H9亞型禽流感病毒的分子生物學鑒定

司振書+賈國富

摘要：H9亞型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）是危害我國養禽業的主要病毒之一，造成了嚴重的經濟損失。根據H9亞型AIV的HA基因設計了1 對引物，建立了H9亞型禽流感病毒的RT-PCR鑒定方法。H9亞型AIV的HA基因預期擴增的目的片斷長度為425 bp。對H9N2亞型禽流感病毒不同稀釋度的尿囊液進行檢測，證實病毒尿囊液的最低檢出量為1×104.25EID50/100 μL。建立的RT-PCR檢測方法對H9、H3、H4、H5亞型AIV及新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒等進行檢測，結果僅有H9N2亞型AIV出現特異性目的條帶，其他均未出現目的條帶，與其他常見禽病病原無交叉反應；用建立的RT-PCR和病毒分離2種方法同時對10株H9N2亞型AIV和8個病雞組織的雞胚尿囊液樣品進行檢測，結果2種檢測方法的符合率達100%。說明該鑒定方法特異性強，敏感性較高。

關鍵詞：禽流感病毒；H9亞型；鑒定

中圖分類號： S855.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0064-02

收稿日期：2015-05-15

基金項目：聊城大學博士啟動基金（編號：318051310）；山東省農業良種工程重點課題（編號：25114426）。

作者簡介：司振書（1971—），女，山東冠縣人，博士，副教授，研究方向為預防獸醫。E-mail：dckszs@163.com。禽流感病毒（AIV）的核酸為單股負鏈RNA，由8個獨立的RNA節段組成[1]，變異頻繁，亞型眾多。H9亞型禽流感病毒為低致病力毒株，特點是分布廣泛，能造成雞群的免疫抑制，如果與禽傳染性支氣管炎病毒、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等其他病原協同感染則可引起禽類嚴重發病。近十幾年來，H9亞型禽流感在我國呈上升趨勢，嚴重危害了我國養禽業發展，影響畜產品的國際貿易，同時還給人類健康帶來威脅。研究表明，H9N2亞型AIV為1997年引起香港流感的H5N1亞型AIV提供了內部基因[2]，1999年，發生了H9N2亞型AIV感染人事件[3]，2013年我國發生了H7N9感染人事件，6個內部基因全部來自于H9N2 AIV[4-5]。所以，H9N2亞型AIV公共衛生意義引起了全世界廣泛關注。傳統檢測H9亞型AIV的方法主要是病毒分離培養與血凝抑制試驗（HI），費時費力，需要多種亞型的血清和抗原，不能及時對病毒進行鑒定或作出診斷。根據H9亞型AIV的HA基因設計了1對引物，初步建立了1種針對H9亞型AIV的檢測方法，既可對H9亞型AIV快速、準確地鑒定，又可用于H9亞型AIV的流行病學調查。

1材料與方法

1.1毒株

H9N2亞型AIV、H3N8亞型AIV、H4N6亞型AIV、H5N1亞型AIV、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）、傳染性法氏囊炎病毒（IBDV）、雞新城疫病毒（NDV）等毒株由中國農業大學動物流感研究室保存并提供。

1.2引物的設計、合成與篩選

根據H9亞型禽流感病毒的HA基因的序列，通過DNAman 軟件進行比對，找出HA基因的保守區，針對HA基因的保守區序列設計特異性引物，并在Genbank上進行Blast檢測比對分析，用Oligo 4.0軟件分析上下游引物是否匹配，將分析合格的引物送上海生工生物技術有限責任公司北京合成部合成。合成了針對HA基因的5對引物，用中國農業大學流感研究室分離保存的H9N2亞型AIV進行篩選，根據擴增效率確定引物對。確定上游引物H9-F：5′-TGTGGCAACTGAAGAAAT-3′；下游引物H9-R：5′-ACCAACCTCCCTCTATGA-3′；退火溫度為53 ℃。目的片斷長度為425 bp。

1.3主要試劑

TRIzol Reagent 由invitrogen公司生產；反轉錄試劑盒K1622，Fermentas；氯仿、異丙醇、乙醇等均為市售；GoldenView由北京索萊寶公司生產。

1.4H9N2亞型AIV病毒含量的測定

取感染H9N2亞型禽流感病毒A/CK/SD/ZB/2007的尿囊液，作10倍倍比稀釋，每個稀釋度接種3枚雞胚（0.1 mL/枚）。35 ℃孵育48 h，將雞胚于4 ℃過夜，收獲尿囊液，測定其血凝效價，按Reed-Muench法計算半數感染量。

1.5病毒RNA的提取與cDNA的合成

取感染H9N2亞型AIV毒株A/CK/SD/ZB/2007的雞胚尿囊液Trizol法提取病毒的總RNA，將干燥的RNA用11 μL DEPC 水溶解，立即做RT-PCR的擴增或-80 ℃保存備用。

將Unit 12（10 μmol/L）1 μL加到含RNA的11 μL DEPC 水中，瞬時離心，70 ℃水浴5 min后，置冰上5 min。依次加入5×AMV buffer 5 μL，dNTPs（10 mmol/L） 2 μL，RNasin （40 U/μL） 1 μL，MLV （5 U/μL） 1 μL，混勻，瞬時離心，37 ℃ 水浴1 h，70 ℃ 5 min，4 ℃保存。

