褪黑激素對雌性動物生殖系統調節作用的研究進展

王淑娟++劉文舉++王立克++龐訓勝++車傳燕

摘要：褪黑激素的分泌具有日節律和季節性節律，對季節性繁殖動物的生殖功能具有重要的調節作用。大量研究表明，褪黑激素對生殖系統的影響因動物種類、生理狀況的不同而表現出多重性，具有促進、抑制作用或無作用。褪黑激素對于牛、鼠類、禽類、人等均具有抑制生殖作用，對于綿羊、鹿等動物均具有促進生殖作用，而對光不敏感的動物無作用。光照對生殖機能的調節依靠褪黑激素介導傳遞到下丘腦-垂體-性腺（HPG）軸。褪黑激素調節下丘腦分泌促性腺激素釋放激素（GnRH），而GnRH調控LH和FSH的分泌，進而調節性腺水平的生殖功能。近年來的研究表明，褪黑激素也可直接作用于卵巢，調控雌性動物的生殖系統及功能。

關鍵詞：褪黑素；雌性動物；卵巢；顆粒細胞；胚胎

中圖分類號： Q492.5文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）06-0015-05

1褪黑激素對下丘腦-垂體-性腺軸的調節作用

動物生殖系統的發育和功能維持是機體內外各種調控因素綜合作用的結果，而HPG軸則起主要調控作用。下丘腦、垂體、性腺在中樞神經的調控下形成一個自動反饋系統（圖1），三者相互協調、相互制約，使動物的生殖內分泌系統保持相對穩定。來自外部的各種刺激（視覺、聽覺、嗅覺等刺激）以及機體內部的刺激經過中樞神經系統的分析與整合，傳至或刺激下丘腦特殊部位，從而間歇性脈沖式分泌GnRH。GnRH 通過垂體門脈系統或神經細胞的軸突末梢刺激垂體前葉分泌促性腺激素、卵泡刺激素（FSH）、促黃體素（LH）。垂體分泌的FSH和LH通過外周血液循環作用于性腺，使其分泌睪酮或雌二醇，促進睪丸或卵巢的發育，從而控制動物的個體發育和生殖過程。GnRH的分泌是脈沖式的，脈沖式分泌可誘導LH峰的出現，外周血LH與GnRH水平呈伴隨性變化。然而，GnRH對FSH的影響不如對LH的影響明顯，可能是由于FSH的分泌更大程度上受到卵泡內分泌物的反饋調節。下丘腦不僅分泌GnRH，還分泌促性腺釋放抑制素（GnRI），可抑制GnRH的合成與釋放[1]。

HPG的調控不是單向的，而是雙向的，反饋調節在生殖過程中也具有重要作用。垂體促性腺激素和性腺激素也可反饋調節GnRH的釋放。一般認為，FSH和LH分泌水平的升高常引起GnRH脈沖釋放的減弱，反之亦然。

褪黑激素分泌受光照的影響，其通過下丘腦-垂體-性腺軸（HPG）的信號傳導調節季節性繁殖動物的生殖功能，且在下丘腦GnRH釋放神經元、垂體前葉結節部、遠端促性腺細胞[CM（25]和泌乳細胞、睪丸、卵巢等部位的褪黑激素受體作用下完成[2-5]。褪黑激素對HPG主要表現為抑制作用，在培育24 h后的GnRH釋放細胞中，褪黑激素減少GnRH mRNA的表達[4]。可斷定，褪黑激素可直接調節下丘腦神經元的GnRH分泌，進而調節GnRH控制的促性腺激素、促黃體素（LH）、促卵泡素（FSH）的分泌，從而調節生殖功能。在新生小鼠垂體部位表達的褪黑激素受體通過百日咳毒素敏感性G蛋白偶聯受體激活，可抑制GnRH誘導的LH的釋放、cAMP與cGMP的積累、細胞內Ca2+的增加[6-8]。

2褪黑激素對卵巢功能的直接調控作用

已有研究表明，褪黑激素可調節HPG的作用以及動物的生殖系統，褪黑激素對卵巢功能的直接調節作用對動物的生殖生理也頗為重要。卵巢卵泡液中褪黑激素的存在可表明褪黑激素對卵巢功能具有直接作用。MT1、MT2在卵巢組織及顆粒細胞中的表達，可進一步證明褪黑激素在卵巢中通過褪黑激素受體直接調節卵巢功能。

