雜交水稻種子純度檢測(cè)方法綜述

宋豐順++倪大虎+++倪金龍++李莉++楊劍波

摘要：建立準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法監(jiān)控雜交水稻純度對(duì)于保障我國(guó)水稻安全生產(chǎn)具有至關(guān)重要的作用。本文綜述了用于雜交水稻純度檢測(cè)的各種方法，并對(duì)各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了評(píng)述，總體來(lái)講，我國(guó)雜交水稻純度鑒定方法的發(fā)展趨勢(shì)是由鑒定周期長(zhǎng)向鑒定周期短，由鑒定程序復(fù)雜向簡(jiǎn)單，由成本高向成本低的方向發(fā)展。根據(jù)各種檢測(cè)方法的特點(diǎn)，認(rèn)為DNA分子標(biāo)記技術(shù)和設(shè)計(jì)育種鑒定方法有較大發(fā)展空間，能滿足準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)的要求；實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)具有美好的前景。

關(guān)鍵詞：雜交水稻；種子純度；檢測(cè)；實(shí)時(shí)熒光PCR；DNA分子標(biāo)計(jì)；設(shè)計(jì)育種

中圖分類號(hào)： S511.03文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）06-006-05

自1976年雜交水稻在我國(guó)培育成功以來(lái)，其以明顯的產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)和廣泛的生態(tài)適應(yīng)性受到普遍歡迎，迅速在全國(guó)乃至世界范圍推廣開(kāi)來(lái)[1-2]。當(dāng)前雜交水稻種植面積約 1 667萬(wàn)hm2，約占我國(guó)水稻種植總面積的60%，累計(jì)增收稻谷逾4億t，每年增產(chǎn)的糧食可多養(yǎng)活7 000萬(wàn)人[3]，為我國(guó)乃至世界的糧食安全作出了巨大貢獻(xiàn)。雜交稻種子純度是保障其增產(chǎn)的關(guān)鍵。雜交稻種子純度是指雜交種子在特征特性方面典型一致的程度。由于雜交水稻制種環(huán)節(jié)多、周期長(zhǎng)，在種子生產(chǎn)過(guò)程中生物學(xué)混雜和機(jī)械混雜時(shí)有發(fā)生，易導(dǎo)致雜交種不純。有研究指出，在一定范圍內(nèi)，雜交稻純度每下降1%，667 m2減產(chǎn)4～5 kg，純度下降10%，雜交稻將失去其增產(chǎn)優(yōu)勢(shì)[4]，我國(guó)規(guī)定雜交水稻種子純度不得低于96%。因此嚴(yán)格監(jiān)控雜交稻種子質(zhì)量，只允許合格種子進(jìn)入市場(chǎng)和田間，對(duì)確保水稻增產(chǎn)具有重要意義。這其中建立準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)的雜交種純度檢測(cè)方法對(duì)于種子質(zhì)量監(jiān)控具有重要意義。目前雜交種純度檢測(cè)主要有以下幾種方法。

1海南種植鑒定法

利用海南冬季溫光資源進(jìn)行的田間種植鑒定是當(dāng)前雜交稻純度檢測(cè)最常用的方法之一。海南種植鑒定結(jié)果直觀且比較可靠，但種植環(huán)境條件的變化也可能引起某些假雜種與真雜種間難以區(qū)分，導(dǎo)致結(jié)果失真[5]。另一方面，該鑒定方法周期長(zhǎng)，需要幾個(gè)月時(shí)間，如果等待鑒定結(jié)果，再進(jìn)行包裝銷售，將延誤農(nóng)民播種；如果隔年銷售，將增加種子越夏的倉(cāng)儲(chǔ)費(fèi)用，且儲(chǔ)存不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致種子發(fā)芽率下降，將給種子公司的經(jīng)營(yíng)帶來(lái)諸多麻煩。當(dāng)前，采用海南種植鑒定的種子公司，在銷售種子時(shí)，多數(shù)情況下并不知道種子真實(shí)純度，只能憑借經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)天氣和制種田的情況估計(jì)純度，海南鑒定結(jié)果只作為售后參考，這給雜交水稻生產(chǎn)埋下了安全隱患，該行業(yè)也被稱為高風(fēng)險(xiǎn)行業(yè)，流傳“十年賺錢，不夠一年賠”的說(shuō)法。

2粒型鑒定法

粒型鑒定法通過(guò)觀察種子的形態(tài)特征，與標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行比較，判別種子真假，觀察的主要性狀有大小、形狀、稃殼色、稃尖色、[JP3]稃毛長(zhǎng)短和稀密、柱頭色和夾持率等。其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、快速，但由于親緣關(guān)系較近的種子在形態(tài)上很難區(qū)分，且同一品種內(nèi)各種子形態(tài)并不完全一樣，因此檢驗(yàn)結(jié)果可靠性差[6]。

3苯酚染色法

苯酚會(huì)使不同品種的谷?；蛎琢３尸F(xiàn)不同的顏色。水稻品種的苯酚染色一直被用于秈粳亞種間種子的鑒別，通常秈稻易著色，而粳稻難著色，并表現(xiàn)出程度上的差異。該法對(duì)秈、粳亞種間顏色區(qū)別明顯，但對(duì)亞種內(nèi)的水稻區(qū)分不明顯。同時(shí)，水稻種子成熟度不同，染色后顏色深淺也往往不一樣，所以該方法鑒定雜交種純度易造成人為誤差或錯(cuò)誤[7]。