1.6反應體系和反應條件的優化

對RT-PCR反應體系和變性、退火、延伸溫度和時間、循環次數等條件進行優化，最后確定采用總體積為 25 μL 的反應體系：2×PCR MIX buffer 12.5 μL；濃度為 20 pmol/μL HA上游引物H9-F 1 μL；HA下游引物H9-R 1 μL；cDNA 2 μL；ddH2O補足至25 μL。最后確定RT-PCR最佳循環條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火35 s，72 ℃ 延伸35 s，34個循環；然后72 ℃延伸10 min。

1.7產物分析與測序

用最佳反應體系及條件對毒株A/CK/SD/ZB/2007進行PCR擴增，將產物進行回收純化，送北京華大基因科技股份有限公司測序。

1.8特異性試驗

用建立的RT-PCR方法分別對H9N2亞型、H3N8亞型、H4N6亞型、H5N1亞型AIV及ILTV、IBV、IBDV、NDV的雞胚尿囊液進行PCR擴增，分析該檢測方法的特異性。

1.9敏感性試驗

對已確定病毒含量的毒株A/CK/SD/ZB/2007的尿囊液進行100、10-1、10-2、10-3、10-4等不同稀釋度稀釋。對不同稀釋度尿囊液進行PCR擴增，分析該檢測方法的敏感性。

1.10RT-PCR檢測方法的應用

取經HI常規方法鑒定的H9亞型AIV感染雞的組織樣品8份，稱量，研磨，加含雙抗的PBS制成10%～20%質量分數的懸液。4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清接種10日齡SPF雞胚，收集24～72 h死亡及未死亡的雞胚尿囊液。對實驗室保存的10株H9N2亞型AIV及以上8個樣品分別用該方法進行PCR擴增。

2結果與分析

2.1病毒含量的測定結果

經測定H9N2亞型禽流感病毒A/CK/SD/ZB/2007的尿囊液，病毒含量為1×107.25EID50/100 μL。

2.2擴增結果

H9N2亞型AIV A/CK/SD/ZB/2007的擴增結果見圖1。獲得了425 bp的目的條帶，與預期產物大小相符。

2.3測序結果

將HA基因擴增片段測序結果在NCBI流感數據庫中進行Blast比對，HA基因序列與A/Chicken/Shandong/A1/2009（H9N2）、A/Chicken/Zhejiang/611/2011（H9N2）等毒株的第4個片段HA基因的同源性為99%。

2.4特異性試驗結果

H9N2亞型AIV擴增出425 bp的目的條帶。而NDV、H3N8亞型AIV、H4N6亞型AIV、H5N1亞型AIV、ILTV、IBV、IBDV的尿囊液樣品均無條帶出現（圖2）。結果表明，該方法對H9亞型AIV進行檢測具有很強的特異性，可特異性地檢出H9亞型AIV。

2.5敏感性試驗結果

對病毒含量為1×107.25EID50/100 μL的病毒A/CK/SD/

ZB/2007的尿囊液進行10倍倍比稀釋，分別提取RNA，用該方法檢測，擴增結果見圖3。在10-3稀釋時仍然可以擴增出明顯的目的條帶，說明該方法對病毒尿囊液的最低檢出量為1×104.25EID50/100 μL，靈敏度較高，敏感性較強。

2.6RT-PCR檢測方法的應用

對10株H9N2亞型AIV和8個病雞組織的雞胚尿囊液樣品用該方法進行檢測，結果（圖4）表明，各毒株與樣品均擴增出了425 bp的條帶，大小與預期相符，表明所建立的RT-PCR檢測方法的鑒定結果與HI等常規方法相比符合率為100%。

3討論

H9N2亞型AIV在我國雞群中分布廣泛，并能引起人類感染，給養禽業和公共衛生造成重大影響，能對其快速準確地進行鑒定非常重要。本研究根據H9N2亞型禽流感病毒的

HA基因和NA基因的保守區序列各設計1對引物，初步建立了針對H9N2亞型禽流感病毒的RT-PCR快速診斷方法，建立的RT-PCR檢測方法對H3、 H4、H5、H9等亞型流感病毒、新城疫病毒和雞傳染性支氣管炎病毒等進行檢測，只有H9N2亞型AIV出現特異性目的條帶，其他亞型AIV與NDV等無任何條帶，說明該方法對其他亞型AIV及NDV等無交叉反應，具有特異性；通過對H9N2亞型AIV不同稀釋度進行檢測，證實病毒尿囊液的最低檢出量為1×104.25EID50/100 μL，說明該檢測方法特異性強，敏感性較高；對10株H9N2亞型AIV及8個病雞組織的雞胚尿囊液樣品進行檢測，其結果與經典的HI試驗鑒定符合率為100%。該方法可對H9亞型AIV進行快速鑒定，為試劑盒的研制打下了良好基礎，在獸醫臨床診斷和流行病學調查方面具有較好的應用前景。

參考文獻：

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