卵泡液中的褪黑激素可能是在顆粒細胞中合成的，但此外還有來自血液中的褪黑激素。褪黑激素可調節顆粒細胞和卵泡內膜細胞中甾體生成酶的活性及其基因表達，從而調節性激素的生成。褪黑激素也可調節LH mRNA表達、Bcl-2和Casp3（與細胞凋亡相關的一種蛋白酶）生成、胰島素生長因子（IGF）和轉化生長因子-β（TGF-β）活性，并誘導成熟激素（MIH）基因表達和活性。巨噬細胞[JP2]和顆粒細胞中生成的ROS和褪黑激素可調節顆粒細胞中SOD、谷胱甘肽過氧化酶（GPx）、過氧化氫酶（CAT）基因表達。過多ROS誘導凋亡而導致卵泡閉鎖，然而卵泡液中高水平的褪黑激素可發揮其直接和間接抗氧化作用以清除ROS，從而防止卵泡閉鎖[9]。由高水平褪黑激素保護的卵泡可繼續生長，成為優勢卵泡（圖2）。

2.1褪黑激素對卵泡的生長調控研究進展

近年來，體外受精、胚胎移植、動物克隆等技術發展迅速，并在家畜優良品種推廣、瀕危動物繁殖、資源保護上得到廣泛應用，因此對高質量成熟卵母細胞的需求迅速增加。常規的超排技術難以滿足需要，卵母細胞的成熟機制及體外培養技術已成為當前的研究熱點。卵泡的生長和卵母細胞的成熟是一個非常復雜的過程，包括內分泌、旁分泌、自分泌機制。卵泡的生長開始于卵泡池的確立。[JP2]原始卵泡生長經過初期、竇前期、竇期才能達到排卵前期，然后釋放卵母細胞以受精。在生長過程中，竇前期后期、竇期早期的生長依靠FSH水平維持。卵巢內每個生殖周期中的大部分卵泡為備用卵泡，只有小部分（<0.1%）能發育到成熟階段并排出卵子。囊狀卵泡是一個充滿液體的小個體，終結于成熟卵泡。卵泡內充滿水、電解質、血清蛋白及由顆粒細胞分泌的高濃度類固醇激素[10]。[JP]

人的排卵期卵泡中存在季節性變化的高水平褪黑激素，其濃度是血清中的3倍[11]。在接受體外受精胚胎移植的患者體內發現，大卵泡中褪黑激素濃度高于小卵泡。褪黑激素及其母體、5-羥色胺、N-乙酰-5-羥色胺存在于人的卵巢提取物中，且褪黑激素合成酶NAT、HIOMT也存在于人的卵巢勻漿液中[12]，表明卵巢可能合成褪黑激素釋放進卵泡內。備用卵泡具有誘導一系列mRNA表達的特征，這些mRNA主要編碼類固醇合成酶、促性腺激素受體、局部調節因子。卵泡發育成熟過程中，對激素的依賴也發生了變化，從FSH依賴轉為LH依賴，該機制也許是成熟卵泡選擇機制。卵泡選擇機制與顆粒細胞中編碼LH受體的mRNA的表達時間有關[13]。在人的顆粒細胞中，褪黑激素（10 pmol/L～100 nmol/L）可增加LHR mRNA、GnRH、GnRHR mRNA的表達[14]。