4蛋白質(zhì)電泳法

[JP2]由于遺傳上的差異，作物不同品種間的蛋白質(zhì)種類和含量不同。蛋白質(zhì)電泳可將品種間的蛋白差異在凝膠上區(qū)別開(kāi)來(lái)。20世紀(jì)60年代，蛋白質(zhì)電泳技術(shù)即被應(yīng)用到水稻等作物雜交種純度檢測(cè)。根據(jù)被檢蛋白質(zhì)的功能，可將其分為種子貯藏蛋白電泳和同工酶電泳兩大類。目前用于純度檢測(cè)的種子貯藏蛋白主要有醇溶蛋白、清蛋白、球蛋白和谷蛋白[8-12]。同工酶是指催化反應(yīng)相同而結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)不同的一組酶，它們幾乎存在于所有生物中。被用于品種純度檢測(cè)的同工酶主要有酯酶同工酶、過(guò)氧化物同工酶、磷酸酶同工酶等。陸士偉等最早報(bào)道應(yīng)用幼苗酯酶同工酶測(cè)定雜交水稻種子純度[13]。李卓杰等利用胚芽的酯酶同工酶等電聚焦電泳對(duì)汕優(yōu)63、博優(yōu)64等進(jìn)行純度鑒定[14]。顏啟傳應(yīng)用種子及幼苗酯酶同工酶電泳鑒定多個(gè)雜交稻品種和親本種子[15-16]。陶芳等利用汕優(yōu)64、汕優(yōu)63、特優(yōu)559幼芽的酯酶同工酶譜帶數(shù)量和深淺進(jìn)行鑒定，結(jié)果與田間鑒定相差 1%～2%[17-18]。[JP]

蛋白質(zhì)電泳在純度鑒定中存在以下不足：（1）組織特異性強(qiáng)，不同發(fā)育階段和不同組織的圖譜差異大；（2）結(jié)果與操作過(guò)程相關(guān)，蛋白提取液、膠濃度和電泳系統(tǒng)不同，結(jié)果也會(huì)不同，導(dǎo)致難以形成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[19-20]；（3）多態(tài)性少，對(duì)于親緣關(guān)系較近的親本及其雜交種難以鑒定；（4）偏親帶型的出現(xiàn)會(huì)使結(jié)果誤判[21]。所以，蛋白質(zhì)電泳法未能列入我國(guó)雜交水稻種子純度鑒定的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)踐中也未得到大規(guī)模應(yīng)用。

5DNA分子標(biāo)記鑒定法

DNA分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)為雜交水稻純度鑒定提供了新的思路。該技術(shù)直接以遺傳物質(zhì)DNA為基礎(chǔ)，所揭示的多態(tài)性直接反映基因組差異。與形態(tài)學(xué)、蛋白質(zhì)等其他鑒定技術(shù)相比，DNA分子標(biāo)記鑒定具有明顯的優(yōu)點(diǎn)：（1）無(wú)組織特異性，在生物體的各個(gè)組織、各個(gè)發(fā)育階段均可檢測(cè)，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達(dá)與否的問(wèn)題[22-23]；（2）許多分子標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性，特別適合雜交種的檢測(cè)；（3）數(shù)量眾多，幾乎是無(wú)限的，遍布整個(gè)基因組；（4）多態(tài)性高，自然界存在許多等位型變異。正是因?yàn)樯鲜鰞?yōu)點(diǎn)，使得DNA分子標(biāo)記技術(shù)在品種鑒定中具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前，DNA標(biāo)記主要有RFLP、AFLP、RAPD、SCAR、SSR等。RFLP結(jié)果穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好，是共顯性標(biāo)記，缺點(diǎn)是所需DNA量大且質(zhì)量高，操作步驟繁瑣，成本高。AFLP多態(tài)性豐富，所需DNA量小，但也需要酶切，對(duì)DNA純度要求也較高，如果基因組不完全酶切會(huì)影響結(jié)果，同時(shí)，操作程序長(zhǎng)、步驟多，電泳繁雜，且主要屬于顯性標(biāo)記[24-25]。因此，這2項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于品種鑒定的報(bào)道很少。

1996年，錢前等利用RAPD標(biāo)記，成功實(shí)現(xiàn)對(duì)真、假Ⅱ優(yōu)63種子的鑒定[26]。同年，楊劍波等應(yīng)用RAPD標(biāo)記在30個(gè)隨機(jī)引物中篩選到6個(gè)多態(tài)引物能夠區(qū)分雜交水稻汕優(yōu)63及其親本[27]。RAPD操作簡(jiǎn)單，但RAPD本身存在重大缺點(diǎn)：（1）結(jié)果受反應(yīng)條件影響很大，在很多情況下，試驗(yàn)結(jié)果不能重復(fù)；（2）多態(tài)性仍不足，需要大量篩選引物獲得多態(tài)標(biāo)記；（3）主要為顯性標(biāo)記（極少數(shù)為共顯性），鑒定雜交種的能力不足[28]。產(chǎn)生這些缺點(diǎn)的根源是其擴(kuò)增時(shí)所用的10 bp隨機(jī)引物，擴(kuò)增位點(diǎn)不確定所致。1999年，楊劍波等將篩選到的多態(tài)性RAPD標(biāo)記進(jìn)行測(cè)序，并根據(jù)序列重新設(shè)計(jì)由 25～30個(gè)堿基組成的引物，將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，解決了RAPD標(biāo)記穩(wěn)定性差的問(wèn)題[29]。[JP3]但是隨著種子市場(chǎng)的發(fā)展和雜交稻品種的迅速增多，針對(duì)特定品種大量篩選引物，用單個(gè)多態(tài)標(biāo)記鑒定種子的做法，顯然不能滿足市場(chǎng)需求。[JP]

