勞拉西泮片有關物質檢查方法的比較

袁猛　余振喜　王慧文　王菲菲

[摘要] 目的 比較并討論中國藥典2015年版二部和美國藥典39版中勞拉西泮片有關物質檢查方法的異同，為選擇合理有效的有關物質檢測方法提供科學依據。 方法 比較兩種檢測方法在雜質分離能力、方法學以及檢測結果一致性等方面的差異并進行評價。 結果 采用中國藥典檢測方法對勞拉西泮片中主要雜質之間的分離效果差，從而影響有關物質結果的判定；美國藥典檢測方法雜質分離好，靈敏度高，提高了分析方法的專屬性和結果的準確性。 結論 美國藥典有關物質檢測方法更適合勞拉西泮片中雜質的控制，從而保證該產品的質量和安全。

[關鍵詞] 勞拉西泮片；高效液相色譜法；有關物質；檢測方法；分離度

[中圖分類號] R917 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2016）09-40-05

[Abstract] Objective To compare and discuss the differences and similarities of related substances test method on lorazepam tablets between Chinese pharmacopoeia 2015 edition two and United States pharmacopoeia 39 edition. Methods The differences in the aspects of impurity separation capability， methodology and the consistency of test results etc between the two test methods were compared and evaluated. Results The separation effect of major impurities in lorazepam tablets by the test method of Chinese pharmacopoeia was bad， which could influence the determination of related substances result， while the impurity separation effect by the test method of United States pharmacopoeia was good， had high sensitivity and improved the specificity of analytical method and the accuracy of results. Conclusion The relative substances' test method of United States pharmacopoeia was more suitable for the impurity control in lorazepam tablets， which ensured the quality and safety of the product.

[Key words] Lorazepam tablets；High performance liquid chromatography method；Related substances；Test method；Separating degree

勞拉西泮屬于苯二氮類精神安定藥，具有鎮靜、催眠和抗癲癇等作用[1-3]。其常用口服固體制劑勞拉西泮片是一線抗癲癇持續狀態的首選藥物[4-7]。查閱各主要國家和地區藥典，勞拉西泮原料藥在歐洲藥典8.0版（EP8.0）[8]、英國藥典2016年版（BP2016）[9]、美國藥典39版（USP39）[10]、日本藥局方ⅩⅥ版（JP16）[11]和中國藥典2015年版二部（ChP2015）[12]均有收載，其制劑勞拉西泮片在BP2016、USP39和ChP2015有收載。根據文獻報道[13-15]，勞拉西泮易受酸和熱等條件影響降解產生出6-氯-4-（鄰氯苯基）-2-喹唑啉甲醛（即USP39中雜質C）等雜質，因此，收載有本品及其制劑的藥典中均設立了有關物質檢查項。其中，在勞拉西泮片有關物質檢查項下，BP2016采用薄層色譜（TLC）法，USP39和ChP2015采用高效液相色譜（HPLC）法。

在實際檢驗檢測工作中發現，采用ChP2015色譜條件對勞拉西泮片中有關物質進行檢查時，雜質C與相鄰雜質不能有效分離，造成測定結果不準確甚至可能造成檢驗結論的誤判。同時，通過試驗發現，USP39中勞拉西泮片有關物質檢測方法靈敏度高，專屬性強，各雜質之間以及雜質與主成分之間分離度較好，該方法優于ChP2015中的檢測方法，更適合勞拉西泮片有關物質的檢測和控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀；Sartorius CP225D型電子天平；GW-UP型普析通用超純水器；天大天發科技有限公司YB-2型澄明度檢測儀；上海一恒科學儀器有限公司HWS-24型電熱恒溫水浴鍋。

1.2 試藥

勞拉西泮片（A廠家，規格：1mg，批號：131002，140301，140402；B廠家，規格：1mg，批號：B140701，B140434）；勞拉西泮片輔料由廠家提供；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 ChP2015有關物質檢查方法（ChP法）

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：0.05mol/L磷酸二氫銨溶液（含0.5%三乙胺，用磷酸調節pH值至2.5）-甲醇-乙腈（40∶35∶30）；流速：1.0mL/min，檢測波長：230nm，柱溫：30℃，進樣量：20μL；稀釋溶劑：乙腈。

2.1.2 測定方法 取本品細粉適量（約相當于勞拉西泮2mg），置10mL量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取需濾液作為供試品溶液。精密量取供試品溶液20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成份保留時間的3倍。

2.1.3 測定結果 雜質C與相鄰雜質（相對保留時間分別約為1.9和1.8）不能有效分離（圖1B），將色譜柱更換為Xtimate-XB C18柱（150mm×4.6mm，5μm）（圖1C）或Diamonsil C18柱（圖1D）（150mm×4.6mm，5μm），并通過改變流動相比例±5%、pH值±0.2、柱溫±5℃等條件下均不能有效改善雜質分離情況，雜質C與相鄰雜質重疊嚴重，甚至重合，影響了有關物質的指認和結果判定。

2.2 USP39有關物質檢查方法（簡稱USP法）

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：水-乙腈-冰醋酸（50∶50∶1.2）；流速1.0mL/min，檢測波長：230nm，柱溫：30℃；稀釋溶劑：甲醇-緩沖液（三水合乙酸鈉67.7g，加水1L溶解，用冰醋酸調pH值至5.0±0.05）（75∶25）。

