葫蘆科作物游離小孢子培養研究進展

胡雪丹 張曼 徐錦華 劉廣 姚協豐++李蘋芳++陳學好 羊杏

摘要：探討葫蘆科作物在游離小孢子培養中（與花粉培養）的優勢，闡述游離小孢子培養過程中供體植株基因型、供體植株生理狀況、預處理、小孢子發育時期、培養基種類、培養基成分、培養條件等諸多因素的影響，并針對葫蘆科蔬菜游離小孢子培養中存在的問題提出后續研究方向。

關鍵詞：葫蘆科作物；游離小孢子培養；優勢；影響因素

中圖分類號： Q943.1文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）06-0025-05

葫蘆科作物在世界園藝作物生產中占有非常重要的地位，隨著人們消費需求的增加，葫蘆科作物的栽培面積逐年增大。葫蘆科作物包括118屬825種，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區，中國約有29屬142種，常見的主要有西瓜、甜瓜、苦瓜、黃瓜、西葫蘆等，栽培面積大且具有較高的經濟效益，在人們日常生活中具有重要作用。由于葫蘆科作物的常規遺傳育種方法育種周期長、難度大、遺傳性狀不穩定，常規育種的不足在實際工作中日漸明顯，各國學者開始尋找育種的新途徑和新方法。單倍體育種技術為縮短育種年限、提高育種效率提供了可能，因此在葫蘆科作物中開展以離體培養為基礎的生物技術育種研究顯得尤為重要。獲得單倍體葫蘆科植物最常見的方法是通過輻射花粉授粉，誘導單倍體胚胎進行原位孤雌發育。近年來，離體雄核發育途徑生產單倍體技術逐漸受到重視，離體雄核發育途徑有花藥離體培養和游離小孢子培養，其效果可以媲美輻射花粉授粉技術[1]。早在1971年，西貞夫等在黃瓜花藥培養的研究中獲得了不定芽。之后的幾十年里，學者們致力于花粉離體培養，已經在葫蘆科作物中的南瓜屬、葫蘆屬、西瓜屬、甜瓜屬、苦瓜屬等獲得了單倍體[2]。與花藥離體培養相比，葫蘆科作物游離小孢子培養起步較晚、研究相對較少，僅在黃瓜、西瓜、甜瓜上獲得了胚狀體或再生植株。

1葫蘆科作物游離小孢子培養的優勢

在葫蘆科蔬菜作物中，自發產生單倍體的頻率極低。為獲得單倍體植株，離體雄核發育途徑（花藥或小孢子培養）、雌核發育途徑（未授粉子房或胚珠離體培養、外源化學藥劑、正常花粉或輻射過的花粉授粉誘導的孤雌生殖）等手段被用來誘導單倍體。近年來，游離小孢子培養技術的不斷成熟為離體培養單倍體帶來了曙光。

游離小孢子培養研究于20世紀70年代初開始，于1982年在蕓薹屬作物上首次獲得成功[2]。在高等植物的生活史中，小孢子是雄配子體發育過程中短暫而重要的階段，是減數分裂后四分體釋放出的單倍性單細胞。小孢子培養是指將小孢子從花藥中游離出來，在人工培養基上進行培養并獲得再生植株的過程。與花藥培養相比，游離小孢子培養開展的并不晚，但進展較緩慢。早在1982年，Licher首次報道采用甘藍型油菜游離小孢子培養形成植株[3]。20世紀80年代后期，游離小孢子培養技術在十字花科的油菜上得以迅速發展并日臻完善。近十幾年，游離小孢子培養技術在甘藍型油菜上日漸成熟，已陸續在黑芥、結球甘藍、芥藍、嫩莖花椰菜、抱子甘藍、羽衣甘藍、皺葉甘藍、小白菜、大頭菜、葉芥等十幾種蔬菜上獲得成功，但對葫蘆科游離小孢子培養至今尚未見明確成功的報道[4]。

從概念來看，花藥離體培養是把小孢子發育到一定階段的花藥接種至培養基上，以改變花藥內小孢子粒的發育程序，使其分裂形成細胞團，進而分化成胚狀體，形成愈傷組織，由愈傷組織再分化成植株。小孢子離體培養是指把小孢子從花藥中分離出來，以單個小孢子粒作為外植體進行離體培養的技術。由于小孢子已是單倍體細胞，誘發它經愈傷組織或胚狀體發育而成的植株都是單倍體，且不受花藥的藥隔、藥壁、花絲等體細胞的干擾。從培養層次來看，花藥離體培養屬器官培養，小孢子離體培養屬細胞培養，但花藥離體培養和小孢子離體培養的目的均是誘導小孢子細胞發育成單倍體細胞，最后發育成單倍體植株。一般來說，花藥培養比游離小孢子培養的技術要求相對簡單。從培養過程來看，花藥離體培養相對容易，技術比較成熟，但最后須對培養成的植株進行染色體倍數檢測；小孢子離體培養盡管不受花藥壁、藥隔等二倍體細胞的干擾，但這種特殊單倍體細胞的培養技術難度較大，目前僅在少數植物上獲得成功。