SSR標(biāo)記的誕生，為確定一套通用引物，鑒定多個(gè)品種提供了可能。SSR是一類由幾個(gè)堿基組成的基序（motif）串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，它們廣泛分布于基因組的不同位置上，每個(gè)座位上基序的重復(fù)數(shù)目不同，因而形成多態(tài)性。SSR兩端的序列多是相對(duì)保守的單拷貝序列，可用來(lái)設(shè)計(jì)特異引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增每個(gè)位點(diǎn)，通過(guò)電泳分析擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度差異。

SSR標(biāo)記由于數(shù)量豐富，在染色體上分布均勻，多態(tài)性高，呈共顯性遺傳，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，而成為一種理想的雜交種檢測(cè)分子標(biāo)記。2000年，李莉等對(duì)協(xié)優(yōu)63、協(xié)優(yōu)64及其親本進(jìn)行SSR分析，篩選出13對(duì)SSR引物，可以對(duì)水稻雜交組合與親本之間，以及雜交組合相互之間進(jìn)行區(qū)分和鑒定[30]。此后，諸多的研究采用SSR標(biāo)記鑒定雜交種純度和真實(shí)性[31-38]。2006年國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《三系雜交水稻及親本真實(shí)性和品種純度鑒定DNA分析方法》（GB/T 20396—2006）和2007年農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《水稻品種鑒定DNA指紋方法》（NY/T 1433—2007）的頒布，標(biāo)志著利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定雜交水稻種子純度已經(jīng)成熟，并走向真正的應(yīng)用。2套標(biāo)準(zhǔn)均各自確定了一套多態(tài)性豐富、重復(fù)性好、染色體分布均勻的通用SSR標(biāo)記，可用于鑒定不同的水稻品種。但是，DNA標(biāo)記技術(shù)，包括SSR標(biāo)記，仍需要專門的實(shí)驗(yàn)室，所需儀器設(shè)備較昂貴，對(duì)人員科技水平要求較高，檢測(cè)過(guò)程較復(fù)雜，且成本較高，限制了該技術(shù)在基層的廣泛應(yīng)用。

6實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)法

純度檢測(cè)一般需要檢測(cè)幾百個(gè)單株，上述DNA分子標(biāo)記技術(shù)在檢測(cè)雜交種純度時(shí)，需要對(duì)每個(gè)單株分別檢測(cè)，工作量大。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是近年來(lái)興起的新興檢驗(yàn)技術(shù)，可對(duì)群體內(nèi)外源片段的含量進(jìn)行檢測(cè)，即只要檢測(cè)1個(gè)樣品。2007年，程毅等依據(jù)已報(bào)道的雄性不育特異片段R2-630WA設(shè)計(jì)了1對(duì)引物和1條TaqMan熒光探針，對(duì)17個(gè)水稻品種進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，結(jié)果表明：此探針能特異擴(kuò)增三系雜交稻F1及不育系；純度檢測(cè)時(shí)，在測(cè)定低濃度（10%～40%）樣品時(shí)偏差為2%左右，在測(cè)定高濃度（50%～100%）樣品時(shí)，偏差為5%左右。其對(duì)低純度樣品的檢測(cè)表現(xiàn)較好、高純度樣品檢測(cè)結(jié)果偏差較大，分析了以下幾方面原因：（1）曲線方程的推導(dǎo)需要更多數(shù)量和樣品的重復(fù)；（2）此種絕對(duì)定量的方法受PCR體系中反應(yīng)的核酸模板量影響較大，要想獲得更精確的結(jié)果，最好加入含有內(nèi)參基因標(biāo)記的探針，實(shí)現(xiàn)相對(duì)定量后可大大提高檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性；（3）對(duì)于實(shí)時(shí)熒光PCR這種高靈敏度的技術(shù)來(lái)說(shuō)，其優(yōu)點(diǎn)在于從所有樣品中檢測(cè)極少數(shù)陽(yáng)性樣品，因?yàn)榉磻?yīng)中加入引物和探針的量有限，所以當(dāng)樣品中存在很多陽(yáng)性模板時(shí)，反應(yīng)容易進(jìn)入平臺(tái)期，檢測(cè)結(jié)果則出現(xiàn)偏大誤差[38]。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)雜交種純度前景看好，但是當(dāng)前的檢測(cè)準(zhǔn)確性還需進(jìn)一步提高，檢測(cè)標(biāo)記的選擇和設(shè)計(jì)方面還需進(jìn)一步優(yōu)化。

7設(shè)計(jì)育種鑒定法

遺傳和育種家探索利用苗期標(biāo)記性狀設(shè)計(jì)育種，以實(shí)現(xiàn)雜交水稻純度的快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)檢測(cè)。

7.1除草劑標(biāo)記性狀

2000年，張集文等利用輻射誘變選育出苯達(dá)松敏感致死突變體8077S，該性狀由隱性單基因控制，其自交苗能被除草劑苯達(dá)松殺死，雜交種苗則對(duì)該藥劑不敏感，運(yùn)用該方法可在苗期快速檢測(cè)和去除雜交稻中混入的兩系不育系種子[39-41]。Pan等克隆了該基因（bel）[42]。黃大年等嘗試用抗除草劑基因快速檢測(cè)和提高雜交稻純度[43]。

