沙漠小球藻轉植物表達載體的表達預測

汪文倫+++王丹+++牟云++許萬云+++胡夢薇++高劍峰

摘要：以建立小球藻（沙漠小球藻）表達系統為目的，為利用小球藻重組表達外源蛋白，以及GFP熒光特性研究沙漠中的小球藻生理及理化性質提供基礎方法；同時也探索植物表達載體pCAMBIA2300-35S-OCS能否在沙漠小球藻中表達。通過菌落PCR驗證E.coli DH5α是否含有目的基因（GFP基因）的重組植物表達載體pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS，然后從E.coli DH5α中提取也構建完成的重組植物表達載體pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS；利用電轉化的方法將重組植物表達載體pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS轉入到小球藻細胞中；將電轉的小球藻在含有 100 mg/L 卡那霉素的BBM固體培養基中篩選出單克隆，將單克隆在含有15 mg/L卡那霉素的BBM液體培養基中擴大培養，然后利用PCR和RT-PCR預測綠色熒光蛋白基因（GFP基因）的存在與否和表達情況，再利用SDS-PAGE和熒光倒置顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達情況。通過SDS-PAGE和熒光倒置顯微鏡觀察結果表明綠色熒光蛋白（GFP）在小球藻中表達成功。試驗結果表明重組植物表達pCAMBIA2300-35S-OCS能夠在小球藻中表達外源蛋白，以及利用GFP的熒光特性研究小球藻的生理生化差異；也為小球藻在沙漠環境上的應用提供基礎。

關鍵詞：沙漠小球藻；電轉化；植物表達載體；綠色熒光蛋白

中圖分類號： S917.1文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）06-0041-04

微藻是地球上出現最早的生命之一，是一種能利用光合作用生活和生長的微生物，廣泛分布于海洋、陸地、湖泊以及干旱的沙漠之中。它們的形態各異，呈絲狀、球形和橢圓形等等，只要是有光和潮濕的地方都能找到這些生命的痕跡[1]。新疆古爾班通古特沙漠是我國第二大沙漠，年降水量70～150 mm，冬季有積雪，其最低溫度可達-25 ℃，而最高溫度可達35 ℃[2]。即使在這樣的條件下，也分布著百余種藻類，小球藻就是其中之一[3]。小球藻和其他生長在沙漠里的藻類一樣，適應了沙漠的極端環境，表現出較強的生命力。

小球藻是綠藻門的一種，細胞呈球形或橢圓形，細胞的大小在3～8 μm之間，也是單細胞藻類植物和真核生物的一種。由于遺傳的相對保守性﹑生長快﹑分布廣﹑營養要求簡單和成本低廉等特點，是在單細胞水平上研究基因表達及其生理生化的理想材料。而基因工程也是研究熱點之一，目前的轉基因技術有鳥槍法[4]﹑根癌農桿菌介導法[5]和電轉化法[6]。由于電轉化法有效率較高、簡單、方便、成本低等特點，在微藻遺傳轉化過程中也被廣泛使用。

啟動子是外源基因是否表達的關鍵，這決定著基因表達與否及其表達量，所以在小球藻基因工程的研究中也起著至關重要的作用。目前，CaMV35S 是基因工程中常用的啟動子之一。CaMV35S 是一種花椰菜花葉病毒啟動子，能夠在植物表達系統中啟動基因的表達[7]，也有研究表明CaMV35S可以在小球藻表達外源基因[5，8]。

綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP） 是由238個氨基酸組成的多肽鏈，分子量約為27 ku，基因編碼序列約 750 bp。純化的GFP蛋白與體內表達的GFP蛋白的發光光譜相似，在藍光或紫外光激發下，無論其表達在原核或真核細胞中，都能利用熒光顯微鏡在不需要其他輔助條件下看見綠色熒光。綠色熒光蛋白還具有低毒性和不干擾細胞正常生活等優點，使得GFP在生物研究領域中得到廣泛應用。目前GFP已在轉基因領域、基因表達的蛋白質定位、細胞定位以及藥物的篩選等諸多方面得到廣泛應用[9]。