產生單倍體的方法主要有花藥培養和小孢子培養，但近年來花藥培養已逐漸被小孢子培養所取代。與花藥培養相比，小孢子培養方法具有以下幾方面優勢：（1）排除了母體組織體細胞的干擾，培養獲得的植株均是由單倍體小孢子發育來的，避免了嵌合體的發生，染色體加倍后可獲得遺傳上純合穩定的后代。（2）有利于提高小孢子胚胎發生的機率。（3）小孢子均是單細胞，數量多、發育快、易獲得、誘導率高、易突變，在自然條件下容易加倍，操作簡便，得到的胚狀體還可應用于育種實踐和遺傳分析。（4）適合作為單一細胞群體系統的生理生化研究。（5）易于誘發突變和進行離體篩選。小孢子培養技術在育種及基礎研究應用上具有以下優勢：（1）小孢子培養獲得的DH（doubled haploid，雙單倍體）植株是同源體，因而是真實育種；[JP2]（2）從雜種中培養得到的小孢子單倍體在遺傳上代表隨機配子；（3）小孢子培養獲得純合植株一般需要7～8個月，而傳統育種方法需要3～4年，大大節省了時間和成本；（4）與組織培養技術相結合能獲得大量成本相對較低的目標材料；（5）小孢子能直接發育成胚胎，因而減少了遺傳變異；（6）單倍體小孢子能進行顯性和隱性性狀的突變誘導。 [JP]

總體來講，瓜類蔬菜作物通過離體雄核發育途徑生產單倍體難度較大，只有西瓜的花藥培養較為成功。薛光榮等利用瓊酥西瓜品種，通過培養單核靠邊期的花藥在國際上首次獲得了西瓜單倍體植株，并從其加倍后代中直接選育出優良的新品種[5]，1988年薛光榮等在周至紅這一品種上獲得了成功[6]。在南瓜的花藥培養上也有學者進行過嘗試。Shail等培養花藥但并未獲得單倍體植株[7]；Kurtar等對4個南瓜品種花粉母細胞處于單核期的花藥進行培養，并摸索了蔗糖濃度和2，4-D濃度對培養效果的影響，但最后得到的3個植株均為二倍體[8]；直到1998年，Metwally等成功得到了10個單倍體植株，并對培養基進行篩選，發現單核中期、單核晚期的南瓜小孢子接種在MS+15%蔗糖+5 mg/L 2，4-D上培養的效果最好，每塊愈傷組織植株再生頻率可達192%[9]。Dryanovska等曾嘗試甜瓜的花藥培養，結果以失敗告終[10]。早在1982年，Lazarte等分別取黃瓜四分體、小孢子、成熟期3個時期的花粉進行花藥培養，并得到再生植株，但直到目前并無進一步研究，所得植株是否起源于小孢子仍未知[11]。直到2003年，Ashok等成功獲得了黃瓜單倍體植株[12]。詹艷等以10個不同基因型的黃瓜為試材進行游離小孢子培養，通過對成胚條件的系統研究，從7447和Poinsett97中獲得了子葉形胚和再生植株，得到的子葉形胚易分化成苗，而其他類型的胚狀體未能獲得再生植株，但誘導頻率仍然很低，難以用于育種實踐[13]。唐懿等針對基因型、小孢子發育時期等影響苦瓜花藥培養的主要因素進行綜述，討論了苦瓜花藥培養中存在的問題，并為今后苦瓜花藥培養提供了研究方向[14]。Han等利用子葉節建立了葫蘆再生體系[15]，但關于葫蘆花藥離體培養和游離小孢子培養并無報道。

2葫蘆科作物小孢子培養的影響因素

影響單倍體離體誘導的因素很多，涉及供體植株的基因型、培養基、外植體預處理方式、外植體發育時期、培養條件等方面，且各因素之間存在相互作用。根據關于游離小孢子培養和再生植株的報道，得出小孢子培養的主要影響因素。

2.1誘導游離小孢子胚胎發生的影響因子

小孢子培養受到供體植株基因型、供體植株生理狀況、預處理、小孢子發育時期、培養基種類、培養基成分、培養條件等諸多因素的影響，因此小孢子出胚率受到很大限制，成為實際應用中的一大難題。

