環境因子對黃鱔DMRT基因甲基化的影響

吳秀林+丁煒東++曹哲明++劉旭++邴旭文

摘要：DNA甲基化是一種重要的 DNA 修飾方式，它能在不改變 DNA一級結構的情況下調控基因的表達，能夠維持正常的細胞功能，在胚胎發育、遺傳印記中起重要作用。以黃鱔為對象，采用限制性內切酶-PCR檢測特定DNA 片段是否發生甲基化的方法，研究不同溫度、pH值、光照周期條件下DMRT基因在各組織中的甲基化差異。用甲基化敏感的限制性內切酶HpaⅡ酶切黃鱔的性腺、腎、脾、肝、腸等5個組織，根據已知的DMRT2、DMRT3、DMRT4 基因序列設計特異的引物擴增酶切產物，并設置未酶切對照組，用1%瓊脂糖檢測，分析差異條帶，若未酶切組泳道出現條帶，酶切組泳道也出現條帶則判定為陽性結果，否則判定為陰性結果。結果表明：不同生態因子條件下，在5個組織中DMRT2-FR2擴增序列中的位點均表現為陽性結果；DMRT3-FR2、DMRT4-FR2、DMRT4-FR3擴增序列中的位點均表現為陰性結果，說明這4個序列中位點的甲基化狀態非常穩定，環境因子的小幅變化對其影響不大。

關鍵詞：黃鱔；溫度；光照；甲基化

中圖分類號： S966.4文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0060-04

收稿日期：2015-04-30

基金項目：江蘇省科技支撐計劃 （編號：BE2013315）；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項 （編號：2015JBFM06）；江蘇省自然科學基金 （編號：BK2011184）。

作者簡介：吳秀林（1990—），女，重慶人，碩士研究生，主要從事水產動物遺傳育種研究。E-mail：764859546@qq.com。

通信作者：邴旭文，研究員，主要從事特種水產養殖與育種研究。E-mail：bingxw@ffrc. cn。黃鱔（Monopterus albus）是重要的淡水經濟魚類，隸屬硬骨魚綱輻鰭亞綱合鰓目合鰓科黃鱔屬，其肉質細嫩、營養豐富，具有較高的食用價值、藥用價值。黃鱔多生活在河道、湖泊、溝塘等水體中，我國的珠江流域、長江流域盛產黃鱔。泰國、印度尼西亞等國也有黃鱔分布[1]。研究發現，黃鱔繁殖比較特殊，具性逆轉現象，一般經歷雌性發育階段—間性發育階段—雄性發育階段，這種獨特的生理現象使得黃鱔成為研究探討魚類性別控制機理的極好材料[2]。DMRT基因家族成員的典型特征是具有一個保守的DM結構域，DM 是一個靠特殊的鋅指結構連接DNA 的結構域，通過調節目的基因轉錄參與發育調節過程[3]。目前，已在多種魚類體內檢測到 DMRT 家族基因[4]。DMRT基因普遍被認為與性別分化有關，如DMRT1、DMRT2、DMRT3與雄性性別分化密切相關，對精巢正常發育有重要作用。Kim等研究發現，小鼠DMRT3參與性腺、腦與脊髓等的發育，且在雄性中比雌性的表達量高[3]。Kondo等在青鳉（O. latipes）成體精巢中檢測到有DMRT3的表達，并且在其成體精巢、卵巢等器官中發現有DMRT2和DMRT4的表達，推測DMRT2、DMRT3和DMRT4可能參與青鳉精子的發生[5]。王佳等通過對鯽 DMRT3 基因的克隆和表達分析，發現 DMRT3可能在早期器官發生和雄性性腺發育調控中起作用[6]。環境因子對魚類的生長、攝食、代謝、生殖以及內分泌等產生間接而廣泛的影響[7]。阮國良等以雌性幼鱔為對象，研究不同光照周期對其生長和性腺發育的影響，結果表明，黃鱔在黑暗狀態下其生長和性腺發育均得到改善[8]。Navarro-Martín等研究發現，溫度可刺激歐洲鱸魚（Dicentrarchus labrax）性別轉化并可影響性別比例，但影響機制尚不明確[9]。表觀遺傳學是指在不改變DNA序列的情況下，基因的表達產生可遺傳變異。DNA甲基化是一種與基因抑制相關的表觀遺傳機制，是表觀遺傳學的重要組成部分[10]。DNA甲基化由DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferase，DNA Mtase）催化，S-腺苷甲硫氨酸提供甲基供體，在胞嘧啶的第5 位碳原子上加上一甲基基團形成甲基化脫氧胞嘧啶的共價修飾過程[11]，是最常見的復制及轉錄后修飾方式之一，在基因表達調控、發育調節等方面發揮重要作用[12]。Jabbari等通過比較42種脊椎動物體內5-甲基胞嘧啶的甲基化程度，得出魚類和兩棲動物機體甲基化是鳥類和哺乳動物的2倍，且CPG比例前者較高[13]。Varriale等研究對比了南極與熱帶魚類機體甲基化程度，結果表明，南極魚類甲基化程度明顯高于熱帶魚類，由此推斷動物機體甲基化程度與其體溫相關[14]。本研究探討了不同溫度、pH值、光照周期條件下，DMRT基因在黃鱔各組織中的甲基化差異，旨在為黃鱔性別調控研究提供一種分子學角度的方法。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗動物試驗所用黃鱔來自南京農業大學無錫漁業學院南泉試驗基地，對養殖環境進行單因素控制，分別控制養殖水體溫度、pH值、光照時間3個生態因子。每個生態因子設置3個梯度試驗組，每個梯度試驗組設置2個平行，每個平行養殖4條黃鱔；設置1個空白對照組，空白對照組設置2個平行，每個平行養殖4條黃鱔。水體溫度分別為25、28、31 ℃；pH值分別為6.5、7.5、8.5；光照時間分別為8、10、12 h。總樣本數為80條黃鱔，雌雄各半。