本試驗將利用GFP的特點和已經構建好的重組植物表達載體pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS，通過電擊轉化法導入到細胞中，讓其表達綠色熒光。這將為在小球藻中表達外源蛋白和利用GFP研究其生理及理化性質提供試驗的基本操作和基礎；同時也為表達載體pCAMBIA2300-35S-OCS在小球藻中的表達做1個預測。

1材料與方法

1.1材料

小球藻GTD8A1由筆者所在實驗室分離、純化和鑒定得到；植物表達載體PCAMBIA2300-35S-GFP-OCS （帶有CaMV35S調控下的GFP基因）由石河子大學生命科學學院黃先忠老師饋贈；大腸桿菌DH5α菌株為筆者所在實驗室保存；卡那霉素（kanamycin，Kan）購自北京索萊寶科技有限公司。

小球藻GT8A1所用的BBM培養基[10]：NaNO3 250 mg/L，KH2PO4 175 mg/L，K2HPO4 75 mg/L，MgSO4·7H2O 75 mg/L，CaCl2·2H2O 25 mg/L，NaCl 25 mg/L，EDTA 50 mg/L，KOH 31 mg/L，FeSO4·7H2O 4.98 mg/L，H3PO4 11.42 mg/L，ZnSO4·[JP3]7H2O 8.82 mg/L，MnCl2 1.44 mg/L，MoO3 0.71 mg/L[JP]，CaSO4·5H2O 1.57 mg/L，Co（NO3）2·6H2O 0.49 mg/L，98% H2SO4 2 μL/L（可以在以上組中加入15～20 g瓊脂，加入蒸餾水補至1 L制成固體培養基，121 ℃滅菌20 min，4 ℃保存）。

E.coli DH5α所用的LB培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L（加去離子水溶解至終體積1 L，用2 mol/L NaOH調pH值范圍為7.0～7.4，同時加入15～20 g 瓊脂粉，制成固體培養基；在121 ℃高壓下滅菌20 min，4 ℃ 保存）。

1.2方法

1.2.1藻種培養及其條件取對數生長末期的小球藻培養液，按10%的接種量接入裝有100 mL BBM培養基的250 mL錐形瓶中，置于光照培養箱中靜止培養，培養條件為：光照強度為100 μmol/（m2·s），光暗周期12 h/12 h，培養溫度（23±0.5） ℃。

轉化子克隆的篩選：將轉化好的小球藻GT8A1涂布于含有100 mg/L卡那霉素[1]的BBM固體平板上，4～5周會有單克隆長出。然后進行菌落PCR檢測，得到陽性克隆。

陽性克隆的擴大培養：將陽性克隆接入到含有15 mg/L卡那霉素的BBM液體培養基中，進行逐級擴大培養。

1.2.2提取pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS和GFP引物設計GFP基因引物設計：從NCBI上得到GFP蛋白的序列，通過Primer 5 軟件從頭開始設計GFP基因引物，使其能完全地表達GFP蛋白。引物序列如下：GFP-F：5′-ATGATGGTGAGCAAG-3′；GFP-R：5′-TGTACAGCTCGTCCATG-3′。

pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS載體也由黃先忠老師實驗室構建完成，并且成功地在擬南芥中表達[11]。也將其保存到E.coli DH5α中，在做電擊轉化之前需要將E.coli DH5α進行菌落PCR檢測后，才能進行擴大培養。然后采用質粒提取試劑盒（TIANGEN Plasmid Kit）進行提取，其過程見圖1。

[FK（W19][TPWWL1.tif][FK）]

PCR反應體系：ddH2O 8 μL，單克隆變性液2 μL，引物（GFP-F/GFP-R）2 μL，2×Taq PCR MasterMix（TaKaRa，China） 8 μL共20 μL擴增體系，可以擴增出約750 bp的片段。