2.1.1供體植株的基因型供體植株的基因型是影響小孢子培養的關鍵因素，不同基因型的植株對培養具有不同反應，主要體現在基因型的反應范圍、產胚率的差異2個方面。基因型的反應范圍即有多少基因型有反應，以及有反應的基因型產胚率的差異。詹艷等對10份黃瓜供試材料進行研究，只有4份試材獲得了胚狀體，其中成胚率最高的是7447，為312個/皿；成胚率最低的是康德，為1.5個/皿；其余6份材料中有些游離小孢子出現膨大，有些已啟動分裂，但均未能繼續分裂形成胚狀體[13]。李娟對西瓜進行研究發現，野生種和栽培種的成胚率有顯著差別，前者高于后者[4]。緱艷霞、董艷榮分別在西瓜、甜瓜花藥培養試驗中發現，F1代植株的愈傷組織誘導率明顯大于親本，表現出雜種優勢，表明小孢子的基因型至少是決定培養能力的因素[16-17]。

2.1.2供體植株的生長環境供體植株的生理狀態對小孢子胚胎誘導率具有重要影響，試驗中一般選擇生長發育健壯、無病蟲害的花蕾為試材進行培養，以達到最佳效果。另外，光照、溫度、水肥等供體植株生長的環境條件也是影響小孢子培養的關鍵因素。供體植株生長環境的溫度影響最為顯著，很多研究表明，適當低溫可顯著提高供體植株小孢子的出胚率。曹鳴慶等以種植在部分控溫溫室和露地的17個基因型的大白菜為試材，研究供體母株的生長環境條件對小孢子胚胎發生的影響；結果表明，供體植株生長環境的溫度為10～25 ℃，小孢子的胚產量較高[18]。張鳳蘭等利用人工氣候室研究光照、溫度對小孢子胚胎發生的影響，結果表明，日照時數為 14 h 最有利于小孢子胚胎發生且產胚量最高，最適溫度為 20 ℃[19]。袁亦楠等在番茄游離小孢子培養中發現，5月下旬、10月薯葉番茄花蕾的類胚發生率分別為0.01%、0.25%，可能是土壤的低夜溫影響了供體內小孢子的發育方向，使其偏離配子體方向發育，從而脫分化形成胚狀體[20]。

2.1.3小孢子發育時期小孢子發育時期、花蕾大小、取樣時期均會影響小孢子培養效果。小孢子發育時期通常分單核期、雙核期、三核期，并非任何時期的小孢子都適于培養。單核期又分為單核早期、單核中期、單核靠邊期，最適于游離小孢子培養的時期通常為單核靠邊期。很多研究表明，小孢子發育時期與花蕾長度、花藥長度、花瓣長等花蕾形態指標密切相關，可作為小孢子群體是否適于培養的衡量指標。Thurling等在進行蕓薹屬花藥培養時指出，雖然花蕾大小是判斷小孢子發育階段的可靠指標，但也隨著供體基因型、生長條件、生長時間、花序等的變化而變化，此結論同樣適用于瓜類[4]。

在大多數作物花藥培養中，花粉的發育時期均選用單核靠邊期，但目前對其作用機理仍不清楚。在黃瓜花藥培養中，不同發育期的花藥幾乎均可形成愈傷組織。詹艷等對黃瓜進行研究發現，只有單核靠邊期的小孢子誘導成胚[13]。謝淼等則研究發現，單核中后期的花藥適于作為外植體，而甜瓜花藥培養的最佳時期是單核靠邊期至雙核期[21]。薛光榮等利用瓊酥西瓜品種，通過培養單核靠邊期的花藥在國際上首次獲得西瓜單倍體植株，并從其加倍后代中獲得了新品種，但并未進行推廣[22]。不能僅憑花蕾的大小來判斷花粉發育時期。崔群香等以蜜本南瓜、安生黑鉆南瓜開花初期的雄花蕾為試驗材料，利用熒光染色技術對南瓜花粉發育時期進行鑒定[23]。花蕾大小因植株生長狀況及采花時期而有所不同，同樣大小的花蕾其發育時期也不盡相同；因此，掌握葫蘆科作物花蕾的采集時期，須先對葫蘆科作物不同發育階段的花藥進行顯微觀察，了解葫蘆科作物花粉發育的特點。

2.1.4逆境脅迫預處理預處理可改變小孢子的發育途徑，使其從配子體發育途徑轉向孢子體發育途徑，從而誘導小孢子胚的形成。預處理包括離心、低溫、高溫、輻射、秋水仙素、饑餓等人為處理，目前廣泛應用的預處理方法一般為低溫預處理、高溫熱激處理、甘露醇預處理、秋水仙素預處理。溫度脅迫是影響小孢子胚狀體發生的最主要因素。一般來說，從植株上采下花蕾后，直接進行小孢子培養很難誘導胚狀體發生。溫度脅迫可改變小孢子發育途徑，從而阻止小孢子向成熟花粉粒方向發展，而是沿著胚胎的發展途徑最終形成胚。羊杏平等研究低溫、高溫、甘露醇、蔗糖、激素、三十烷醇6種處理對西瓜小孢子存活率的影響發現，4 ℃低溫預處理2 d、35 ℃高溫熱激4 d、13%蔗糖處理均可顯著提高西瓜小孢子的存活率（P<0.05）；甘露醇、三十烷醇對不同西瓜品種的小孢子存活率影響不同，在培養基中添加0.5 mg/L 6-BA+04 mg/L 2，4-D的西瓜小孢子存活率最高[24]。

