基于rbcL條形碼的雞血藤真偽鑒別

黃瓊林+馬新業+詹若挺++陳蔚文

摘要：為了建立雞血藤基于rbcL基因的DNA條形碼鑒別體系，為其資源保護和用藥安全提供分子依據，采用商業試劑盒提取雞血藤樣品的基因組DNA，以及rbcL通用引物進行PCR擴增和測序；并從GenBank數據庫獲取雞血藤混偽品的rbcL基因序列。采用DNAMAN、ClustalX軟件進行序列比對分析，MEGA 5.1軟件構建系統發生樹。結果表明：獲取的雞血藤及其混偽品rbcL序列均為498 bp，GC含量分布在40.0%～44.4%間，存在64處變異，種間遺傳距離遠遠大于種內遺傳距離。基于rbcL基因的系統發生樹能很好地區分雞血藤及其混偽品。因此，rbcL基因可用作雞血藤及其混偽品鑒別的DNA序列。

關鍵詞：雞血藤；rbcL條形碼；鑒別；混偽品

中圖分類號： R284.1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0057-03

收稿日期：2015-05-14

基金項目：廣東省高等院校學科與專業建設專項資金（編號：2013CXZDA011）；國家工信部中藥材生產建設項目（編號：[2014]737號）；廣東省自然科學基金博士啟動項目（編號：2015A030310519）。

作者簡介：黃瓊林（1986—），男，廣東湛江人，博士，講師，主要從事分子生物學研究。E-mail：perfecthql@163.com。

通信作者：陳蔚文，博士，教授，主要從事創新中藥開發與研究。E-mail：chenww@gzucm.edu.cn。雞血藤為中國常用大宗藥材，主產于廣東、廣西，味苦甘、性溫，具有補血活血、祛風通絡之功效，用于治療月經不調、血虛萎黃、麻木癱瘓、風濕痹痛等病癥[1]。《中華人民共和國藥典》收載的雞血藤藥材為豆科植物密花豆（Spatholobus suberectus Dunn.）的干燥藤莖，但在市場流通過程中，大血藤（Sargentodoxa cuneata）、香花崖豆藤（Callerya cinerea）、魚藤（Derris trifoliata）、榼藤（Entada phaseoloides）等多種植物的藤莖被混淆為雞血藤藥材。這些混偽品的成分和功效與雞血藤均存在差異，嚴重影響了雞血藤的臨床用藥安全及其資源的可持續性利用。因此，有必要建立雞血藤及其常見混偽品的有效鑒別體系。

DNA條形碼是指利用一段短的標準DNA序列來實現物種的快速、準確鑒別[2]。2012年，國家藥典委頒布了《中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則》，新版藥典或將新增DNA條形碼鑒定，表明DNA條形碼具有良好的推廣和應用價值。應用于中藥材鑒別的推薦DNA條形碼片段主要位于葉綠體DNA、核糖體DNA轉錄間隔區。rbcL基因編碼1，5-二磷酸核酮糖羧化酶大亞基，位于葉綠體DNA的大單拷貝區，是植物分子系統學研究中應用最普遍的基因之一[3-5]。rbcL基因目前已被用于青天葵[6]、十大功勞[7]、溪黃草[8]等中藥的真偽鑒別，但尚未見其應用于雞血藤及其混偽品的快速鑒別。因此，本研究分析雞血藤與4種常見混偽品的rbcL基因序列差異，為雞血藤的真偽鑒別和臨床用藥提供分子依據。

1材料與方法

1.1材料與試劑

雞血藤及其混偽品的rbcL基因序列來源于植物樣品或GenBank數據庫（表1）。雞血藤樣品包括植物葉片和干藥材，植物葉片采自廣州中醫藥大學城校區藥王山，藥材購自廣東省湛江市連鎖藥店，均經廣州中醫藥大學鑒定為豆科植物密花豆。以雞血藤混偽品的拉丁學名為主題詞，從NCBI（National Center for Biotechnology Information）的GenBank 數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）下載相應物種的rbcL基因序列。

植物基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生物科技公司；Ex Taq、10×Ex Taq buffer、dNTPs、DL2000 marker等PCR試劑購自寶生物工程（大連）有限公司；其他試劑均為分析純。引物合成和測序由北京六合華大基因科技股份有限公司廣州分公司完成。

1.2DNA提取

稱取100 mg雞血藤葉片或30 mg藥材，用無水乙醇擦拭表面，葉片用剪刀剪成小片狀或藥材用銅盅砸碎成小細塊后，置于研缽中，加入液氮快速研磨成粉末，參照植物基因組DNA提取試劑盒的說明書提取總DNA，并適當延長藥材樣品在提取液中的殘解和溫育時間。

1.3PCR擴增

用于擴增rbcL基因的引物為rbcLa-F（5′-ATGTCACCACAAACAGAG ACTAAAGC-3′）、rbcLa-R（5′-GTAAAATCAAGTCCACCRCG-3′），其中簡并堿基R=A/G。PCR反應體系包括5 μL 10×Ex Taq buffer 、3.0 μL dNTP（10 mmol/L）、各1.0 μL 正反向引物（10 μmol/L）、50 ng 模板DNA、0.5 μL Ex Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL），并用滅菌蒸餾水補至50 μL。PCR反應程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 0.5 min，55 ℃ 0.5 min，72 ℃ 1.0 min，32個循環；72 ℃ 5 min。目的產物經0.8%瓊脂糖電泳檢測確定，送樣純化并用上下游引物進行雙向測序。