1.1.2試驗儀器22331 Hamburg PCR儀（Eppendorf公司），低溫離心機（Sopvall公司），紫外分光光度計（Eppendorf公司），無菌操作臺，瓊脂糖凝膠成像系統，高壓濕熱滅菌鍋，水浴鍋，電熱恒溫干燥箱，電子天平，電泳儀及電泳槽，各種型號加樣槍，微波爐，烘箱，恒溫振蕩器，-70 ℃超低溫冰箱，4 ℃ 冰箱。

1.1.3試驗試劑 去離子水、70%乙醇、STE緩沖液、Tris-Cl飽和酚、蛋白酶K、三氯甲烷、異丙醇、TaKaRa LA TaqTM、HpaⅡ、Marker DL2000、10×Loading Buffer、EB、50×TAE Buffer、瓊脂糖。

1.2方法

1.2.1總DNA的提取取黃鱔各組織迅速將其磨碎，加入500 μL STE緩沖液和10 μL蛋白酶K于55 ℃下3～4 h，用Tris-Cl飽和酚、三氯甲烷各抽提1次，取上清液并加入等體積的異丙醇，混勻后放于4 ℃冰箱過夜，12 000 r/min離心 10 min，棄上清，用300 μL 70%乙醇洗沉淀2次，加入100 μL ddH2O溶解，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品的完整性，將樣品儲存在-70 ℃下保存備用。

1.2.2引物設計筆者所在實驗室前期工作中，根據已知的DMRT2、DMRT3、DMRT4 基因啟動子區富含 CpG的序列，分別設計5對引物：DMRT-F1、DMRT-R1，DMRT-F2、DMRT-R2，DMRT-F3、DMRT-R3，DMRT-F4、DMRT-R4 以及 DMRT-F5、 DMRT-R5，經過篩選比較，發現用DMRT2-FR2、DMRT3-FR2、DMRT4-FR2、DMRT4-FR3引物能擴增出較好的條帶。所以本試驗采用DMRT2-FR2、DMRT3-FR2、DMRT4-FR2、DMRT4-FR3引物（表1）。

1.2.3黃鱔基因組DNA的酶切將提取的DNA產物中加入10 U/μL HpaⅡ酶0.5 μL，于37 ℃水浴中酶切4 h（表2）。

1.2.4黃鱔DMRT基因酶切產物的擴增及檢測酶切產物PCR體系：10×PCR buffer（Mg2+ plus）2.5 μL，dNTP Mixture 2 μL，Taq酶 0.25 μL，正反引物各0.5 μL，DNA模板 1 μL，用ddH2O補足25 μL。擴增程序為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，59 ℃（60 ℃）45 s，72 ℃ 1 min，34個循環；最后4 ℃保存。上述PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，置于紫外分光光度計下觀察，拍照記錄結果并對結果進行甲基化位點分析。

2結果與分析

2.1不同溫度下DMRT基因的酶切結果

水溫分別控制為25、28、31 ℃，取黃鱔性腺、腎臟、肝臟、脾臟、腸等5個組織的基因組DNA用DMRT2-FR2引物擴增后，酶切組和未酶切組均有條帶，表明DMRT2-FR2擴增序列中的位點均是甲基化的；用DMRT3-FR2、DMRT4-FR2、DMRT4-FR3引物擴增后，未酶切組有條帶，酶切組沒有出現條帶，說明這3個擴增片段中的位點均是陰性結果。圖1表示，水溫為28 ℃下黃鱔肝基因組用DMRT4-FR2引物擴增后的酶切結果。表3表示不同溫度下黃鱔各組織的甲基化統計結果。

2.2不同pH值下黃鱔各組織DMRT基因的酶切結果

水體pH值分別控制為6.5、7.5、8.5環境下，黃鱔性腺、腎臟、肝臟、脾臟、腸等5個組織的基因組DNA用DMRT3-FR2引物擴增后，酶切組和未酶切組均有條帶，表明DMRT3-FR2擴增序列中的位點均出現陽性結果；用DMRT3-FR2、DMRT4-FR2、DMRT4-FR3引物擴增后，未酶切組有條帶，而酶切組沒有出現條帶，說明這3個擴增片段中的位點均出現陰性結果。圖2表示pH值為6.5條件下黃鱔性腺基因組用DMRT3-FR2引物擴增后的酶切結果。表4表示不同pH值下黃鱔各組織的甲基化統計結果。