[HTK]7.2葉色標(biāo)記[HT]

在兩系和三系雜交稻中，給育性不穩(wěn)的不育系，打上易于識(shí)別的葉色標(biāo)簽，是解決不育系自交結(jié)實(shí)問(wèn)題的另一條有效途徑。馬志虎等和舒慶堯等對(duì)能產(chǎn)生實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的葉色標(biāo)記性狀進(jìn)行了概括，即作為葉色標(biāo)記性狀必須具有以下4個(gè)主要條件[44-45]：（1）標(biāo)記性狀遺傳穩(wěn)定，不易受外界環(huán)境因素的影響；（2）標(biāo)記性狀明顯，易目測(cè)識(shí)別；（3）標(biāo)記性狀未與不良性狀連鎖，生長(zhǎng)健壯，對(duì)雜交種、不育系、保持系的產(chǎn)量無(wú)影響；（4）標(biāo)記性狀為隱性。根據(jù)葉片顏色的不同，可將其分為以下幾類：

（1）白化轉(zhuǎn)綠標(biāo)記。舒慶堯等、吳偉等、楊文清、沈圣泉等、趙海軍等、吳殿星等分別利用培矮64S、廣占63S、Ⅱ-32B、龍?zhí)仄諦種子，育成玉兔S、NHR111S、白豐A、全龍A等白化轉(zhuǎn)綠型葉色標(biāo)記不育系[46-54]。這些材料苗期1～3葉期表現(xiàn)葉緣白化，從第4葉開(kāi)始轉(zhuǎn)綠[55-57]。趙海軍等以玉兔S為材料研究發(fā)現(xiàn)，白化轉(zhuǎn)綠型突變體受單隱性基因控制[52]。在農(nóng)藝性狀方面，沈圣泉等、趙海軍等的研究結(jié)果表明，這種類型的不育系無(wú)論稀播或密播，苗期生長(zhǎng)慢于正常綠苗，但不會(huì)造成競(jìng)爭(zhēng)致死[51-52]。Su等報(bào)道了培矮64S的白葉突變體ysa（young seedling albino），該突變體3葉期以前為白色葉，3葉期后逐漸轉(zhuǎn)綠，轉(zhuǎn)綠后對(duì)農(nóng)藝性狀無(wú)影響明顯，該性狀為隱性基因控制，基因已被克隆[58]。

（2）淡綠葉色標(biāo)記。1999年，董鳳高等選育成帶有明顯淡綠葉標(biāo)記性狀的秈型兩系不育系M2S[59]。余新橋等以M2S為供體，與中紅B雜交，再用其F1為母本與珍汕97B雜交，F(xiàn)2代選擇具有明顯淡綠葉標(biāo)記性狀的株系與珍汕97A雜交、回交選育成該類型不育系標(biāo)1A[60]。宋克堡等從安農(nóng)810S繁殖田中發(fā)現(xiàn)了1株水稻淡黃葉隱性突變體，并育成系列淡黃葉兩系不育系[61]。曹立勇等將淡綠色標(biāo)記性狀pgl基因定位于第10條染色體[62]。楊文清等以自選的標(biāo)8S為材料，遺傳分析表明其黃白色性狀受1對(duì)隱性主效基因控制，還與生長(zhǎng)溫度呈負(fù)相關(guān)[48]。王軍等在粳稻武運(yùn)粳7號(hào)中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)黃綠葉自然突變體，經(jīng)過(guò)多代自交形成了穩(wěn)定的突變系，該突變系和武運(yùn)粳7號(hào)的正反交F2代遺傳分析表明，該材料的黃綠葉由1對(duì)隱性基因控制，命名為[WTBX][STBX]ygl-2[WTBZ][STBZ]，并將其定位在第6染色體RM6298標(biāo)記附近[63]。田振濤等對(duì)4個(gè)淡綠葉粳稻光溫敏核不育系和正常葉色粳稻不育系浙農(nóng)大11S及秈型不育系培矮64S進(jìn)行了開(kāi)花習(xí)性的比較，結(jié)果顯示：淡綠葉色不育系的開(kāi)花天數(shù)、開(kāi)花率、柱頭外露率都低于正常葉色不育系，日開(kāi)花率、穎花張開(kāi)時(shí)間和張開(kāi)角度易受環(huán)境條件影響，表現(xiàn)較大差異；但淡綠葉色不育系的開(kāi)花高峰都在午前09：00或10：00，表現(xiàn)早花特性[64]。

