H9亞型禽流感病毒的分子生物學(xué)鑒定

司振書(shū)+賈國(guó)富

摘要：H9亞型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）是危害我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的主要病毒之一，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。根據(jù)H9亞型AIV的HA基因設(shè)計(jì)了1 對(duì)引物，建立了H9亞型禽流感病毒的RT-PCR鑒定方法。H9亞型AIV的HA基因預(yù)期擴(kuò)增的目的片斷長(zhǎng)度為425 bp。對(duì)H9N2亞型禽流感病毒不同稀釋度的尿囊液進(jìn)行檢測(cè)，證實(shí)病毒尿囊液的最低檢出量為1×104.25EID50/100 μL。建立的RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)H9、H3、H4、H5亞型AIV及新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒等進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果僅有H9N2亞型AIV出現(xiàn)特異性目的條帶，其他均未出現(xiàn)目的條帶，與其他常見(jiàn)禽病病原無(wú)交叉反應(yīng)；用建立的RT-PCR和病毒分離2種方法同時(shí)對(duì)10株H9N2亞型AIV和8個(gè)病雞組織的雞胚尿囊液樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果2種檢測(cè)方法的符合率達(dá)100%。說(shuō)明該鑒定方法特異性強(qiáng)，敏感性較高。

關(guān)鍵詞：禽流感病毒；H9亞型；鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)： S855.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）06-0064-02

收稿日期：2015-05-15

基金項(xiàng)目：聊城大學(xué)博士啟動(dòng)基金（編號(hào)：318051310）；山東省農(nóng)業(yè)良種工程重點(diǎn)課題（編號(hào)：25114426）。

作者簡(jiǎn)介：司振書(shū)（1971—），女，山東冠縣人，博士，副教授，研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)。E-mail：dckszs@163.com。禽流感病毒（AIV）的核酸為單股負(fù)鏈RNA，由8個(gè)獨(dú)立的RNA節(jié)段組成[1]，變異頻繁，亞型眾多。H9亞型禽流感病毒為低致病力毒株，特點(diǎn)是分布廣泛，能造成雞群的免疫抑制，如果與禽傳染性支氣管炎病毒、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等其他病原協(xié)同感染則可引起禽類(lèi)嚴(yán)重發(fā)病。近十幾年來(lái)，H9亞型禽流感在我國(guó)呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害了我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展，影響畜產(chǎn)品的國(guó)際貿(mào)易，同時(shí)還給人類(lèi)健康帶來(lái)威脅。研究表明，H9N2亞型AIV為1997年引起香港流感的H5N1亞型AIV提供了內(nèi)部基因[2]，1999年，發(fā)生了H9N2亞型AIV感染人事件[3]，2013年我國(guó)發(fā)生了H7N9感染人事件，6個(gè)內(nèi)部基因全部來(lái)自于H9N2 AIV[4-5]。所以，H9N2亞型AIV公共衛(wèi)生意義引起了全世界廣泛關(guān)注。傳統(tǒng)檢測(cè)H9亞型AIV的方法主要是病毒分離培養(yǎng)與血凝抑制試驗(yàn)（HI），費(fèi)時(shí)費(fèi)力，需要多種亞型的血清和抗原，不能及時(shí)對(duì)病毒進(jìn)行鑒定或作出診斷。根據(jù)H9亞型AIV的HA基因設(shè)計(jì)了1對(duì)引物，初步建立了1種針對(duì)H9亞型AIV的檢測(cè)方法，既可對(duì)H9亞型AIV快速、準(zhǔn)確地鑒定，又可用于H9亞型AIV的流行病學(xué)調(diào)查。

1材料與方法

1.1毒株

H9N2亞型AIV、H3N8亞型AIV、H4N6亞型AIV、H5N1亞型AIV、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）、傳染性法氏囊炎病毒（IBDV）、雞新城疫病毒（NDV）等毒株由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物流感研究室保存并提供。

1.2引物的設(shè)計(jì)、合成與篩選

根據(jù)H9亞型禽流感病毒的HA基因的序列，通過(guò)DNAman 軟件進(jìn)行比對(duì)，找出HA基因的保守區(qū)，針對(duì)HA基因的保守區(qū)序列設(shè)計(jì)特異性引物，并在Genbank上進(jìn)行Blast檢測(cè)比對(duì)分析，用Oligo 4.0軟件分析上下游引物是否匹配，將分析合格的引物送上海生工生物技術(shù)有限責(zé)任公司北京合成部合成。合成了針對(duì)HA基因的5對(duì)引物，用中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)流感研究室分離保存的H9N2亞型AIV進(jìn)行篩選，根據(jù)擴(kuò)增效率確定引物對(duì)。確定上游引物H9-F：5′-TGTGGCAACTGAAGAAAT-3′；下游引物H9-R：5′-ACCAACCTCCCTCTATGA-3′；退火溫度為53 ℃。目的片斷長(zhǎng)度為425 bp。

