來研究結核桿菌對抗結核藥物的耐藥性，取得了很大的成功［7－8］．目前全世界在結核桿菌病及其耐藥性的診斷方面尚沒有一種快速簡便的方法．各醫院廣泛使用的傳統方法主要為培養法加藥敏，耗時長花費大且成功率較低，所以臨床上急需可以檢測致病性結核桿菌病原菌和耐藥性有無的快速準確的分析系統．

結核菌耐藥的傳統檢測是進行結核菌培養及藥物敏感試驗，證實結核菌體外對一種或多種抗結核藥物耐藥．傳統的絕對濃度法和比例法，培養周期較長，需要4～8周才能得到結果，操作復雜，不能完全滿足臨床需要．隨著MTB基因組的破譯和耐藥分子機制的闡明，建立了許多先進的分子生物學方法［9－14］．研究顯示:結核耐藥與基因位點突變有關，利福平和異煙肼的3個耐藥相關基因分別為rpoB基因、katG基因及inhA基因．華西公共衛生學院自2011年開展了結核分枝桿菌耐藥基因檢測［15－16］．本文結合工作實際，針對基因芯片法和比例藥物敏感試驗進行比較，探尋2種方法在檢測結核分枝桿菌耐藥檢出率是否存在差異．

1 實驗對象與方法

1．1 菌株 選擇2014年6月—2015年3月成都市公共衛生臨床醫療中心收治的疑似結核病患者，結核分枝桿菌PCR檢測陽性并可做耐藥檢測標本361例，其中男237例，女124例，男女比例1．91∶1．年齡分布在11歲到85歲．

1．2 儀器與試劑

1．2．1 儀器 生物安全柜Hfsafe－1200型(上海立新儀器公司);CHB－100型恒溫金屬浴(東莞興萬儀器公司);MR23i高速冷凍離心機(美國Thermo Scientific公司);E－CyclerTM96型晶芯梯度PCR儀(中國博奧生物公司);SlideWasherTM芯片洗干儀;LuxScanTM 10K －B 芯片掃描儀; ABI7500PCR擴增儀(上海艾迪康醫學檢驗所有限公司)．

1．2．2 試劑 分枝桿菌羅氏培養管，由珠海貝索生物技術有限公司提供;耐藥基因檢測試劑盒(rpoB基因，katG和inhA基因)，核酸提取液，PCR擴增試劑，雜交緩沖液由北京博奧生物科技有限公司提供．

基因芯片清洗緩沖液成分:

1)10%十二烷基硫酸鈉(10%SDS)預期用途:用于基因芯片洗滌緩沖液的配制，配制后的洗液用于雜交后芯片的清洗，主要作用為清洗掉芯片上非特異吸附的雜質．主要性能指標260 nm≤0．2，28 nm≤0．2，pH值范圍:7．2～7．4，pH值得批間差應符合△pH≤0．4．

2)88．2 g/L檸檬酸鈉、175．3 g/L氯化鈉(20 *SSC)預期用途:用于基因芯片洗滌緩沖液的配制，配制后的洗液用于雜交后芯片的清洗，主要作用為維持芯片清洗過程中的離子濃度．主要性能指標260 nm≤0．2，28 nm≤0．2，pH值范圍:6．9～7．1，pH值批間差應符合△pH≤0．2．

1．3 方法 選取該疑似結核病患者同一時期2份標本，標本類型多為痰液，也可為腦脊液、纖支鏡灌洗液、尿液、胸腹腔積液、病理組織等．一份標本進行結核分枝桿菌基因檢測．另一份標本進行結核菌培養．

1．3．1 結核分枝桿菌基因及耐藥檢測 1)TBDNA提取與擴增．向痰液中加入等體積液化液或4%NaOH，振蕩混合后37℃30 min以上．取1 mL液化痰于離心管中12 000 r/min，5 min，棄上清液;再加入1 mL洗液(10 mM EDTA或生理鹽水)振蕩混勻12 000 r/min，5 min，棄上清．向離心管加入50 μL核酸提取液，混勻轉入提取管中，核酸提取儀振蕩5 min，95℃水浴5 min，5 000 r/min，1 min，將得到的核酸進行第一次擴增．