（3）紫色葉標(biāo)記。曹立勇等采用1份秈型紫葉水稻和兩系不育系W6154S雜交，在F2代選擇紫葉稻回交1次后，以系譜法逐代選擇而育成了帶紫葉標(biāo)記的兩系不育系中紫S[62]；楊騰幫等選育了明紫02S和明紫03S[65-66]；余顯權(quán)等育成綜合性狀優(yōu)良、育性轉(zhuǎn)換明顯的隱性紫葉兩系不育系99H114紫S等[67-68]。吳關(guān)庭等通過(guò)平陽(yáng)霉素與射線復(fù)合處理，從早秈品種陸青早1號(hào)中誘變獲得了紫葉突變體PLM12，遺傳分析認(rèn)為該紫葉性狀屬核遺傳，由1對(duì)隱性主效基因控制，同時(shí)受若干微效基因修飾[69]。同樣，石幫志等將紫香稻與明恢63雜交，F(xiàn)1表現(xiàn)綠葉，F(xiàn)2群體綠葉株與紫葉株的分離比符合3 ∶[KG-*3]1，BC1群體的分離比符合1 ∶[KG-*3]1，證明紫香稻的紫葉性狀是隱性性狀[70]。但是，錢前等和曾大力等利用1份秈型紫葉水稻分別與綠葉秈、粳稻雜交，發(fā)現(xiàn)雜交種F1呈綠色，F(xiàn)2群體中綠葉與紫葉之比為13 ∶[KG-*3]3、55 ∶[KG-*3]9，符合2～3對(duì)基因的分離模式，推測(cè)綠葉稻品種均帶有1對(duì)顯性紫葉抑制基因IPl（t），使得雜交種F1呈綠色，另外還有2對(duì)顯性基因控制紫色表型[71-72]。李維明等在其研究的F2群體中，也檢測(cè)到13 ∶[KG-*3]3的分離比[73]。謝國(guó)生等對(duì)紫葉稻品種IC11003的遺傳分析表明，該品種的紫葉性狀受核內(nèi)2對(duì)顯性互補(bǔ)基因控制，無(wú)細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)[74]。潘學(xué)彪等對(duì)W6417S的天然變異紫葉稻進(jìn)行遺傳分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1代植株均為綠色，F(xiàn)2群體綠葉株 ∶[KG-*3]紫葉株分離比有3 ∶[KG-*3]1、13 ∶[KG-*3]3和55 ∶[KG-*3]9等3種類型[75]。牟同敏等利用紫葉稻與22個(gè)不同類型的綠葉稻雜交，F(xiàn)1均表現(xiàn)為綠葉，而F2群體綠葉株：紫葉株的分離比為3 ∶[KG-*3]1、13 ∶[KG-*3]3、55 ∶[KG-*3]9、229 ∶[KG-*3]27等4種遺傳分離模型[76]。這些分離比表明，紫葉水稻和綠葉親本間存在1～4對(duì)基因的差異，其中1對(duì)為顯性抑制基因，雙親之間基因數(shù)目不同，表現(xiàn)出不同的分離比例。鄧國(guó)富用紫葉稻IRI552與22個(gè)綠葉品種雜交，F(xiàn)1、F2、BCF1、BCF2和F3群體的遺傳分析結(jié)果表明，紫葉稻IRI552的紫葉性狀由核內(nèi)1對(duì)隱性紫葉基因（pl-pl）和1對(duì)顯性紫葉抑制基因（Ipl-Ipl）控制，同時(shí)也受紫葉調(diào)節(jié)基因（Ci-Ci）的作用；對(duì)紫葉基因及紫葉抑制基因定位的結(jié)果表明，隱性紫葉基因（pl-pl）位于第6染色體標(biāo)記RM587和RM584之間，紫葉抑制基因（Ipl-Ipl）位于第1染色體SSR標(biāo)記RM9和RM488之間[77]。紫葉稻材料大多數(shù)未能在生產(chǎn)上大面積推廣應(yīng)用，究其原因要么是溫敏性太強(qiáng)，要么是配合力、稻米品質(zhì)尚不夠理想等[77-81]。

7.3芽鞘紫線法

胚芽鞘是單子葉植物，特別是禾本科植物胚芽外的錐形套狀物，有保護(hù)胚芽中更幼小的葉和生長(zhǎng)錐的作用。在種子萌發(fā)時(shí)，能夠看到的第一個(gè)器官便是胚芽鞘，胚芽鞘上表現(xiàn)的性狀也是種子萌發(fā)后所能直接觀察到的最早期性狀。

水稻芽鞘紫線是在胚芽鞘兩側(cè)各出現(xiàn)的1條清晰可見(jiàn)的紫色線條。國(guó)內(nèi)很多育種家試圖將其運(yùn)用于雜交種的純度鑒定。1985年，沈又佳等發(fā)現(xiàn)化學(xué)殺雄制種的贛化2號(hào)雜交種芽鞘具有紫線，其母本IR24芽鞘無(wú)紫線，父本獻(xiàn)黨1號(hào)芽鞘有紫線。由于化學(xué)殺雄不徹底，雜交種中?；煊心副綢R24，因此他們提出通過(guò)觀察芽鞘紫線鑒別雜交種中混入的母本種子[82]。富昊偉將芽鞘無(wú)紫線的三系不育系嘉浙A和中浙A與芽鞘有紫線的父本配組，雜種F1的芽鞘有紫線，據(jù)此在苗期可觀察芽鞘紫線有無(wú)鑒別出雜交種中混入的不育系和保持系[83]。但這2種方法都無(wú)法將雜交種中混入的父本給區(qū)分開(kāi)來(lái)，更沒(méi)有能力區(qū)分串粉株和機(jī)械混雜株。

國(guó)外對(duì)于芽鞘紫線的遺傳研究較早，印度學(xué)者Dhulappanavar等利用T-160（芽鞘無(wú)紫線）和AC-177（芽鞘紫線）配置的F2群體，紫線對(duì)無(wú)紫線的分離比為 195 ∶[KG-*3]61，認(rèn)為該性狀受2個(gè)顯性重疊基因[WTBX][STBX]Pc1、Pc2[WTBZ][STBZ]和1個(gè)顯性抑制基因I-Pc、1個(gè)顯性反抑制基因Ai-Pc共4個(gè)基因控制[84-85]；印度的Maekeawa則認(rèn)為該性狀僅受2個(gè)顯性互補(bǔ)基因[WTBX][STBX]Pc-1、Pc-2[WTBZ][STBZ]控制，與褐飛虱抗性連鎖[86]。