性激素對卵巢細胞的生長和分化具有重要作用。雌激素與促性腺激素協同作用于顆粒細胞的生長和分化[15]。孕激素對卵泡生長和發育的作用是有限的，但可調節顆粒細胞的功能和排卵過程中卵泡的破裂[16]。雄激素可促進卵泡的早期生長[17]，但也通過刺激閉鎖和凋亡而阻礙了卵泡的發育[18]。在卵泡成熟的各個階段，褪黑激素均調節性激素的分泌。Adriaens等證實，采用褪黑激素（100 μmol/L）孵育小鼠竇前期卵泡，可增加孕激素（P）、雄烯二酮（A）的生成[19]。在豬囊狀卵泡中，褪黑激素也刺激P和A的合成，但不影響雌二醇（E2）的合成。Soares等證實，松果體切除后卵巢中的閉鎖卵泡數增加，E2水平顯著增加，而P減少[20]。在人的排卵前卵泡中，P與褪黑激素的濃度成正比[21]。相反，采用hCG孵育24 h后的倉鼠排卵前卵泡中，褪黑激素減少P、E2、cAMP的合成。當卵泡膜細胞與顆粒細胞分離時，褪黑激素減少膜細胞合成的P，而對顆粒細胞無影響。在cAMP調節的類固醇合成途徑的早期階段，褪黑激素可直接抑制卵泡類固醇生成。該結果與另一報道相一致，即褪黑激素阻止類固醇合成急性調節蛋白的[JP2]表達[22]。類固醇合成急性調節蛋白決定了膽固醇穿過膜間隙進入內膜，在那里細胞色素裂解酶（P450 SCC）可裂解膽固醇為孕烯醇酮。在小鼠的萊迪希腫瘤細胞中，褪黑激素減少由hCG刺激的類固醇合成急性調節蛋白的表達。然而，褪黑激素直接作用于卵泡類固醇合成是復雜的，要依賴于細胞類型（膜細胞或顆粒細胞）、持續時間（短暫或長期作用）、試驗模型（細胞培養或卵泡培養）、物種、計量。[JP]

卵巢外信號和卵泡內因子共同決定卵泡是否繼續發育或轉向閉鎖途徑。褪黑激素可清理生長卵泡內的RNS和ROS，[JP3]刺激抗氧化酶活性，也可調節抗氧化酶、抗凋亡或促凋亡蛋白基因的表達。生長卵泡中褪黑激素濃度的增加是卵泡避免閉鎖的重要因素，卵泡可繼續發育成熟，并釋放卵母細胞以供受精。[JP]

2.2褪黑激素改善卵母細胞質量

劣質卵母細胞對于女性的不孕不育是一個重要問題。卵泡在排卵過程中產生大量ROS，這些氧化應激作用可能是導致卵母細胞劣質的原因之一。·OH、O2-·、H2O2在卵母細胞中均已被發現，它們導致細胞膜脂質體劣化、破壞DNA、加速凋亡、誘導二細胞阻滯和凋亡、抑制受精。與未分散胚胎和未受精卵母細胞相比，分散胚胎內的H2O2水平顯著較高。ROS的產生與抗氧化劑清除能力之間的平衡，是卵母細胞成熟和受精的重要因素之一。

利用藥物保護卵母細胞和滋養層細胞免受損害是非常重要的。卵泡中存在高水平的褪黑激素，顆粒細胞中存在褪黑激素受體，均表明吲哚胺有益于卵泡。劣質卵母細胞的婦女卵泡內8-羥基-2′-脫氧鳥苷（8-OHdG，一種損害DNA產物的生物標記）濃度顯著高于正常卵母細胞的婦女。褪黑激素可顯著降低卵泡內8-OHdG的濃度[22]，也可影響抗氧化酶活性及其基因表達。褪黑激素增強了SOD活性[23]，在其生理濃度下，誘導3種抗氧化酶（Cu，Zn-SOD、Mn-SOD and GPx）的基因表達。對于因卵母細胞劣質而無法生育的婦女，褪黑激素可作為改善婦女卵母細胞質量的良好藥物[24]。

褪黑激素也可調節卵母細胞成熟[19]。17α，20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one（17α，20β-DP）是一種孕激素類固醇，是一種成熟誘導激素[25]，作用于卵母細胞膜上的受體，誘導卵母細胞質內成熟促進因子的活性[26]。近期研究表明，褪黑激素影響鯉魚卵母細胞成熟過程中成熟誘導激素的活性。褪黑激素加速了成熟誘導激素對成熟促進因子激活、卵母細胞胚泡破裂的作用[27]。在培養液中添加褪黑激素，不僅可促進小鼠受精，也可促進胚胎組織的早期發育[28]。Rodriguez 等報道，褪黑激素可使豬胚胎的卵裂率升高，且囊胚細胞數增加[29]。另外，褪黑激素可提高凍融囊胚的孵化率，并促進其發育[30]。毒性試驗表明，褪黑激素對胚胎發育并無副作用[31]。