低溫預處理和高溫熱激是游離小孢子培養中最常用的2種方法。Ashok等研究了Calyps、Cucumis sativus Lr等2個黃瓜品種在花藥離體培養時對溫度預處理的反應，結果表明，花蕾在 4 ℃ 預處理2 d、32.8 ℃熱激1 d時反應最好[12]。郭尚等通過花粉培養、顯微鏡觀察的方法研究不同溫度、營養條件、保藏條件對花粉生活力的影響，結果表明，西瓜花粉萌發的適宜溫度為18～38 ℃，上限、下限溫度分別為48、8 ℃，在較高生長溫度條件下形成的花粉生活力較強；低溫處理時間越長，對花粉發芽越不利；8 ℃低溫、干燥條件有利于花粉短期保存；營養充足的大型花蕾花粉萌發較好[25]。朱迎春等以4 ℃低溫預處理48、72 h時，西瓜花藥培養愈傷組織誘導率較高，均顯著高于對照，表明4 ℃低溫預處理可作為花蕾的一種保存方式[26]。詹艷等對10份黃瓜供試材料進行研究發現，低溫預處理有利于胚狀體的誘導，以4 ℃預處理2～4 d為宜，以處理2 d的胚狀體產量最高[13]。緱艷霞等以具有較多優良性狀的F1代西瓜品種春光、拿比特、喜都的花藥為試材，研究影響西瓜花藥愈傷組織誘導率的因素，表明4 ℃低溫預處理 72 h 可提高西瓜花藥愈傷組織的誘導率；30 ℃高溫預培養72 h后置于25 ℃下低溫培養也可提高西瓜花藥愈傷組織的誘導率[27]。Labbani等以0.3 μmol/L甘露醇預處理、[JP2]4 ℃ 冷處理小麥小孢子，經過3、5、6、7、8、10、12 d等不同時期的培養發現，結合0.3 g/mol甘露醇和7 d冷處理對胚胎數量有強烈影響[28]。楊安平等在甘藍小孢子培養基中添加秋水仙堿，結果發現可使部分培養無反應材料產胚，并提高培養有反應材料的產胚量，同時對胚胎的良好發育具有促進作用[29]。[JP]

2.1.5小孢子分離方法獲得游離小孢子是進行培養的前提和關鍵，一般通過自然散落法、機械擠壓法2種方法獲得游離小孢子。（1）自然散落法。將花蕾消毒、清洗后，于無菌條件下取出花藥并接種到培養基上，任其花粉自然散落。（2）機械擠壓法。把經滅菌、清洗處理后的花蕾放到無菌研缽中，加入少量分離培養基研磨，得到花蕾懸浮液，采用尼龍篩網過濾并濾去殘渣，濾液多次離心，調整小孢子密度。

2.1.6培養基及其成分大多數瓜類花藥培養均選用MS作為基本培養基，也可選用NLN、B5培養基。很多試驗采用B5作為洗滌培養基，之后以NLN-13（NLN基本培養基+13%蔗糖）或1/2 NLN培養基作為誘導培養基，也能取得良好效果。謝淼等選用MS和B5作為基本培養基對黃瓜花藥進行培養[21]。在關于絲瓜花藥培養的研究中選用的是N6；在蔬菜作物中常用的胚狀體誘導培養基一般為NLN或1/2 NLN培養基。在黃瓜游離小孢子培養中，NLN和B5作為基本培養基誘導獲得的胚狀體產量差異性雖然不明顯，但NLN更有利于球形胚進一步發育成子葉形胚。

碳源是植物組織培養不可缺少的物質，它不僅能為外植體提供能量，也能維持一定的滲透壓。常用的碳源有果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、山梨醇等，蔗糖能支持絕大多數植物離體培養物的旺盛生長，一直作為植物組織培養的標準碳源被廣泛應用。然而近年來許多研究表明，蔗糖并不一定是最佳碳源，不同植物對不同糖類的反應不完全相同，并且多數植物組織培養物以葡萄糖、果糖為碳源時也能良好生長。碳源一般在6%～12%變化范圍內即可滿足瓜類植物的營養需求。黃均元等以茄子、黃瓜、番茄、西瓜、甜瓜5種蔬菜作物為研究對象，以不同濃度的蔗糖、硼酸、赤霉素進行處理，觀察花粉的萌發情況，結果表明，硼酸、赤霉素、蔗糖均能促進花粉萌發[30]。