1998年，席建民對(duì)5個(gè)雜交組合（母本均具有紫線、父本均為無(wú)紫線）進(jìn)行遺傳分析，F(xiàn)1均表現(xiàn)出紫線，F(xiàn)2紫線 ∶[KG-*3]無(wú)紫線分離比有9 ∶[KG-*3]7、15 ∶[KG-*3]1、63 ∶[KG-*3]1、3 ∶[KG-*3]14共4種類型，這表明紫線遺傳受多對(duì)基因調(diào)控[87]。2009年，張毅等對(duì)水稻芽鞘紫線的遺傳分析發(fā)現(xiàn)了“雙親芽鞘無(wú)紫線但其F1有紫線”的現(xiàn)象，該現(xiàn)象由[WTBX][STBX]OsAi和OsC1[WTBZ][STBZ] 2對(duì)基因控制，并將[WTBX][STBX]OsAi和OsC1[WTBZ][STBZ]分別定為在Chr.11（RM26384和C11Lz2標(biāo)記間）和Chr.6（RM5754和RM19570之間，該區(qū)間的[WTBX][STBX]LOC_Os06g10350[WTBZ][STBZ]為玉米的同源色素合成基因C），同時(shí)提出了選育芽鞘無(wú)紫線而其他器官有紫色的不育系（[WTBX][STBX]Osai OsC1[WTBZ][STBZ]）和芽鞘無(wú)紫線且其他器官無(wú)紫色的恢復(fù)系（[WTBX][STBX]OsAi Osc1[WTBZ][STBZ]），實(shí)現(xiàn)雙親互補(bǔ)，配組芽鞘有紫線的雜交種，用于雜交種純度檢測(cè)的策略。與葉色法相比，該方法不僅可以區(qū)分雜交種中混有的不育系，還可以區(qū)分恢復(fù)系和無(wú)紫線種子的混雜，且芽鞘紫線在發(fā)芽后3 d就可觀察到，近一步縮短了鑒定周期。但該方法與葉色法等其他方法一樣，仍無(wú)法區(qū)分外來(lái)串粉和有紫線種子的機(jī)械混雜。因?yàn)榻^大多數(shù)水稻都含有OsAi基因，串粉株也會(huì)表現(xiàn)為芽鞘紫線；且如果有芽鞘紫線種子發(fā)生混雜，在雜交種中也無(wú)法被識(shí)別出來(lái)。

8結(jié)語(yǔ)

建立準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法監(jiān)控雜交水稻純度對(duì)于保障我國(guó)水稻安全生產(chǎn)具有至關(guān)重要的作用。海南田間種植鑒定是最古老的鑒定方法，因?yàn)槠滂b定方法簡(jiǎn)單且結(jié)果直觀，仍是當(dāng)前最常用的鑒定方法，但是鑒定周期太長(zhǎng)。粒型鑒定和苯酚染色鑒定，由于準(zhǔn)確性差，在純度檢測(cè)上已不常用，只在區(qū)別品種間差異時(shí)會(huì)使用。蛋白質(zhì)電泳法在部分種子公司仍有使用，但是普及率不高。DNA分子標(biāo)記技術(shù)由于其準(zhǔn)確可靠，在種子純度檢測(cè)領(lǐng)域得到了大發(fā)展，隨著DNA分子標(biāo)記成本的降低、通量的進(jìn)一步提高，DNA標(biāo)記技術(shù)會(huì)有更廣闊的應(yīng)用。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)具有美好的前景，可以把幾百份樣品混合為一個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，大大減小了檢測(cè)工作量，但是準(zhǔn)確性仍需要提升，未來(lái)很有可能有新技術(shù)在該領(lǐng)域有突破。設(shè)計(jì)育種鑒定具有鑒定快速、準(zhǔn)確、成本低的特點(diǎn)，但需要對(duì)雜交稻的親本進(jìn)行改良，使不育系攜帶易識(shí)別的隱性性狀，且隱性性狀不能影響到農(nóng)藝性狀，很多報(bào)道的可用于純度檢測(cè)的不育性并沒(méi)能在生產(chǎn)上大規(guī)模應(yīng)用，可能與攜帶的隱性性狀影響到農(nóng)藝性狀有關(guān)。該方法在鑒定兩系雜交水稻種子過(guò)程中，因遇低溫導(dǎo)致不育系自交結(jié)實(shí)，具有很大的應(yīng)用空間?？傮w來(lái)講，雜交水稻純度鑒定方法的發(fā)展趨勢(shì)是由鑒定周期長(zhǎng)向鑒定周期短，由鑒定程序復(fù)雜向簡(jiǎn)單，由成本高向成本低的方向發(fā)展。

參考文獻(xiàn)：

[1][ZK（#]辛良杰，李秀彬. 近年來(lái)我國(guó)南方雙季稻區(qū)復(fù)種的變化及其政策啟示[J].然資源學(xué)報(bào)，2009，24（l）：58-65.

[2]鄧華鳳. 中國(guó)雜交粳稻[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2008.

[3]中國(guó)雜交水稻每年為世界多養(yǎng)7 000萬(wàn)人[N/OL]. 重慶晚報(bào)，2009-09-13.

[4]周天理，童學(xué)軍. 雜交稻混雜退化問(wèn)題[J]. 福建稻麥科技，1985（1）：1-2.