褪黑激素是一種抗氧化劑和自由基清理劑，對卵母細胞的質量和成熟、胚胎的發育具有重要作用。在體內，羊皮下埋植的外源褪黑激素增加動物體內卵巢卵泡的更新，與對照組相比，試驗組的卵母細胞總數沒有顯著變化，但卵母細胞的發育活力增加，表現為體外受精和培養后卵母細胞的卵裂率增加，促進胚胎發育，提高囊胚率[32]。體外試驗表明，在24、48 h 內，褪黑激素可增加羊的玻璃化冷凍囊胚成活率[33]。在小鼠和牛體外受精后的體外胚胎培養液中添加褪黑激素，可促進胚胎發育[28，34]。在豬的卵母細胞體外成熟中，外源褪黑激素對細胞核、細胞質的成熟起到有利作用[35]。Takada等證實，褪黑激素對牛卵丘細胞的擴散、卵母細胞的細胞核成熟沒有顯著作用，高濃度褪黑激素增加減數分裂中期階段的卵母細胞成熟[36]。El-Raey等研究表明，牛卵丘卵母細胞復合體中存在褪黑激素受體MT1和MT2的表達，卵母細胞中只有MT2的表達[37]。體外成熟培養液中的褪黑激素可促進卵母細胞核的成熟、卵丘細胞的擴散，并改變線粒體的分布模式，但對卵母細胞線粒體的活性、卵丘卵母細胞復合體中甾體的合成沒有影響，褪黑激素可降低卵母細胞內ROS的水平。在體內和體外毒性試驗中，并未發現褪黑激素在小鼠胚胎發育過程中的副作用。

2.3褪黑激素對顆粒細胞功能的影響

哺乳動物卵泡發育是一個極其復雜的過程。卵泡主要由1個卵母細胞、外周顆粒細胞、卵泡膜細胞等組成，顆粒細胞增殖、分化、凋亡對卵泡發育具有重要作用。顆粒細胞分泌的一些激素和調控因子對卵母細胞生長成熟具有重要作用。卵巢卵泡內存在較高濃度的褪黑激素，對卵泡發育具有重要的調控作用。研究表明，褪黑激素對顆粒細胞的發育及功能也具有重要作用。

早在20世紀80年代就已證實，褪黑激素對顆粒細胞具有調節作用。Fiske等證實，褪黑激素刺激體外培養小鼠卵巢顆粒細胞中孕酮的分泌，但不能調節雌激素的分泌；然而，當在與人絨毛膜促性腺激素的伴同下，褪黑激素可顯著增加孕激素的分泌；褪黑激素抑制睪丸雄激素的合成[38]。Webley等研究表明，褪黑激素可直接刺激體外培養的人和牛顆粒細胞中孕酮的分泌[39]。褪黑激素對顆粒細胞的調節作用逐漸引起人們的重視，Yie等利用放射性褪黑激素類似物 2-[125I]-iodomelatonin 檢測到，人的顆粒細胞膜部位存在褪黑激素結合位點[40]。體外培養細胞7 d，褪黑激素受體濃度增加，但親和力并無增加。在小鼠、大鼠、人等卵巢中已檢測到褪黑激素受體MT1和MT2的表達，MT1和MT2 mRNA存在于人、豬的顆粒細胞中。這一發現進一步表明，卵泡中的褪黑激素在卵巢顆粒細胞中具有重要的生理作用。Woo等利用RT-PCR方法，在人的卵巢顆粒細胞中檢測到褪黑激素受體MT1和MT2 mRNA的表達，且褪黑激素可調節LH、FSH、GnRH 受體及GnRH的表達[14]。在羊、小鼠、豬的顆粒細胞中，褪黑激素有著相似的作用。Baratta等研究表明，褪黑激素刺激羊顆粒細胞中孕酮和雌二醇-17β的分泌，但對2種激素的影響是不同的，褪黑激素可單獨作用于顆粒細胞增加孕酮的分泌，但對雌二醇17β沒有作用[41]。褪黑激素對豬顆粒細胞的影響不同于牛和羊，可抑制孕酮的生成而增加雌激素的生成[42]。可見，褪黑激素對動物生殖功能的調節隨物種的不同而有所不同，且根據細胞類型、培養時間、試驗模型、培養液的不同，其作用也不同。褪黑激素對細胞的增殖和凋亡也有一定作用，不同細胞類型在不同濃度和處理時間下，其結果不同。通常褪黑激素對正常的細胞具有抗凋亡作用，并抑制癌細胞的生長，誘導腫瘤細胞的凋亡。Jou等研究證明，褪黑激素通過線粒體途徑減少了氧化誘導的凋亡[43]。褪黑激素與環磷酰胺共同作用于尿道上皮細胞，顯著增加細胞的增殖，減少了凋亡。Wang等研究表明，褪黑激素對牛的顆粒細胞具有抗凋亡作用[44]。激素調節卵巢的功能不僅依靠激素的水平，其激素受體的表達也必不可少。

