人參CYP716A53v2基因的克隆與序列分析

張濤++韓梅++劉翠晶

摘要：研究人參皂苷生物合成途徑中的影響因子。以五年生人參根組織為試驗材料，提取總RNA，反轉錄合成cDNA的第1條鏈，利用PCR法對人參中的原人參三醇合成酶（CYP716A53v2）基因的cDNA進行克隆及序列分析。獲得CYP716A53v2基因全長片段為1 506 bp，開放閱讀框長1 410 bp，編碼470個氨基酸多肽。生物信息學分析顯示，CYP716A53v2基因編碼蛋白質不含跨膜區域。 說明CYP716A53v2基因與其他植物氨基酸序列具有較高同源性，其中與人參、西洋參、三七同源性分別為99%、98%、98%。

關鍵詞：人參皂苷；基因克隆；序列分析

中圖分類號： S567.5+10.1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0053-04

收稿日期：2015-05-05

基金項目：國家自然科學基金（編號：31270371）；國家科技支撐計劃（編號：2011BAI03B01-02）。

作者簡介：張濤（1991—），男，碩士研究生，主要從事藥用植物分子生態學。E-mail：251073371@qq.com。

通信作者：韓梅，教授，主要從事藥用植物資源與藥材質量評價。E-mail：hanmei77@sohu.com。人參（Panax ginseng C.A.Meyer）為五加科人參屬名貴藥材，自古以來是中國重要藥用植物，有“百草之王”的美譽。現代藥理學研究表明，人參皂苷為人參主要藥效成分，按苷元基本骨架可分為齊墩果烷型和達瑪烷型，屬于三萜類化合物。目前，已從人參中分離得到約 90 種人參皂苷單體[1-3]。抗癌活性成分人參皂苷Rg3已經于2000年批準為一類新藥[4]；隨著老齡化人口增加和疾病的改變，如心血管疾病和腫瘤人口的增加，人參皂苷Rg和Re被命名為血管生長因子。人參皂苷含量和組成是人參質量的重要指標，人參皂苷的含量較低，人工合成次生代謝產物人參皂苷尚未實現，對于一些含量甚微的單體皂苷的新藥開發還較為困難。人參皂苷的生物合成途徑與功能基因的表達量之間的關系仍處于探究階段。深入了解人參皂苷生物合成途徑及其調控機理，在分子水平上實現人參皂苷的人工合成，這將是利用生物技術手段大量生產人參皂苷的必然前提。

原人參三醇合成酶（CYP716A53v2）是達瑪烷型人參皂苷合成的重要調控酶，原人參三醇合成酶催化原人參二醇到原人參三醇的過程，相關試驗研究認為，細胞色素P450 CYP716A53v2基因mRNA表達量與三萜皂苷的生成量呈正相關[5]。本試驗對人參皂苷生物合成途徑中的細胞色素P450 CYP716A53基因進行了克隆與序列分析，目的在于從基因水平研究人參皂苷生物合成途徑的調控機制，實現三萜皂苷基因的高效表達，增加人參藥材的藥效成分含量，提高人參藥材質量和經濟價值，為實現未來藥材質量安全、可控、穩定、有效的發展目標提供理論依據。1材料與方法

1.1材料

五年生鮮人參取自吉林省撫松縣撫南林場，位于 42°03′06″N、127°33′21″E，海拔903 m，用刀將根部切成小塊放入凍存管迅速用液氮冷凍于-80 ℃保存待用，試驗所用部位為人參根組織。

1.2主要試劑和儀器

植物總RNA提取試劑盒，2×Power Taq PCR Mastermix，凝膠回收試劑盒，質粒提取試劑盒，DNA 連接試劑盒等均購自北京百泰克生物科技有限公司；PrimeScript Reverse Transcriptase 反轉錄試劑盒，LB 培養基，JM109 感受態菌株均購自大連寶生物工程有限公司。Eppendorf Mastercycler nexus PCR儀，德國；DYY-8C瓊脂糖凝膠電泳儀，北京六一；GIS-2010凝膠成像系統，上海Tanon；HC-2518R高速冷凍離心機，MDF-382E超低溫冰箱，日本SANYO等。