[5]戴劍，李華勇，丁奎敏，等. 植物新品種DUS測(cè)試技術(shù)的現(xiàn)狀與展望[J]. 種子，2007，26（9）：44-47.

[6]李淑娟. 種子純度鑒定方法概述[J]. 青海大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2003，21（1）：16-19.

[7]張輝，姜勇. 雜交水稻品種鑒定和純度分析技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（20）：9416-9419.

[8]滕開(kāi)瓊，戴鋼，徐立新，等. 電泳技術(shù)在種子純度鑒定中的幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004（10）：23-24.

[9]劉敏軒，王赟文，韓建國(guó). 種子真實(shí)性及品種純度蛋白質(zhì)電泳鑒定技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 種子，2006，25（7）：54-57.[ZK）]

[10][ZK（#][JP3]辛景樹(shù)，郭景倫，張軟斌. 幾種常用分子標(biāo)記技術(shù)在種子純度和品種真實(shí)性鑒定方面的比較與分析[J]. 種子，2005，24（1）：58-60.[JP]

[11]嚴(yán)敏，王曉峰. 雜交玉米，水稻和辣椒種子品種真實(shí)性和純度的室內(nèi)決速鑒定[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2003，24（2）：6-8.

[12]王曉峰，黃惠玲，超薄，等. 電聚焦電泳技術(shù)在水稻品種鑒定上的應(yīng)用[J]. 種子，2000，11（4）：6-8.

[13]陸士偉，黃柄權(quán)，鄺章標(biāo)，等. 應(yīng)用酷酶同工酶測(cè)定水稻雜交純度的研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1982，15（5）：10-16.

[14]李卓杰，傅家瑞. 電聚焦電泳對(duì)雜交水稻種子純度鑒定的技術(shù)[J]. 種子，1991（3）：68.

[15][JP2]顏啟傳. 作物品種純度檢驗(yàn)的進(jìn)展[J]. 種子，1984（2）：61-63.[JP]

[16]顏啟傳. 雜交水稻種子及其二系的真實(shí)性與純度鑒定[J]. 種子，1984（3）：15-18.

[17]陶芳，李旭，陳龍英，等. 酯酶同工酶譜分析鑒定雜交水稻種子純度技術(shù)初探[J]. 種子，1997（2）：55-57.

[18]陶芳，陳龍英，夏承東，等. 雜交組合特優(yōu)559室內(nèi)純度檢測(cè)研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001（5）：11-12.

[19][JP3]金偉棟，程保山，洪德林. 基于SSRR標(biāo)記的太湖流域粳稻地方品種遺傳多樣性研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（11）：3822-3830.[JP]

[20]戴劍，洪德林. 試論DNA分子標(biāo)記技術(shù)在植物新品種鑒定中的應(yīng)用前景[J]. 金陵科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，24（4）：56-60.

[21]吳建梅，吳明霞，盧勤，等. 酯酶同工酶電泳法鑒定特有組合種子純度效果研究[J]. 福建稻麥科技，2003，21（2）：18-20.

[22]方宣鈞，劉思衡，江樹(shù)業(yè). 品種純度和真?zhèn)蔚腄NA分子標(biāo)記及其應(yīng)用[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2000，8（2）：106-110.

[23]辛業(yè)蕓，張展，熊易平，等. 應(yīng)用SSR分子標(biāo)記鑒定超級(jí)雜交水稻組合及其純度[J]. 中國(guó)水稻科學(xué)，2005，19（2）：95-100.

[24]張鳳，陳偉. DNA指紋技術(shù)在雜交水稻種子純度鑒定中的應(yīng)用[J]. 種子科技，2006，24（4）：37-39.

[25]李小林，鄧安鳳，徐雨然，等. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)在水稻種子純度鑒定中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，23（4）：54-58.

[26]錢前，陳洪，孫宗修，等. 真假雜交水稻Ⅱ優(yōu)63的RAPD鑒定[J]. 中國(guó)水稻科學(xué)，1996，10（4）：241-242.

[27]楊劍波，李莉，汪秀峰，等. 利用RAPD 技術(shù)檢測(cè)雜交稻種子純度（Ⅱ）：協(xié)優(yōu)63 與其三系DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的區(qū)別[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，1996，24（4）：297-298.

[28]譚孟君，肖層林. 分子標(biāo)記在雜交水稻種子純度鑒定中的應(yīng)用[J]. 作物研究，2006，20（增刊1）：409-412.

[29]楊劍波，李莉，汪秀峰，等. 利用RAPD/SCAR 和SSR 技術(shù)快速鑒定雜交稻種子真?zhèn)闻c純度的研究[J]. 云南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，1999，21（2）：24.

[30]李莉，楊劍波，汪秀峰，等. 利用RAPD和微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)協(xié)優(yōu)雜交稻及其親本進(jìn)行區(qū)別與鑒定[J]. 中國(guó)水稻科學(xué)，2000，14（4）：203-207.

[31]詹慶才. 利用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記進(jìn)行雜交水稻種子純度鑒定的研究[J]. 雜交水稻，2002，17（5）：46-50.

[32]李進(jìn)波，牟同敏，夏建武，等. 利用微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定兩系雜交稻兩優(yōu)培勝的種子純度[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2002，18（6）：10-13.

[33]李進(jìn)波，方宣鈞，楊國(guó)才，等. 兩系雜交稻親本SSR指紋圖譜的建立及其在種子純度鑒定中的應(yīng)用[J]. 雜交水稻，2005，20（2）：50-53.