3褪黑激素對胚胎發育的影響

在哺乳動物體內，卵巢排卵后，卵泡液帶著卵子緩慢流出，至腹腔內輸卵管壺腹末端，在此與精子結合而受精，胚胎在輸卵管中就開始發育。可以推測，卵泡液中高濃度的褪黑激素可能發揮其生理功能，調節受精和早期的胚胎發育。另外，胚胎發育過程中的氧化應激作用阻滯胚胎發育，而褪黑激素作為抗氧化劑和自由基清除劑，也可保護胚胎免受氧化壓力。褪黑激素對體內和體外胚胎發育具有重要保護作用。

外源褪黑激素的植入可改善體內胚胎的活力。Forcada等在高齡、高繁殖力的Rasa Aragonesa母羊超排后植入外源褪黑激素，以證明乏情期褪黑激素對胚胎產生的作用。連續2年季節性乏情期間，完成113只超排處理。試驗設為2組，植入褪黑激素的為試驗組，沒有植入褪黑激素的為對照組。在排出和產生功能性黃體的88只羊（78%）中，褪黑激素通過增加每個超排處理的囊胚數、存活率、受精率以改善胚胎的活力，且褪黑激素顯著減少了退化胚胎數目和概率[45]。Vázquez等研究了在成年Rasa Aragonesa羊的乏情期和繁殖期，褪黑激素和營養不良對胚胎活力的影響。采用隨機分配的模式，設計了2個試驗4個處理組，即2×2×2。皮下植入褪黑激素、不植入褪黑激素的個體每天分別飼喂0.5、1.5次，持續20 d。結果表明，在繁殖季節和乏情季節，營養和褪黑激素補充并沒有改善排卵率和卵子數；低營養的褪黑激素處理組中，每只羊的活性胚胎數顯著低于對照組、對照的褪黑激素處理組。在繁殖季節，營養不良影響羊胚胎的活力，但是褪黑激素處理營養不良羊改善了其胚胎的活力[46]，這些結果足以證明褪黑激素和營養的互作可以改善胚胎發育。Vázquez等再次驗證，外源褪黑激素對間情期斷奶后營養不良的羊體內胚胎活力、卵母細胞質量具有一定作用[47]。結果表明，褪黑激素顯著提高了受精胚胎數、活力胚胎數、存活率、妊娠率；對于營養不良的母羊，褪黑激素改善了胚胎的活性。

受光照周期、高濃度氧、培養基、代謝產物的影響，體外胚胎發育過程中產生大量的ROS，會對細胞膜和DNA造成嚴重損害；因此，在培養液中添加合適的抗氧化劑，是保護體外胚胎發育過程中免受氧化應激損傷的有效措施。褪黑激素已被公認為一種良好的自由基清除劑和抗氧化劑，在很多方面發揮該作用，近年來也被廣泛應用于體外胚胎發育體系。