設置相應的陰性和陽性對照品．擴增程序: 37℃ 5 min 1個循環，94℃ 3 min 1個循環，94℃15 s～60℃ 30 s，40個循環，50℃ 10 s 1個循環，同時選擇FAM和HEX(或VIC)通道，熒光采集點選擇60℃30 s．選取CT值小于30的陽性標本進行耐藥基因檢測．每個樣本進行3管PCR反應，特異性的擴增耐藥基因rpoB及katG、inhA的特異性保守核酸序列．

2)核酸雜交與掃描判讀．結核分枝桿菌耐藥基因檢測(DNA微陣列芯片法)主要分為樣品制備、芯片反應和結果判讀3步:首先，將結核分枝桿菌的DNA從培養、分離純化的菌株或直接從臨床樣品中提取出來;對樣品中的靶基因進行擴增和熒光標記，將擴增并熒光標記的基因序列與芯片上的探針進行雜交反應;最后，芯片掃描成像，用配套軟件進行判讀．具體操作步驟如下:

將PCR擴增產物于PCR儀中95℃變性5 min，立即冰浴3 min;雜交緩沖液50℃熱浴10 min，將雜交緩沖液和2個PCR產物按9∶3∶3的比例配制好雜交混合物．將雜交反應盒裝配好，吸取15 ul混合物經加樣孔加入芯片點陣中，密封雜交盒，放入50℃水浴鍋內2 h．預熱洗干儀，運行洗滌程序洗滌芯片，甩干，用芯片掃描儀進行結果判讀．

3)探針設計．芯片法采用光導原位合成或微量點樣等方法，將核酸片段有序地固化于支持物的表面，然后與已經標記的待測生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器對雜交信號的強度進行快速、高效地檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的數量．

實驗根據rpoB基因以及katG、inhA基因DNA序列設計了一系列探針．固定了44個探針，其中用于異煙肼耐藥檢測的有16個探針(其中2個探針檢測KatG基因突變位點，1個探針檢測inhA基因突變位點)，用于利福平耐藥檢測的有28個探針．異煙肼耐藥基因探針分布如表1所示，利福平耐藥基因探針分布如表2所示．

表1 異煙肼相關Kat G基因和inhA基因啟動子的探針排布Table 1 The probe arrangement of isoniazid related KatG gene and inhA gene promoter

表2 利福平相關rpoB基因啟動子的探針排布Table 2 The probe arrangement of rifampicin related rpoB gene promoter

1．3．2 結核菌培養和比例法藥物敏感性試驗 參照《結核病診斷實驗室檢驗規程》，留取結核病人痰液于無菌盒，向盛有痰樣的無菌盒中加入1～2倍4%NaOH，震蕩混勻，15 min后加入pH 6．8磷酸緩沖液混勻，離心后去上清，沉淀再加入0．5～1 mL磷酸緩沖液混勻，嚴格按照改良羅氏培養法的操作步驟進行處理，將處理好的羅氏培養管于37℃溫箱孵育28 d，有菌落生長后參照WHO國際防癆和肺病聯合會的標準．使用羅氏藥敏培養基，1%比例法測定菌株藥物敏感性，各次試驗均以H37Rv菌株作為對照．

統計學處理采用SPSS 13．0軟件對數據進行統計分析，靈敏度、特異度及準確度采用率的比較，計數資料采用χ2檢驗，P＜0．05為差異，有統計學意義．

2 結果與討論

本研究共選取結核分枝桿菌基因擴增陽性病例361例，其中結核菌培養陰性標本63例．結核菌培養陽性，但因為雜菌過多無法進行藥敏試驗，或者藥敏生長不良，無法判斷結果的標本70例．對于同一病人同一時期的標本，分別用芯片法和培養法做藥敏試驗228例．藥敏試驗異煙肼有0．4 μg/mL、1．6 μg/mL2種濃度，利福平有2 μg/mL、4 μg/mL2種濃度．只要對一種濃度耐藥即認為該病人對此藥物耐藥．利用芯片法和培養法檢測結核分枝桿菌對異煙肼的耐藥檢出率結果如表3所示．