[34]蘇順宗，黃玉碧，楊俊品，等. 利用SSR鑒定水稻雜交種子純度的研究[J]. 種子，2003（1）：23-25.

[35]彭鎖堂，莊杰云，顏啟傳，等. 我國(guó)主要雜交水稻組合及其親本SSR標(biāo)記和純度鑒定[J]. 中國(guó)水稻科學(xué)，2003，17（1）：1-5.

[36]施勇烽，應(yīng)杰政，王磊，等. 鑒定水稻品種的微衛(wèi)星標(biāo)記篩選[J]. 中國(guó)水稻科學(xué)，2005，19（3）：195-201.

[37]時(shí)寬玉，洪德林. 6個(gè)水稻雜交組合與其親木的SSR標(biāo)記多態(tài)性及其應(yīng)用[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，28（4）：1-5.

[38]程毅，朱水芳，陳紅運(yùn)，等. 三系雜交水稻真?zhèn)渭凹兌葘?shí)時(shí)[JP3]PCR技術(shù)的鑒定[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2007，15（2）：295-300.[JP]

[39]張集文，武曉智. 苯達(dá)松致死標(biāo)記兩用不育系8077S的選育及其應(yīng)用[J]. 雜交水稻，2000，9（6）：5.

[40]張集文，武曉智. 隱性化學(xué)致死標(biāo)記在兩系法雜交水稻大面積推廣中的應(yīng)用[R]. 國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目研究成果年報(bào)（ 生命科學(xué)），1999：25-26.

[41]張集文，武曉智. 水稻光-溫敏雄性不育系化學(xué)致死突變體的誘變篩選與初步研究[J]. 中國(guó)水稻科學(xué)，1999，13（2）：65-68.

[42]Pan G，Zhang X Y，Liu K D，et al. Map-based cloning of a novel rice cytochrome P450 gene [WTBX][STBX]CYP81A6[WTBZ][STBZ] that confers resistance to two different classes of herbicides[J]. Plant Molecular Biology，2006，61（6）：933-943.

[43]黃大年，李敬陽(yáng)，章善慶，等. 用抗除草劑基因快速檢測(cè)和提高雜交稻純度的新技術(shù)[J]. 科學(xué)通報(bào)，1998，43（1）：67-70.

[44]馬志虎，沈曉昆，宋春. 黃綠苗葉色標(biāo)記技術(shù)在辣椒純度鑒定及雄性不育中的應(yīng)用[J]. 長(zhǎng)江蔬菜，2003（1）：36-38.

[45]舒慶饒. 苗期攜帶白化轉(zhuǎn)綠型葉色標(biāo)記的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系白豐A[J]. 今日科技，2004（6）：59.

[46]舒慶堯，陳善福，吳殿星，等. 新型不育系全龍A的選育與研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001，34（4）：349-354.

[47]吳偉，劉鑫，舒小麗，等. 攜帶白化轉(zhuǎn)綠型葉色標(biāo)記兩系雜交不育系NHR111S[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2006，20（2）：103-105.

[48]楊文清，盧華金，林恭松，等. 標(biāo)記不育系標(biāo)培8S選育初報(bào)[J]. 溫州農(nóng)業(yè)科技，2005（4）：48-51.

[49]楊文清. 培矮64S葉色標(biāo)記突變體的研究進(jìn)展[J]. 溫州農(nóng)業(yè)科技，2004（3）：8-9.

[50]沈圣泉，舒慶饒，吳殿星，等. 白化轉(zhuǎn)綠型三系不育系白豐A的選育[J]. 雜交水稻，2005，20（5）：10-11.

[51]沈圣泉，舒慶堯，包勁松，等. 實(shí)用轉(zhuǎn)綠型葉色標(biāo)記不育系白豐A的應(yīng)用研究[J]. 中國(guó)水稻科學(xué)，2004，18（1）：34-38.

[52]趙海軍，吳殿星，舒慶堯，等. 攜帶白化轉(zhuǎn)綠型葉色標(biāo)記光溫敏核不育系玉兔S的選育及其特征特性[J]. 中國(guó)水稻科學(xué)，2004，18（6）：515-521.

[53][JP2]吳殿星，舒慶堯，夏英武，等. 60Co-γ射線誘發(fā)的秈型溫敏核不[JP3]育水稻葉色突變系變異分析[J]. 作物學(xué)報(bào)，1999，25（1）：64-69.[JP]

[54]吳殿星，夏英武，舒慶堯. 植物葉綠素突變體的研究及其應(yīng)用探討[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，1995，11（4）：36-39.

[55]陳善福，舒慶堯，吳殿星，等. 利用射線直接輻照誘發(fā)水稻龍?zhí)馗葉色突變[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，1999，25（6）：569-572.

[56]陳善福，沈圣泉，吳殿星，等. 水稻葉色突變體的稻米理化品質(zhì)和配合力分析[J]. 中國(guó)水稻科學(xué)，2001，15（4）：261-264.

[57]劉貴付，舒慶堯，夏英武.秈型溫敏核不育水稻轉(zhuǎn)綠型白化突變體的利用價(jià)值研究[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，1996，10（3）：129-132.

[58]Su N，Hu M L，Wu D X，et al. Disruption of a rice pentatricopeptide repeat protein causes a seedling-specific albino phenotype and its utilization to enhance seed purity in hybrid rice production[J]. Plant Physiology，2012，159（1）：227-238.