超氧陰離子（ O-2[KG-*2]· [KG-*3]）和過氧化氫（H2O2）是小鼠體外胚胎發育2-細胞期阻滯的重要原因，褪黑激素作為一種自由基清除劑和抗氧化劑，可有效保護小鼠體外胚胎發育。Ishizuka等證實，褪黑激素有助于體外受精和受精后的早期胚胎發育，10-6、10-4 mol/L濃度的褪黑激素可提高小鼠體外受精率，當培養液中添加10-8、10-6 mol/L濃度的褪黑激素時，4-細胞胚、8-細胞胚、囊胚率均增加[28]。Tian等研究證明了褪黑激素對小鼠2-細胞胚胎體外發育的作用[48]。褪黑激素以劑量依賴性模式對小鼠2-細胞胚胎體外發育產生有利作用。褪黑激素對囊胚形成率、孵化囊胚、囊胚細胞數的作用是雙向的，10-13～10-5 mol/L的褪黑激素發揮正向作用，而10-3 mol/L 的褪黑激素則發揮負向作用。褪黑激素對小鼠2-細胞胚胎體外發育的最佳濃度為10-9 mol/L。褪黑激素對豬的體外胚胎發育也有影響，Jang等將豬體外成熟或體外受精后的胚胎培養在添加了不同濃度（1、5、10 nmol/L）褪黑激素的培養液中。結果表明，與對照組相比，1 nmol/L褪黑激素處理組的桑葚胚率顯著增加；與 10 nmol/L 褪黑激素處理組相比，對照組及1、5 nmol/L褪黑激素處理組的胚胎內細胞團和滋生層細胞數據均顯著增加。胚胎內抗氧化酶基因表達也受褪黑激素處理的影響，0、1、5 nmol/L的褪黑激素減少了Catalase mRNA水平，10 nmol/L的褪黑激素減少了bax和caspase-3 mRNA的表達[49]。Rodriguez等驗證了褪黑激素可促進豬體外胚胎發育，結果表明，10-9 mol/L的褪黑激素可顯著提高卵裂率，并能提高囊胚中的細胞數；此外，進一步研究了褪黑激素對抗應激的作用，在體外胚胎培養中H2O2（0.01 mmol/L）和高溫40 ℃的情況下，褪黑激素可抵抗高壓而增加卵裂率，但對H2O2作用下的胚胎沒有正面影響，推測其原因可能是褪黑激素不能消除藥理學濃度H2O2的作用[29]。Choi等在豬的孤雌胚胎發育中證實，褪黑激素提高卵裂率和囊胚率的同時，可顯著降低ROS水平[50]。褪黑激素對牛、羊等哺乳動物的體外胚胎發育也有類似作用。

褪黑激素對胚胎發育的影響已被廣泛研究，但褪黑激素受體在早期胚胎發育中的表達仍研究較少。在斑馬魚中，褪黑激素受體在發育中的胚胎、新生兒中的表達高于成年斑馬魚[51]。褪黑激素受體mRNA首次于受精后18 h被檢測到，隨后廣泛快速表達，該現象表明很多胚胎組織是褪黑激素的靶位點。截至24 h，褪黑激素受體在腦中的表達信號非常強，而背部主動脈的表達變弱，且尾部和軀干的表達減少[JP2]。研究發現，在褪黑激素受體開始表達前，褪黑激素不能影響胚胎內細胞的增殖；而當褪黑激素受體開始表達時，褪黑激素顯著增強了胚胎細胞增殖。在大齡胚胎（38 h）中褪黑激素受體的作用減弱，此時胚胎內褪黑激素受體的表達也在減少。由上述數據可推斷，褪黑激素對胚胎的作用與褪黑激素受體在胚胎中的表達是同步的，且褪黑激素受體參與調節褪黑激素的作用。[JP]

4總結與展望

褪黑激素是具有多種功能的光信號激素，通過改變其分泌水平，將光照信息傳遞給體內相關組織和器官，使其功能活動適應外界環境的變化。大量研究表明，雌性動物卵巢中存在褪黑激素及其受體；褪黑激素可直接調節人、羊、小鼠、豬等動物的卵巢功能，如刺激性激素分泌、促進卵母細胞成熟、誘導胚胎著床等，進而調節動物的生殖活動，對季節性繁殖的動物影響更為顯著。除了對雌性動物生殖活動的調節外，褪黑激素還具有調節免疫系統、抗氧化、抗衰老等其他功能；近年來的研究表明，褪黑激素及其受體對癌細胞的抑制具有重要作用。褪黑激素的生物作用如此廣泛，對褪黑激素及其受體的研究越來越受到人們重視，特別是其對動物生殖系統的調節作用。褪黑激素對動物生殖系統的調控機制及其調控通路有待進一步研究。褪黑激素在人類保健品中已被廣泛應用，如何將褪黑激素在生殖系統中的功能利用于畜牧生產依然是值得關注的熱點。利用動物模型研究褪黑激素對卵母細胞、胚胎成熟及發育的作用，可為人類輔佐生殖技術提供有利參考。[JP]

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