PCR反應條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環30次；72 ℃ 10 min。PCR產物通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3電擊轉化法取培養4 d后的小球藻細胞3～5 mL（細胞數量控制在1×108個/mL），75 000 g離心 5 min 收集小球藻細胞后再用無菌的BBM培養基清洗3次培養基，然后分別在5 000、4 000、3 000 g下離心以收集比較干凈的小球藻細胞；將收集好的小球藻細胞置于高滲溶液中（甘露醇、山梨醇各100 μL）在冰上處理約1 h，后3 000 g離心收集比較干凈的小球藻細胞，去掉上清，在沉淀中加入pH值為7.2的HEPS電擊緩沖液[取23.8 g HEPES溶于 90 mL 雙蒸水中，采用2 mol/L的NaOH溶液調pH值至7.5～8.0，然后用蒸餾水定容至100 mL，過濾除菌，分裝小瓶（2 mL/瓶），4 ℃保存]，將藻細胞稀釋成1×108個/mL放置冰上備用；用紫外光處理干凈的電擊杯約30 min，將其放置在冰上備用；按藻細胞 ∶[KG-*3]質粒=3 ∶[KG-*3]1的比例混勻樣本加入到電擊杯中，在冰上放置10 min后，在電擊儀上電擊，電擊條件為脈沖電壓1 500 V，持續時間0.2 s，脈沖距離2 mm；電擊后的藻細胞置于含有 3 mL 復活培養基的6孔板中，在黑暗的條件下復活24～48 h；7 000 g離心1 min收集轉化小球藻細胞，再用無菌的BBM培養基清洗3次，然后分別5 000、4 000、3 000 g下離心收集比較干凈的小球藻細胞涂布于含有100 mg/L卡那霉素的BBM固體平板上，篩選單克隆。培養4～6周后會有單克隆長出，然后將平板上所長的單克隆用無菌的牙簽挑起后置于10 μL的ddH2O中，95 ℃預變性后作為PCR反應的模板，用PCR檢測陽性克隆。

PCR反應體系：ddH2O 8 μL，單克隆變性液2 μL，引物（GFP-F/GFP-R）2 μL，2×Taq PCR MasterMix（TaKaRa，China） 8 μL共20 μL擴增體系，可以擴增出約750 bp的片段。

PCR反應條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環30次；72 ℃ 10 min。 PCR產物通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4基因組DNA和總RNA的提取及目的基因檢測基因組DNA的提?。翰捎肈NA提取試劑盒（TIANGEN Plant Genomic DNA Kit）提取，按照說明書進行提取。

總RNA的提取：采用TRIzol試劑（Invitrogen USA）進行提取，按照說明書進行提取。

總RNA采用TaKaNa的反轉錄試劑盒反轉成cDNA后，和總DNA一樣采用PCR檢測目的基因。

PCR反應體系：ddH2O 8 μL，單克隆變性液 2 μL，引物（GFP-F/GFP-R）2 μL，2×Taq PCR MasterMix（TaKaRa，China）8 μL共20 μL擴增體系，可以擴增出約750 bp的片段。

PCR反應條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環30次；72 ℃ 10 min。PCR產物通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5綠色熒光蛋白的SDS-PAGE和熒光檢測經過基因組DNA和總RNA的檢測后。將陽性克隆擴大培養，取 10～15 mL的培養藻液75 000 g離心2 min收集轉化子的小球藻細胞后，用無菌的ddH2O清洗3次，然后利用梯度離心法：分別再5 000、4 000、3 000 g離心5 min后收集到轉化子小球藻細胞，采用蛋白試劑盒提取（Plant Protein Extraction Kit）提取GFP蛋白，提取過程按說明書進行。將提取到的蛋白進行SDS-PAGE檢測；然后采用熒光倒置顯微鏡（北京斯內克創新科技有限公司）進行熒光檢測。操作過程按說明書進行，檢測GFP蛋白的表達情況。