小孢子培養過程中會產生有毒物質，進而降低胚狀體的發生頻率，改變胚的形態，產生畸形胚，而活性炭可有效吸附有毒物質。姜鳳英等認為，添加活性炭的培養基有利于魚雷形小孢子胚成苗，100 mg/L活性炭的成苗率增大最明顯，但對子葉形胚成苗的作用不大[31]。申書興等發現，活性炭的適宜添加量為0.05～0.10 g/L[32]。Lichter指出，活性炭不僅能吸收培養基中的有毒物質，也能吸收一些必要元素和植物激素，因此活性炭濃度不宜過高，否則會起負作用[33]。配制活性炭時最好加少量（0.5%左右）瓊脂糖，因為無瓊脂糖的游離活性炭吸附到小孢子上反而會阻止胚狀體發生。

楊清等發現，花椰菜花藥培養中添加62.5 mg/L AgNO3能顯著促進胚發生[34]。Ochatt等發現，AgNO3對花藥培養具有促進作用，對某些基因型的促進效果較明顯[35]。Dias等對甘藍類蔬菜花藥培養進行研究發現，誘導培養基中添加 10 mg/L AgNO3后出胚率大大增加，而在未加AgNO3的培養基中這些基因型幾乎無胚狀體形成[36-39]。Biddington等指出，對于難出胚的基因型，在培養基中加入乙烯的抑制劑 AgNO3 也許能提高其出胚率[40]。方淑桂等認為，AgNO3可促進青花菜小孢子的胚胎發生[41]。于文佳等在小菘菜胚芽分化影響的研究中發現，在B5固體培養基中添加一定質量濃度的AgNO3，[JP]可顯著提高小孢子的胚芽誘導率和平均每胚出芽數[42]。[JP]

常用于植物組織培養的外源激素有2類，即生長素類（2，4-D、IAA、NAA、IBA）和細胞分裂素類（KT、6-BA、ZT、TDZ等）。Metwally等研究花藥培養基中蔗糖和2，4-D的用量發現，添加150 g/L蔗糖、5 mg/L 2，4-D的培養基誘導的南瓜單倍體植株最多[9]。Ashok等研究了Calyps、Cucumis sativus Lr 等2個黃瓜品種在花藥離體培養時對生長調節劑的反應，認為最佳的誘導胚產生愈傷組織是在B5培養基中添加2.0 μmol/L 2，4-D和1.0 μmol/L BAP，在添加0.09 μmol/g蔗糖、0.25 μmol/L NAA、0.25 μmol/L KN的B5培養基中獲得分化的胚胎，在添加5 μmol/L ABA的B5培養基中胚胎發育，在含有0.09 μmol/L蔗糖的B5培養基中萌發成苗[12]。朱至清等認為，外源激素對花粉細胞去分化啟動是非必需的，但可防止多細胞花粉的敗育，使較多細胞形成愈傷組織[43]。薛光榮等證實，適當提高2，4-D濃度可提高西瓜愈傷組織誘導率，適當提高BA或KT濃度可提高直接增殖率和分化率[6]。生長激素是黃瓜組織培養中的重要因素，其中2，4-D作用最明顯，NAA次之，細胞分裂素中KT的作用差異顯著。甜瓜在較低濃度生長激素調節下具有較高分化率和成苗率。關于葫蘆、冬瓜、南瓜、絲瓜等花藥培養的報道不多，但許多學者使用未添加任何外源激素的培養基同樣獲得了數量和質量均較好的胚狀體，因此外源激素在小孢子培養中不是必需的。

2.1.7培養基pH值大多數植物適合在pH值為5.8～6.0的培養基中生殖，pH值在該范圍內可促進細胞分裂與增殖。Barinova等研究發現，高pH值條件下游離小孢子體內的轉化酶活性減弱，同時14C標記的蔗糖大量進入小孢子體內，表明處于高pH值條件下的小孢子糖代謝能力減弱，從而造成饑餓脅迫，阻斷了配子體發育途徑，誘導孢子體發育[44]。可見，適當提高pH值可能有利于誘導小孢子胚胎發生。

2.1.8小孢子密度小孢子培養密度過大致使培養基養分供應不足，易引發培養基中毒性物質過多釋放，導致健康優秀的小孢子難以出胚；密度過低則小孢子的競爭優勢得不到體現，胚胎發生比較困難，一般采用的培養密度為10萬～50萬個/mL。詹艷等采用血球計數板計數，將小孢子密度調整至10萬個/mL左右，但每次均采用血球計數板調整小孢子密度使操作過于繁瑣，影響試驗進程[13]。不少學者根據 1 mL 培養基中花蕾的數量研究小孢子密度對出胚的影響。