1.3方法

1.3.1人參根部組織總RNA的提取及反轉錄成cDNA的第1條鏈按照植物總RNA提取試劑盒的提取步驟對人參根組織總RNA進行提取，RNA質量的檢測用1%瓊脂糖凝膠電泳。以提取的總RNA為模板，以 Oligo-dT 為引物，將RNA反轉錄合成cDNA，-20 ℃保存。

1.3.2PCR擴增根據GenBank上已報道的人參細胞色素P450 CYP716A53v2基因cDNA（登錄號為JX036031）序列設計引物，上游引物為53F：5′-GGGCAAAATCACAGAATTCTTG，下游引物為53R：5′-TTAAAGCGTACAAGGTGATAGACG。以五年生人參根cDNA為模板，進行PCR擴增，PCR反應體系：去離子水7.4 μL，2倍 Power Taq PCR Mastermix 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，反轉錄產物1 μL。反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 2 min，35個循環；最后72 ℃延伸10 min。取5 μL擴增產物在1% 瓊脂糖凝膠電泳上檢測。

1.3.3細胞色素P450 CYP716A53基因的克隆與序列分析PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，放入紫外分析儀內切下目的片段，用凝膠回收試劑盒純化回收，再將純化回收目的片段與pMD20-T載體連接成重組質粒pMD20-T/CYP716A53v2，再轉化到感受態細胞中進行克隆，涂布在X-gal、IPTG和 Amp 的LB平板上，在氣候箱中37 ℃培養14～16 h，隨機挑取10個白色菌落，搖菌培養12～14 h，通過質粒提取試劑盒提取質粒和菌落PCR進行快速鑒定，將陽性克隆菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司測序鑒定。將測序獲得的序列用DNAMAN 6.0整理翻譯成氨基酸，通過ExPasy ProtParam （http：//www.expasy.org/tools/protparam/.html） 分析推測蛋白質的理化性質；采用TMHMM 2.0 進行跨膜結構域預測；利用Blast搜索NCBI上的核苷酸數據庫和氨基酸數據庫中近緣物種的CYP序列信息，通過MEGA 5.0構建Neighbor-Joining 系統進化樹，Bootstrap重復次數為1 000。

2結果與分析

2.1人參總RNA質量檢測

本試驗采用試劑盒法將提取的人參總RNA經1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖1，所提取的總RNA呈現出28S rRNA和18S rRNA等2條條帶，條帶清晰完整，沒有明顯降解，說明總RNA 提取成功。

2.2人參細胞色素P450 CYP716A53v2基因PCR結果

以人參根組織cDNA為模板，用細胞色素P450 CYP716A53v2基因的特異性引物進行PCR擴增，擴增產物經1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得片段大小為1 506 bp（圖2）。

2.3細胞色素P450 CYP716A53v2基因的克隆與序列分析

使用載體通用引物對陽性克隆菌液進行菌落PCR檢測，獲得大小約1 506 bp 片段（圖3）。提取的質粒電泳結果顯示（圖4），質粒分子量較大，說明 pMD20-T載體有外源基因片段插入，為陽性克隆。

對陽性克隆菌液進行測序，并利用 DNAMAN軟件進行序列拼接，得到1 506 bp 堿基序列，翻譯起始位點位于16 bp，PolyA 位于1 423 bp，開放閱讀框長1 410 bp，共編碼470個氨基酸，與GenBank上發布的人參細胞色素P450 CYP716A53v2基因的氨基酸（登錄號為AFO63031 ）序列完全相符，表明所得重組子是正確的（圖5）。

利用ExPasy ProtParam（http：∥www.expasy.org/tools/protparam/.html）在線工具分析人參P450 CYP716A53v2基因編碼蛋白的理化性質。推測其蛋白相對分子質量為53.297，分子式為C2 458H3 793N619O665S20，總原子數為7 555。理論等電點為9.12，帶正電殘基（精氨酸+賴氨酸）為56，帶負電殘基（天冬氨酸+谷氨酸）為46。該蛋白的不穩定系數為38.57，表明人參P450 CYP716A53v2基因編碼的蛋白不穩定。脂肪系數為85.82，親水性系數為-0.081，表明其為親水蛋白。利用 TMHMM2.0 進行蛋白跨膜分析，人參P450 CYP716A53v2基因編碼的蛋白質沒有跨膜區域 （圖6）。