2.2.2 測定方法 除稀釋劑外，其余條件同“2.1.2”項。

2.2.3 測定結果 與ChP法雜質檢出個數一致，均檢出3個雜質，但本法色譜圖中，雜質C與相鄰雜質（相對保留時間分別為2.2和1.8）能完全分離，主峰和各雜質峰對稱性良好，各雜質峰均能夠準確積分。USP法條件下得到的典型色譜圖見圖2。

2.3 兩種方法有關物質檢查比較

2.3.1 USP法和ChP法檢測兩廠家勞拉西泮片的有關物質 由表1可知，兩種方法檢出的雜質個數一致，但USP法檢出總雜質的總量更高。采用ChP法檢測結果發現，在不同色譜柱上，雜質C均拖尾嚴重，不能與相鄰雜質有效分離，因此不能分別對雜質C和相鄰雜質進行準確積分和定量。而采用USP法檢測結果發現，雜質C與相鄰雜質分離效果好，并能準確積分和定量，且各雜質峰對稱性和重現性均良好。

2.3.2 檢測限 采用USP法，精密稱取勞拉西泮對照品適量，用稀釋劑溶解并制成0.0979μg/mL的溶液，測得檢測限為1.958ng；采用ChP法，精密稱取勞拉西泮對照品適量，用乙腈溶解并制成0.1857μg/ml的溶液，測得檢測限為3.714ng。

2.3.3 溶液穩定性試驗 分別取“2.1.2”和“2.2.2”項下供試品溶液，室溫條件下放置，分別在第0、4、8h時進樣，記錄色譜圖。結果表明，兩種色譜條件下，供試品溶液在8h內均穩定。

2.3.4 耐用性試驗 按USP法，將色譜柱更換為Xtimate-XB C18柱（150mm×4.6mm，5μm）和Diamonsil C18柱（150mm×4.6mm，5μm），采用“2.2.1”項下色譜條件，并通過改變流動相比例±5%、pH值±0.3、柱溫±5℃的情況下，對本品進行有關物質測定。結果顯示，在上述各種條件下，有關物質測定結果基本一致，勞拉西泮主峰與相鄰雜質峰以及各雜質峰之間分離度良好，表明USP法耐用性良好。

2.3.5 專屬性試驗 按照企業提供的處方比例，取混合均勻的輔料適量（約相當于勞拉西泮2mg），置10mL量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取濾液作為輔料溶液，進樣測定，記錄色譜圖。結果表明，在兩種色譜條件下，輔料均在相對保留時間約為0.4處出現色譜峰，應在積分和計算時加以扣除。

2.3.6 強制破壞試驗 按USP法，稱取勞拉西泮對照品約10mg，置25mL量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。分別量取對照品儲備液5.0mL，置5個10mL量瓶中，其中三個分別加入1mol/L鹽酸溶液，1mol/L氫氧化鈉溶液和3%雙氧水溶液2ml，室溫下放置2h，加稀釋劑稀釋至刻度；另兩個先加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，一個置60℃水浴中加熱2h，另一個于4500lx照度下放置24h。取上述各溶液分別進樣，記錄色譜圖。結果表明，勞拉西泮在酸、堿、氧化、光照與熱等強制性破壞條件下產生的降解產物均能與主峰有效分離。結合2.3.5專屬性試驗結果可知，各降解產物峰均在勞拉西泮峰之后，輔料峰不干擾降解產物峰的指認和計算。

3 討論

通過試驗發現，采用ChP2015法檢查勞拉西泮片有關物質即使達到標準中系統適用性試驗要求（雜質C與勞拉西泮峰分離度大于4.0），雜質C與相鄰雜質仍不能有效分離。在勞拉西泮片有關物質限度控制的要求中，ChP2015標準對勞拉西泮片雜質C及總雜質的限度做出了規定，而USP39標準對勞拉西泮片的每一個雜質限度均做出了規定。作為勞拉西泮片的易降解雜質之一，雜質C是勞拉西泮片質量控制的重要內容。因此，勞拉西泮片有關物質檢查項目中包含雜質C在內的主要雜質間的有效分離是保證其質量控制的前提條件。

通過試驗比較，采用ChP2015法很容易將雜質C與其相鄰雜質誤判為一個雜質，進而造成檢測結果的錯誤。若按藥典規定范圍內微調流動相組份等條件，雜質C拖尾嚴重，也無法達到與相鄰雜質的有效分離，雜質C和相鄰雜質均不能夠準確積分和定量，對檢測結果的判定有較大影響；而采用USP法雜質C與相鄰雜質分離良好，能對各雜質準確積分和定量，方法靈敏度較高，色譜條件明顯優于ChP2015法。因此，建議優化ChP2015中勞拉西泮片有關物質檢查方法。

在ChP2015法與USP39法兩種色譜條件下，輔料均在相對保留時間約為0.4處出現色譜峰，建議在質量標準有關物質檢查項下限度規定時明確指出“扣除相對保留時間約為0.4之前的溶劑峰和輔料峰”。

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（收稿日期：2016-03-07）