2.2胚培養發育及植株再生

[JP2]一般小孢子培養2～3 d發生第1次分裂，培養2～3周后形成胚狀體。小孢子胚狀體的類型分為球形、心形、魚雷形、子葉形以及畸形胚。由胚發育成植株的過程，在游離小孢子培養技術的應用中具有重要作用。國內外眾多學者在此方面的研究結果表明，胚的直接成苗率與培養基、胚的質量、供體植株的基因型均有關。詹艷等將獲得的子葉形胚、部分球形胚和心形胚轉移至胚狀體萌發培養基MS-BA上，培養20 d后，球形胚、心形胚褐化死亡；發育成熟的子葉形胚正常萌發，形成根芽俱全的小植株；處于初期的子葉形胚則大部分未能正常分化，出現未變綠、褐化死亡或僅有根分化的現象[13]。可見，子葉形胚最易成苗，因此胚狀體能否正常發育為成熟的子葉形胚是成苗的關鍵。甘藍類蔬菜出現肉眼可見的胚狀體后，將其置于搖床上在60 r/min、25 ℃條件下暗培養，形成子葉形胚狀體時轉入B5固體培養基，于25 ℃光暗交替條件下繼續培養。[JP]

谷佳南等研究了黃瓜花藥培養愈傷組織誘導及植株再生，將帶有芽點的愈傷組織轉接到生根培養基中，分化出根狀物后，芽的伸長能力明顯下降，使植株再生極為困難[45]。這可能與基因型有關，也可能是黃瓜花藥愈傷組織中存在某種激素，在促進根分化的同時阻礙了芽的伸長生長，為植株再生帶來一定困難。激素配比尚須調整，黃瓜花藥再生植株分化有待進一步研究。

2.3小孢子再生植株的倍性鑒定

小孢子培養得到的再生植株以單倍體居多，然而培養過程中一般會發生不同程度的自然加倍，因此小孢子再生植株是由不同倍性植株組成的混合群體，為生產應用帶來較大不便，有必要對其進行倍性鑒定。常用的倍性鑒定方法有形態學鑒定法、氣孔保衛細胞葉綠體計數法、花粉母細胞染色體計數法、根尖染色體計數法、流式細胞儀DNA含量測定法，且這5種鑒定方法各有優劣。不同倍性植株的外部形態特征存在差異，單倍體植株的生活力、生長勢、各主要器官大小均劣于正常二倍體，而倍性水平高的植株形態優于正常二倍體。

植株形態鑒定法易受植株長勢、營養條件等因素的影響，且倍性水平高時不易區分，判斷結果不準確，難以有效鑒定。氣孔保衛細胞葉綠體計數法具有簡便、快捷、準確性高的優點，但須建立不同倍性葉綠體數量與倍性之間的關系，對染色方法、操作技巧等有一定要求。為快速鑒定煙草花粉植株染色體倍性，劉仁祥等采用氣孔保衛細胞葉綠體計數法[46]。為尋求簡便、快速的西瓜染色體倍性鑒定方法，施先鋒等以二倍體西瓜TS、0517及其同源四倍體為試材，通過觀察葉片氣孔保衛細胞葉綠體數來鑒定西瓜染色體倍性，結果表明，2種倍性間的葉綠體數差異顯著，二倍體葉綠體數在15個以下，四倍體葉綠體數≥15個，氣孔葉綠體數隨染色體倍性的增加而增加，用氣孔保衛細胞葉綠體數預測植株倍性的準確率可達90.2%[47]。可見，采用熒光顯微鏡觀察葉綠體數可在苗期快速、準確地確定植株的染色體倍性。

2.4染色體加倍

小孢子再生植株有很大部分不能自然加倍，須采用人工誘導方法進行加倍。人工誘導方法有很多，通常采用2種途徑，即培養過程中處理、移栽時誘變劑處理。單倍體人工加倍主要采用0.2～0.4 mg/g秋水仙堿處理單倍體植株，使其加倍。采用秋水仙堿溶液處理根、芽等分生組織或直接加至培養基中，均可起到一定加倍作用。周偉軍等對剛分離的油菜小孢子、移入固體培養基前的胚體進行秋水仙堿處理和再生植株浸根處理，研究3種不同時期秋水仙堿處理對小孢子胚胎發育、成苗、加倍率的影響，結果表明，采用秋水仙堿直接處理的新分離油菜小孢子培養體系獲得的自發加倍率顯著高于常規培養體系，且分離小孢子直接進行秋水仙堿加倍染色體更為安全、快速、有效[48]。