人參CYP基因與其他植物CYP基因具有較高的親源性，分別達到人參（AFO36031）99%、西洋參（AGC31652）98%、三七（AHK23636）98%、西洋參（AED99872）97%、刺五加（AHA50080）84%。人參CYP基因與其他植物相關基因系統發育樹見圖7。人參CYP基因與五加科植物三七（AHK23636）、人參（AF036031）、西洋參（AGC31652） 、刺五加（AHA50080）以及西洋參（AED99872）親緣性較高，與植物種屬之間的進化相符。

3結論與討論

人參皂苷的成分及總皂苷的含量是評價人參藥材質量的重要指標，三萜皂苷作為人參藥材的次生代謝產物，其中，Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1等是主要成分，具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、保肝護肝等功效[6-8]，尤其是Rg1對心血管系統、免疫系統、神經系統起到一定的調節作用，還具有抑制細胞凋亡、擴張血管、抗衰老，運動疲勞的恢復等作用[9]。目前，有關人參皂苷積累和形成規律的研究尚不充分，制約了人參藥材質量調控機制的研究，已成為進一步提升人參藥材質量的制約因素[10]。

人參細胞色素P450 CYP716A53v2催化原人參二醇到原人參三醇，四環三萜皂苷從達瑪烷二醇羥基化之后是由CYP（P450）和糖基轉移酶的糖基化進行合成的，原人參二醇合成酶（CYP716A47）催化達瑪烷二醇C-12位置羥基化，得到原人參二醇，原人參三醇合成酶（CYP716A53v2）催化原人參二醇得到原人參三醇[4]，再經由糖基化得到單體皂苷Rg1。本

試驗所克隆的人參細胞色素P450 CYP716A53v2基因與三七、西洋參、刺五加等植物細胞色素CYP（P450）基因序列同源性都很高，它們均屬于植物三萜類化合物積累和形成的重要調控限速酶——細胞色素氧化酶家族，同時該試驗也驗證了種屬親緣關系越近，代謝產物越趨同的觀點。筆者認為，可以從人參屬其他植物的次級代謝產物中尋找人參皂苷的替代產物。Han等對CYP716A的2個亞族基因（CYP716A52v2和CYP716A53v2）進行了判定，經過過茉莉酸甲酯的處理，重組WAT21酵母的異位表達轉接到培養基中培養，體外酶活性測定以及液體色譜和大氣壓化學電離質譜的確定[4-5]，結果表明，CYP716A53v2基因的產物是原人參二醇6羥化酶，它是達瑪烷型三萜苷元在人參皂苷生物合成中的重要步驟，而CYP716A52v2基因的產物是β-香樹素C28位羥基化酶，其催化β-香樹素生成齊墩果酸，再經由糖基化生成單體皂苷Ro。因此，人參細胞色素P450 CYP716A53v2基因在一定程度上可以決定人參皂苷生物合成的方向，可以在分子水平上用于調節人參皂苷的生物合成，對于進一步提高人參藥材質量具有重要指導意義。

通常情況下次生代謝產物是藥用植物的主要藥效成分，是藥材質量的重要標志[11]，即含量及藥效成分是藥用植物的表現型，表現型是由基因型和環境條件共同作用的[12]。所以，清晰地認識以次生代謝產物為主體的藥效成分的形成積累規律及其生態學和分子生物學機制，是實現藥材質量控制的重要前提，也是目前藥材質量控制技術研究的瓶頸[13-14]。從生態學與分子生物學角度，開展人參皂苷形成與積累規律的研究，闡明其影響主導生態因子和調控機制，對進一步實現人參藥材質量調控具有重要指導意義，進而實現人參藥材質量“安全、穩定、可控、有效”的目標。

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