1.3主要試劑

TRIzol Reagent 由invitrogen公司生產(chǎn)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒K1622，F(xiàn)ermentas；氯仿、異丙醇、乙醇等均為市售；GoldenView由北京索萊寶公司生產(chǎn)。

1.4H9N2亞型AIV病毒含量的測(cè)定

取感染H9N2亞型禽流感病毒A/CK/SD/ZB/2007的尿囊液，作10倍倍比稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度接種3枚雞胚（0.1 mL/枚）。35 ℃孵育48 h，將雞胚于4 ℃過(guò)夜，收獲尿囊液，測(cè)定其血凝效價(jià)，按Reed-Muench法計(jì)算半數(shù)感染量。

1.5病毒RNA的提取與cDNA的合成

取感染H9N2亞型AIV毒株A/CK/SD/ZB/2007的雞胚尿囊液Trizol法提取病毒的總RNA，將干燥的RNA用11 μL DEPC 水溶解，立即做RT-PCR的擴(kuò)增或-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將Unit 12（10 μmol/L）1 μL加到含RNA的11 μL DEPC 水中，瞬時(shí)離心，70 ℃水浴5 min后，置冰上5 min。依次加入5×AMV buffer 5 μL，dNTPs（10 mmol/L） 2 μL，RNasin （40 U/μL） 1 μL，MLV （5 U/μL） 1 μL，混勻，瞬時(shí)離心，37 ℃ 水浴1 h，70 ℃ 5 min，4 ℃保存。

1.6反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化

對(duì)RT-PCR反應(yīng)體系和變性、退火、延伸溫度和時(shí)間、循環(huán)次數(shù)等條件進(jìn)行優(yōu)化，最后確定采用總體積為 25 μL 的反應(yīng)體系：2×PCR MIX buffer 12.5 μL；濃度為 20 pmol/μL HA上游引物H9-F 1 μL；HA下游引物H9-R 1 μL；cDNA 2 μL；ddH2O補(bǔ)足至25 μL。最后確定RT-PCR最佳循環(huán)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火35 s，72 ℃ 延伸35 s，34個(gè)循環(huán)；然后72 ℃延伸10 min。

1.7產(chǎn)物分析與測(cè)序

用最佳反應(yīng)體系及條件對(duì)毒株A/CK/SD/ZB/2007進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，送北京華大基因科技股份有限公司測(cè)序。

1.8特異性試驗(yàn)

用建立的RT-PCR方法分別對(duì)H9N2亞型、H3N8亞型、H4N6亞型、H5N1亞型AIV及ILTV、IBV、IBDV、NDV的雞胚尿囊液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析該檢測(cè)方法的特異性。

1.9敏感性試驗(yàn)

對(duì)已確定病毒含量的毒株A/CK/SD/ZB/2007的尿囊液進(jìn)行100、10-1、10-2、10-3、10-4等不同稀釋度稀釋。對(duì)不同稀釋度尿囊液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析該檢測(cè)方法的敏感性。

1.10RT-PCR檢測(cè)方法的應(yīng)用

取經(jīng)HI常規(guī)方法鑒定的H9亞型AIV感染雞的組織樣品8份，稱(chēng)量，研磨，加含雙抗的PBS制成10%～20%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的懸液。4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清接種10日齡SPF雞胚，收集24～72 h死亡及未死亡的雞胚尿囊液。對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的10株H9N2亞型AIV及以上8個(gè)樣品分別用該方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2結(jié)果與分析

2.1病毒含量的測(cè)定結(jié)果

經(jīng)測(cè)定H9N2亞型禽流感病毒A/CK/SD/ZB/2007的尿囊液，病毒含量為1×107.25EID50/100 μL。

2.2擴(kuò)增結(jié)果

H9N2亞型AIV A/CK/SD/ZB/2007的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。獲得了425 bp的目的條帶，與預(yù)期產(chǎn)物大小相符。