228例樣本中，采用兩種方法檢測結果均表現為耐藥的有43例，均表現為敏感的有162例．培養法檢測為耐藥而芯片法檢測為敏感的有17例，芯片法檢測為耐藥而培養法檢測為敏感的有6例．經計算，芯片法對異煙肼的耐藥檢出率為21．5%，培養法對異煙肼的耐藥檢出率為26．9%，通過Mc-Nemar檢驗方法進行計算P=0．035，說明這2種方法對異煙肼耐藥檢出率有統計學差異．

表3 芯片法和培養法對異煙肼耐藥率檢出比較Table 3 Comparison of chip method and culture method for the detection of isoniazid resistant rate

表4為芯片法和培養法對利福平耐藥檢出率數據．228例中，2種方法同時檢測出耐藥性的有34例，均為敏感的有183例．培養法檢測出為耐藥而芯片法檢測為敏感的有7例，芯片法檢測為耐藥而培養法檢測為敏感的只有4例．經計算芯片法對異煙肼的耐藥檢出率為16．7%，培養法對該藥的耐藥檢出率18．0%，差異較小．進一步通過McNemar檢驗方法進行計算P=0．549，表明芯片法和培養法對利福平耐藥檢出率無統計學差異．

表4 芯片法和培養法對利福平耐藥率檢出比較Table 4 Comparison of chip method and culture method for the detection of rifampicin resistant rate

3 結論

異煙肼(H)、利福平(R)為一線口服抗結核藥物，在臨床上廣泛應用．傳統培養法是用培養陽性的菌株進行藥敏試驗，大約需要45 d．而芯片法1～2天即可檢測結果，極大的縮短了檢測時間，具有快速簡便的優點．本研究實驗數據顯示，與臨床藥敏結果相比較，利福平及異煙肼耐藥的芯片檢測臨床靈敏度(陽性符合率)分別為92．0%和77．4%，臨床特異度(陰性符合率)分別為97．2%和96．9%．此次研究也發現芯片法對異煙肼耐藥的檢測，與培養法存在一定的差異，有一定的局限性，需要做進一步研究探討．結核分枝桿菌對利福平的耐藥率明顯低于異煙肼的耐藥率．這可能與20世紀80年代中期以前，肺結核病人化療方案以鏈霉素、異煙肼的組合為主有關，而20世紀80年代后期特別是90年代以來采用標準化療方案，故利福平的耐藥率，國際和國內的報道均處于較低水平［17－18］．

致謝 成都市衛生和計劃生育委員會項目(2015149，項目名稱:艾滋合并結核分枝桿菌患者結核耐藥狀況的研究)對本文給予了資助，謹致謝意．

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Comparison of Chip Method and Culture Method for the Detection of Drug-resistant Mycobacterium Tuberculosis

ZHOU Mi1，2，LI Qingfeng1，CAO Ling2，ZHAO Li3，ZUO Haojiang1，PEI Xiaofang1

(1．West China School of Public Health，Sichuan University，Chengdu 610100，Sichuan; 2．Public Health Clinical Center of Chengdu，Chengdu 610061，Sichuan; 3．Chengdu Women＆Children’s Hospital，Chengdu 610091，Sichuan)

In this paper，the polymerase chain reaction(PCR)positive samples of clinical suspicion of tuberculosis patients in the same period were selected to investigate the difference between chip method and culture method．228 samples were selected in our experiment to research the drug resistance of rifampin and isoniazid．The experimental results indicated that a significantly statistical difference was found in the detection rate of isoniazid resistance when using chip method and culture method(P＜0．05)，but there is no statistical difference in the detection rate of rifampin(P＞0．05)．Compared with culture method，chip method reduced the detection time remarkably showing the high efficiency．However，for the chip method，there were still some differences in detection of isoniazid resistance．

tuberculosis;drug-resistant detection;chip method;culture method

R195．1

A

1001－8395(2016)04－0597－05

10．3969/j．issn．1001－8395．2016．04．026

(編輯 陶志寧)

2015－07－27

四川省衛生和計劃生育委員會項目(150036)

*通信作者簡介:裴曉方(1964—)，女，教授，主要從事微生物基因結構與功能的研究和應用，E－mail:xxpeiscu@163．com