3葫蘆科作物小孢子培養存在的問題與展望

近年來，盡管花粉培養取得了很大進展，但對葫蘆科作物的研究相對較少，僅在黃瓜、西瓜上獲得了胚狀體或再生植株。小孢子培養在育種、生物技術等方面用處很大，但關于小孢子培養技術的機制目前仍不清楚。小孢子培養技術在十字花科、茄科、禾本科作物上已得到實際應用，在葫蘆科作物上目前仍處于實驗室試驗階段。存在的主要問題是小孢子無法啟動萌發或成胚率太低，不同物種或不同基因型間差異較大，形成的愈傷組織或胚狀體無法進一步發育成為單倍體植株。今后的研究將從碳源、生長調節劑的種類及濃度、活性炭的應用、預培養的溫度及時間等方面入手，以期建立葫蘆科作物小孢子培養的植株再生體系，使小孢子培養技術在育種及其他生物技術的應用中發揮積極作用，通過建立穩定、高效地獲得純合二倍體的葫蘆游離小孢子培養體系來解決上述問題。

參考文獻：

[1][ZK（#]Joanna G，Katarzyna N S. Review of research on haploid production in cucumber and other cucurbits[J]. Folia Hort，2013，25（1）：67-78.[HJ1.35mm]

[2]雷春，陳勁楓. 葫蘆科蔬菜作物單倍體材料創制的研究進展[J]. 中國蔬菜，2006（1）：33-36.

[3]Lighter R. Induction of haploid plants from isolated pollen of Brassica napus[J]. Z Pflanzenphysiol，1982，105：427-434.

[4]李娟. 西瓜花藥和小孢子培養研究[D]. 雅安：四川農業大學，2008.

[5]薛光榮，余文炎，費開偉，等. 西瓜花藥離體培養獲得花粉植株[J]. 植物生理學通訊，1983（4）：40-42.

[6]薛光榮，余文炎，楊振英，等. 西瓜花粉植株的誘導及其后代初步觀察[J]. 遺傳，1988，10（2）：5-8，49.

[7]Shail J W，Robinson R W. Anther and ovule culture of Cucurbita[J]. Cucurbit Genet Coop Rpt，1987，10：92.

[8]Kurtar E S，Uzun S，Esendal E. Haploid plant propagation by anther culture of squash （Cucurbita pepo L.）[J]. Ondokuzmayis Universitesi Ziraat Fakultesi Dergisi，1999，14（2）：33-45.

[9]Metwally E I，Moustafa S A，El-Sawy B I，et al. Haploid plantlets derived by anther culture of Cucurbita pepo[J]. Plant Cell：Tissue and Organ Culture，1998，52（3）：171-176.[ZK）]

[10][ZK（#]Dryanovska O A，Ilieva I N. In vitro anther and ovule cultures in muskmelon （Cucumis melo L.）[J]. C R Acad Bulgare Sci，1983，36：1107-1110.

[11]Lazarte J E，Sasser C C. Asexual embryogenesis and plantlet development in anther culture of Cucumis sativus L. [J]. HortScience，1982，17（1）：88.

[12]Ashok K H G，Murthy H N，Paek K Y. Embryogenesis and plant regeneration from anther cultures of Cucumis sativus L. [J]. Sci Hortic，2003，98：213-222.

[13]詹艷，陳勁楓，Malik A A. 黃瓜游離小孢子培養誘導成胚和植株再生[J]. 園藝學報，2009，36（2）：221-226.

[14]唐懿，李萬寧，劉繼，等. 苦瓜花藥培養研究進展[J]. 長江蔬菜，2010（24）：4-7.

[15]Han J S，Oh D G，Mok I G，et al. Efficient plant regeneration from cotyledon explants of bottle gourd （Lagenaria siceraria Standl.）[J]. Plant Cell Rep，2004，23：291-296.

[16]緱艷霞. 西瓜花藥離體培養技術研究[D]. 杭州：浙江大學，2006.

[17]董艷榮. 甜瓜花藥再生體系的基礎研究[D]. 南京：南京農業大學，2002.

[18]曹鳴慶，李巖，劉凡. 基因型和供體植株生長環境對大白菜游離小孢子胚胎發生的影響[J]. 華北農學報，1993（4）：1-6.

[19]張鳳蘭，釗一貫靖久，吉川宏昭. 環境條件對白菜小孢子培養的影響[J]. 華北農學報，1994，9（1）：95-100.

[20]袁亦楠，朱德蔚，連勇，等. 番茄游離小孢子培養形成胚狀體的初步研究[J]. 農業生物技術學報，1999（1）：85-88.

[21]謝淼，秦麗穎，潘俊松，等. 黃瓜花器形態發生、小孢子發育與花藥培養[J]. 西北植物學報，2005，25（6）：1096-1100.

[22]薛光榮，費開韋. 西瓜花藥培養獲得花粉植株簡報[J]. 中國果樹，1982（2）：51-52.

[23]崔群香，劉衛東，吳敏，等. 用熒光染色法觀察南瓜雄配子體發育過程[J]. 江蘇農業科學，2012，40（1）：135-137.