2.3測(cè)序結(jié)果

將HA基因擴(kuò)增片段測(cè)序結(jié)果在NCBI流感數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)，HA基因序列與A/Chicken/Shandong/A1/2009（H9N2）、A/Chicken/Zhejiang/611/2011（H9N2）等毒株的第4個(gè)片段HA基因的同源性為99%。

2.4特異性試驗(yàn)結(jié)果

H9N2亞型AIV擴(kuò)增出425 bp的目的條帶。而NDV、H3N8亞型AIV、H4N6亞型AIV、H5N1亞型AIV、ILTV、IBV、IBDV的尿囊液樣品均無(wú)條帶出現(xiàn)（圖2）。結(jié)果表明，該方法對(duì)H9亞型AIV進(jìn)行檢測(cè)具有很強(qiáng)的特異性，可特異性地檢出H9亞型AIV。

2.5敏感性試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)病毒含量為1×107.25EID50/100 μL的病毒A/CK/SD/

ZB/2007的尿囊液進(jìn)行10倍倍比稀釋?zhuān)謩e提取RNA，用該方法檢測(cè)，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖3。在10-3稀釋時(shí)仍然可以擴(kuò)增出明顯的目的條帶，說(shuō)明該方法對(duì)病毒尿囊液的最低檢出量為1×104.25EID50/100 μL，靈敏度較高，敏感性較強(qiáng)。

2.6RT-PCR檢測(cè)方法的應(yīng)用

對(duì)10株H9N2亞型AIV和8個(gè)病雞組織的雞胚尿囊液樣品用該方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（圖4）表明，各毒株與樣品均擴(kuò)增出了425 bp的條帶，大小與預(yù)期相符，表明所建立的RT-PCR檢測(cè)方法的鑒定結(jié)果與HI等常規(guī)方法相比符合率為100%。

3討論

H9N2亞型AIV在我國(guó)雞群中分布廣泛，并能引起人類(lèi)感染，給養(yǎng)禽業(yè)和公共衛(wèi)生造成重大影響，能對(duì)其快速準(zhǔn)確地進(jìn)行鑒定非常重要。本研究根據(jù)H9N2亞型禽流感病毒的

HA基因和NA基因的保守區(qū)序列各設(shè)計(jì)1對(duì)引物，初步建立了針對(duì)H9N2亞型禽流感病毒的RT-PCR快速診斷方法，建立的RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)H3、 H4、H5、H9等亞型流感病毒、新城疫病毒和雞傳染性支氣管炎病毒等進(jìn)行檢測(cè)，只有H9N2亞型AIV出現(xiàn)特異性目的條帶，其他亞型AIV與NDV等無(wú)任何條帶，說(shuō)明該方法對(duì)其他亞型AIV及NDV等無(wú)交叉反應(yīng)，具有特異性；通過(guò)對(duì)H9N2亞型AIV不同稀釋度進(jìn)行檢測(cè)，證實(shí)病毒尿囊液的最低檢出量為1×104.25EID50/100 μL，說(shuō)明該檢測(cè)方法特異性強(qiáng)，敏感性較高；對(duì)10株H9N2亞型AIV及8個(gè)病雞組織的雞胚尿囊液樣品進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果與經(jīng)典的HI試驗(yàn)鑒定符合率為100%。該方法可對(duì)H9亞型AIV進(jìn)行快速鑒定，為試劑盒的研制打下了良好基礎(chǔ)，在獸醫(yī)臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查方面具有較好的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

[1]Webster R G，Bean W J. German O T，el al. Evolution and ecology of influenza A viruses[J]. Clinical Microbiology Reviews，1992，56（1）：152-157.

[2]Guan Y，Shortridge K F，Krauss S，et al. H9N2 influenza viruses possessing H5N1-like internal genomes continue to circulate in poultry in southeastern China[J]. Journal of Virology，2000，74（20）：9372-9380.

[3]郭元吉，謝健屏，吳昆昱，等. 流感病毒A/廣州/333/99（H9N2）毒株基因組特性的研究[J]. 中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2002，16（2）：142-145.

[4]Shi J Z，Deng G H，Liu P H，et al. Isolation and characterization of H7N9 viruses from live poultry markets-Implication of the source of current H7N9 infection in humans[J]. Chinese Science Bulletin，2013，58（16）：1857-1863.

[5]Gao R，Cao B，Hu Y，et al. Human infection with a novel avian-origin influenza A （H7N9） virus[J]. The New England Journal of Medicine，2013，368（20）：1888-1897.艾子凌，高鵬，杜黎黎，等. 利用CAPS初步定位甜瓜MR-1白粉病抗性基因[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（6）：66-70.