2結果與分析

2.1提取pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS和菌落PCR檢測

通過菌落PCR檢測含有pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS載體的E.coli DH5α菌株，將含有陽性克隆的重組植物表達載體pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS的E.coli DH5α進行擴大培養，提取質粒并用于后續試驗，過程和結果見圖1、2。

2.2單克隆PCR檢測

通過涂布篩選得到的單克隆藻細胞，菌落PCR檢測結果（圖3）表明，重組質粒載體pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS可能轉化進入到小球藻細胞中。

2.3基因組DNA和總RNA的提取以及PCR鑒定

經過DNA提取試劑盒（TIANGEN Plant Genomic DNA Kit）提取的總基因組DNA，通過PCR檢測750 bp的GFP基因片段?？偦蚪MDNA檢測結果見圖4。結果表明GFP基因整合在小球藻基因組中。

經過TRIzol試劑（Invitrogen USA）提取總RNA，結果見圖5-A。然后通過RT-PCR反轉錄出cDNA作為模板，通過PCR檢測750 bp的GFP基因片段，結果見圖5-B，通過結果預測GFP基因整合在小球藻基因組中，同時GFP基因也在小球藻細胞中轉錄成功。

2.4綠色熒光蛋白的SDS-PAGE和熒光檢測

通過植物蛋白提取試劑盒對GFP蛋白提取后，用SDS-PAGE進行檢測，結果見圖6。然后將通過梯度離心獲得的轉化小球藻細胞，在綠色熒光倒置顯微鏡下觀察其表達結果（圖7）。結果表明GFP蛋白成功表達于小球藻中。說明植物表達載體pCAMBIA2300-35S可以在小球藻中表達外源蛋白，同時也可以做小球藻生理生化的研究載體。

3討論

我們都知道綠色熒光蛋白在植物和動物細胞表達成功的例子不勝枚舉，但是在微藻中的研究少之又少。近年，隨著微藻優勢及其有關基因組基因測序[12]開發而來，國內外對此的研究也越來越熱。從國外的研究進展來看，有研究表明GFP蛋白在萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）細胞中成功表達[13-14]?？梢钥吹絿舛嗍且匀R茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）作為模式生物來研究外源基因的表達系統；因此，在國內Jiang等研究者以小球藻為模式生物來研究其外源基因的表達系統，并且和萊茵衣藻進行了表達的相關比較得知，小球藻表達外源基因系統優于萊茵衣藻[15]。與此同時，Song等利用相關的技術和pAnFP為表達載體，在魚腥藻（Anabeana）中成功表達了綠色熒光蛋白，并通過熒光倒置顯微鏡觀察到了綠色熒光[16]。

同樣，Guo等利用相似的轉基因技術和pCAMBIA1302為載體，在斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）細胞中成功表達了綠色熒光蛋白[17]。由于GFP易于標記和辨認，這使得使用GFP來研究表達系統及其生理生化也越來越重要。然而通過上面的討論，知道不同宿主需要不同的表達載體。提示在進行基因工程的遺傳轉化研究時，特別是表達一些藥用外源蛋白時，進行表達載體的表達篩選也顯得尤為重要，這將確定最佳的表達載體以及減少不必要的浪費。

目前，有關綠色熒光蛋白（GFP）在小球藻中表達還未見報道。在本研究中，利用電轉化的方法將重組植物表達載體pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS導入到小球藻中，通過基因組DNA和總RNA的理論分析和預測，得知綠色熒光蛋白基因可能整合在小球藻基因組中，并且進行了反轉錄。然后再通過熒光倒置顯微鏡證實了GFP成功地表達于小球藻中，從而驗證植物表達載體pCAMBIA2300-35S能夠用于小球藻中表達外源蛋白基因，這對于小球藻這種低等植物來說，將來可以利用此載體來研究小球藻的生理生化性質和表達外源蛋白，這也為小球藻利用基因工程商業化和工業化提供基礎材料，同時也為沙漠環境上的開發和利用提供基礎技術。

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