[24]羊杏平，陳學好，周峰. 不同預處理對西瓜小孢子存活率的影響[J]. 江蘇農業學報，2012，28（5）：1104-1108.

[25]郭尚，王秀英. 不同因素對西瓜花粉生活力的影響[J]. 華北農學報，2006，21（3）：91-94.

[26]朱迎春，孫德璽，鄧云，等. 前期處理對西瓜花藥培養愈傷組織誘導的影響[J]. 中國瓜菜，2012，25（5）：17-19.

[27]緱艷霞，張明方. 西瓜花藥離體培養影響因子研究[J]. 北方園藝，2010，10：117-120.[HJ1.45mm]

[28]Labbani Z，de Buyser J，Picard E. Effect of mannitol pretreatment to improve green plant regeneration on isolated microspore culture in Triticum turgidum ssp. durum cv. ‘Jennah Khetifa[J]. Plant Breeding，2007，126（6）：565-568.

[29]楊安平，張恩慧，鄭愛泉，等. 秋水仙堿對甘藍游離小孢子胚胎發生及發育的影響[J]. 西北農林科技大學學報：自然科學版，2010，8（8）：131-137.

[30]黃均元，曾安新，鄭素秋. 幾種蔬菜花粉萌發最適培養基探討[J]. 湖南農業大學學報，1997，12（6）：61-63.

[31]姜鳳英，馮輝，王超楠，等. 幾種影響羽衣甘藍小孢子胚狀體成苗的因素[J]. 植物生理學通訊，2006，42（1）：58-60.

[32]申書興，梁會芬，張成合，等. 提高大白菜小孢子胚胎發生及植株獲得率的幾個因素研究[J]. 河北農業大學學報，1999（4）：65-68.

[33]Lichter R. Efficient yield of embryoids by culture of isolated microspores of different Brassicaceae species[J]. Plant Breeding，1989，103：119-123.

[34]楊清，曹鳴慶. 通過花藥漂浮培養提高花椰菜小孢子胚胎發生率[J]. 華北農學報，1991，6（3）：65-69.

[35]Ochatt S，Pech C，Grewal R，et al. Abiotic stress enhances androgenesis from isolated microspores of some legume species （Fabaceae）[J]. Journal of Plant Physiology，2009，166（12）：1314-1328.

[36]Dias J C D. Effect of activated charcoal on Brassica oleracea microspore culture embryogenesis[J]. Euphytica，1999，108：65-69.

[37]Dias J S. Effect of incubation temperature regimes and culture medium on broccoli microspore culture embrogenesis[J]. Euphytica，2001，119：389-394.

[38]Dias J S，Correia M C. Effect of medium renovation and incubation temperature regimes on tronchuda cabbage microspore culture embryogenesis[J]. Sci Hort，2002，93：205-214.

[39]Dias J S，Martins M G. Effect of Silver nitrate on anther culture embryo production of different B.oleracea morphotypes[J]. Sci Hort，1999，82（3/4）：299-307.

[40]Biddington N L，Sutherland R A，Robinson H T. Silver nitrate increase embryo production in anther culture of Brussels sprouts[J]. Ann Bot，1988，62：181-185.

[41][JP3]方淑桂，陳文輝，曾小玲，等. 影響青花菜游離小孢子培養的若干因[JP2]素[J]. 福建農林大學學報：自然科學版，2005，34（1）：51-55.[JP]

[42]于文佳，侯喜林，趙曉嫚，等. 小菘菜游離小孢子培養和植株再生[J]. 南京農業大學學報，2013，36（2）：7-12.

[43]朱至清，孫敬三，王敬駒. 小麥（Triticum aestivum）雄核發育的細胞學研究[J]. 植物學報，1978，20（1）：6-12，89-90.

[44]Binarova P，Straatman K，Hause B，et al. Nuclear-DNA synthesis during the induction of embryogenesis in cultured microspores and pollen of Brassica napus L.[J]. Theoretical and Applied Genetics，1993，87（1/2）：9-16.

[45]谷佳南，司龍亭，高興，等. 黃瓜花藥培養愈傷組織誘導及再生的研究[J]. 江蘇農業科學，2009（3）：37-39，46.

[46]劉仁祥，黃鶯，陸永旭，等. 煙草花粉植株染色體倍性苗期快速鑒定[J]. 湖南農業大學學報：自然科學版，2008，34（5）：541-544.

[47]施先鋒，彭金光，汪李平. 用西瓜葉片氣孔保衛細胞葉綠體數鑒定西瓜染色體倍性[J]. 湖南農業大學學報：自然科學版，2009，35（6）：640-642，663.

[48]周偉軍，唐桂香，張國慶，等. 甘藍型油菜小孢子秋水仙堿處理提高雙單倍體頻率研究[J]. 中國農業科學，2002，35（4）：410-414.