1.4序列分析

將測得的rbcL序列導入DNAMAN 6.0軟件進行拼接和校對，去掉5′和3′端的低可信區序列。將拼接序列進行Blastn（Nucleotide Blast）比對確認后，運用Bankit軟件提交至GenBank數據庫，獲取序列登記號。采用ClustalX 1.83軟件進行序列多重比對，并基于Kimura 2-Parameter（K2P）雙參數和Neighbor-Joining（NJ）鄰接法，利用MEGA 5.1軟件計算雞血藤及其混偽品的遺傳距離并構建系統發育樹（1 000次重復bootstrap檢驗各分支的支持率）。

2結果與分析

2.1DNA提取和PCR擴增

不同雞血藤樣品的DNA提取效果不盡相同，葉片樣品DNA經電泳檢測后條帶較為清晰，濃度為80 ng/mL；雞血藤藥材DNA條帶則呈彌散狀態，說明藥材DNA存在較為明顯的降解和斷裂。取50 ng上述雞血藤DNA為模板進行PCR擴增，均獲得約600 bp的rbcL基因片段（圖1），目的產物條帶清晰，符合預期結果。取30 μL PCR產物送樣，進行純化以及雙向測序，并將序列提交到GenBank，序列登記號見表1。

2.2序列差異分析

經過序列多重比對分析，本研究獲得雞血藤及其混偽品rbcL序列共16條，長度均為498 bp，GC含量分布范圍為 40.0%～44.4%（圖2）。雞血藤不同葉片和藥材樣品的rbcL序列完全一致，雞血藤及其混偽品之間存在64個差異位點，表明雞血藤及其混偽品的rbcL基因存在著較大程度的變異。

2.3遺傳距離分析

基于K2P模型計算的供試樣品間遺傳距離見表2。雞血藤種內不同個體的遺傳距離為0.000，種內沒有存在變異。

在不同物種之間，雞血藤與大血藤的種間遺傳距離最大，為0.081；與香花崖豆藤種間遺傳距離最小，為0.044。雞血藤與混偽品的種間距離遠大于雞血藤的種內距離，表明在rbcL基因中有足夠的差異鑒別雞血藤及其混偽品。

2.4聚類分析

以rbcL序列構建的雞血藤及其混偽品的系統發生樹見圖3，16個樣品聚成2個主分支。不同個體的雞血藤先聚成1個小分支，然后再與同科的香花崖豆藤、魚藤和榼藤聚成1支；木通科的大血藤則單獨成為1支，系統發生樹聚類結果與傳統分類學相符合。各分支的boostrap支持率均在70%以上，具有較好的單系性。基于rbcL基因建立的雞血藤及其混偽品系統發生樹鑒別效果良好，表明rbcL基因可作為鑒別雞血藤及其混偽品的DNA標準序列。

3討論

對于雞血藤及其混偽品的鑒定，相關報道主要是采取性狀鑒別[9]、顯微鑒別[10]、理化鑒別[11]等傳統方法，但這些方法的鑒定標識在生物學上增多為物種的遺傳表觀型，不僅受到遺傳因素的影響，還與物種的發育階段、生長環境以及人類活動如引種、炮制等有密切的關系，而且鑒別人員需有專業的知識背景，主觀性強，重復性和穩定性差。翟明等也曾用RAPD分子標記鑒別雞血藤及常見混偽品[12]，但RAPD鑒別物種需要多條引物，操作復雜，而且試驗結果的重復性容易受PCR試劑用量等多種因素的影響。

近年來，DNA條形碼技術已被公認為中藥材鑒定的有效手段，它以遺傳信息DNA為鑒定依據，鑒別特征不因物種所處的發育階段和藥材的狀態影響，具有很好的可重復性和穩定性。只需1個或少數幾個基因片段就可以完成絕大多數物種的鑒定，試驗過程標準化，容易實現物種鑒定的自動化。DNA序列可以通過互聯網和信息平臺進行收集和共享，任何人都可以用來鑒定物種[13]。作為植物DNA條形碼的熱門片段之一，rbcL基因具有通用性好、易PCR擴增和序列比對等優點，在種屬水平有良好的鑒別效果[14]。本研究中，采用1對通用引物進行PCR擴增，僅需1次試驗就可以成功擴增目的片段，簡單快捷，并且測得序列在不同的雞血藤樣品中也有很好的重復性和穩定性。在雞血藤與混偽品的496 bp序列中，存在變異堿基64個，變異程度達12.9%，種間變異程度也遠大于種內變異程度。rbcL基因有足夠的差異區別雞血藤及其混偽品， 基于rbcL基因的系統發生樹也能直觀地證實這

一結論。

本研究采用DNA條形碼技術分析雞血藤及其混偽品的rbcL基因，序列中存在著多處鑒別位點，基于rbcL基因構建的系統發生樹可直觀地鑒別雞血藤及4種混偽品，為其資源保護和臨床用藥安全提供了一定的保障。

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