2.3不同光照周期下DMRT基因的酶切結果

養殖網箱每天光照時間控制在8、10、12 h環境下，黃鱔性腺、腎臟、肝臟、脾臟、腸等5個組織的基因組DNA用DMRT3-FR2引物擴增后，酶切組和未酶切組均有條帶，表明DMRT3-FR2擴增序列中的位點均表現為陽性結果；用DMRT3-FR2、DMRT4-FR2、DMRT4-FR3引物擴增后，未酶切組有條帶，酶切組沒有出現條帶，說明這3個擴增片段中的位點均變現為陰性結果。圖3表示光照時間為10 h下黃鱔腎臟基因組用DMRT4-FR3引物擴增后的酶切結果，表5表示不同光照時間下黃鱔各組織的甲基化統計結果。

對比表3、表4、表5可以得出，不同生態因子條件下黃鱔各組織的DMRT基因酶切后的擴增結果是一致的，DMRT3-FR2擴增序列中的位點均是甲基化的；DMRT3-FR2、DMRT4-FR2、DMRT4-FR3的擴增序列中的位點均是去甲基化的。

3結論與討論

本試驗將PCR引物設計在酶切位點的兩側，DNA被酶切后，只有發生甲基化不被切割的DNA才能被PCR擴增，檢測有條帶，反之則無條帶。結果表明，黃鱔性腺、腎、脾、肝、腸等5個組織在不同的光照周期、pH值、溫度下的甲基化狀態是一致的，DMRT3-FR2擴增序列中的位點均是甲基化的；DMRT3-FR2、DMRT4-FR2、DMRT4-FR3擴增序列中的位點均是去甲基化的。本研究采用限制性內切酶結合PCR的方

法進行甲基化位點研究，具有簡單、快捷的特點。覃揚等建立甲基化敏感的限制性內切酶結合半巢式降落PCR方法，研究P16基因啟動子區甲基化狀態。結果表明，所采用的HpaⅡ酶切后半巢式PCR方法的特異性強，靈敏度達100 fg，說明該試驗方法簡便、成本低廉，并且有高度的特異性與靈敏度，實際應用價值高[15]。

體細胞中大多數常染色體基因的CpG島保持非甲基化狀態，只有一小部分在正常組織和細胞中發生甲基化，表明甲基化位點在生物體內存在廣泛，同時對基因的表達存在著一定的調節功能。Navarro-Martin等研究發現，1齡歐洲鱸魚（Dicentrarchus labrax）的腦組織中，cyp19a啟動子甲基化程度不受性別和溫度的調控；在性腺中，cyp19a啟動子甲基化程度雄魚是雌魚的2倍，但在高溫下雌魚cyp19a 啟動子甲基化程度有所增加；在腦和性腺中，管家基因β-actin啟動子的甲基化程度也與性別和溫度無明顯關系[9]。本試驗結果與其相似。歐洲鱸魚的性別受基因型和溫度的雙重控制，由于這種特殊的性控機制，若在其性腺形成前改變溫度，則可以影響其性別比例。cyp19a基因編碼cyp19a芳香化酶，該酶的活性影響性激素比值。更重要的是在大多數變溫脊椎動物中，環境溫度控制性別比例均是通過調控cyp19a基因的表達量而實現的。Varriale等研究對比了南極與熱帶魚類機體甲基化程度，結果表明，南極魚類甲基化程度明顯高于熱帶魚類，推測動物機體甲基化程度與體溫呈負相關，但是，他們發現屬于虎魚科鯖科和麗鯛科的魚類機體甲基化程度與其體溫呈正相關，即使是相同體溫的魚類，其機體甲基化程度也有明顯差異，所以他們認為其他因子如水深、產地、馴化時間及新陳代謝率等都會對魚類機體甲基化程度產生影響[14]。Jabbari 等研究也證明，除了體溫外，存在甲基化的序列數量和基因片段長度也會影響動物機體甲基化程度[13]。Varriale等研究結果表明，熱帶魚類水溫控制范圍為20～30 ℃，極地魚類水溫控制范圍為0～10 ℃，溫差較本試驗設置的溫度梯度（25、28、31 ℃）差異大很多，可能導致結果[14]不一致。

甲基化作為DNA修飾的重要途徑，是表觀遺傳學的重要組成部分，也成為目前的研究熱點[16]。本試驗所用方法可以快速檢測多個基因的啟動子甲基化狀態，是其他方法無法達到的。但在試驗過程中需要特別注意HpaⅡ酶切時要確保酶切完全，否則殘余的微量未被HpaⅡ切開的未甲基化5′-CCGG-3′ 就可能作為 PCR反應的模版導致假陽性的出現。為了驗證本試驗建立的HpaⅡ限制性內切酶方法是否具有廣泛的適用性，將進一步在更多的其他魚類中進行確證應用，為該方法的推廣應用提供豐富的科學依據。

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