油菜油體蛋白基因啟動子的克隆及在油葵中的功能驗證

邵鐵梅++安勝軍+仵陶+焦展++李雪++劉培++柴錫慶+高維娟

摘要：利用PCR技術，從油菜（Brassica campestris）基因組DNA中克隆20 ku油體蛋白基因上游903 bp 的調控序列NOP，將其與GUS基因融合構建植物表達載體，利用花粉管通道法轉化油葵并進行PCR擴增，組織化學染色檢測啟動子和GUS基因在油葵基因組中的整合和表達情況。結果表明，NOP序列1～903 bp與報道序列同源性為95%，包含驅動基因表達的重要元件及驅動基因在種子中特異表達所必需的核苷酸序列；目的片段已整合到油葵基因組中，NOP具有種子特異性啟動子的功能，能夠驅動GUS基因在油葵種子中特異性表達，而在油葵根、莖、葉中均不表達。

關鍵詞：油葵；煙草；種子特異性啟動子；GUS染色；油體蛋白基因

中圖分類號： Q785文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0071-02

收稿日期：2015-12-23

基金項目：河北省高等學校科學技術研究重點（編號：ZH2011208）；河北省人力資源和社會保障廳 2011年度河北省人才工程培養（編號：35）；河北省高等學校科學技術研究重點（編號：ZD2010216）。

作者簡介：邵鐵梅（1974—），女，河北徐水人，博士，副教授，主要從事植物生物反應器生產蛋白類藥物研究。 Tel：（0311）85110321；E-mail：836311038@qq.com。

通信作者：高維娟，博士，教授，主要從事植物生物反應器生產蛋白類藥物研究。Tel：（0311）83938058；E-mail：gwj6088@163.com。植物油體表達體系是以種子特異性基因為啟動子，驅動目的蛋白基因與油體蛋白基因在植物油體中融合表達，獲得轉基因植物種子，粉碎種子并離心，回收上層油，利用油體親脂疏水性去除種子中大部分非目標成分，進一步獲得純化的目的蛋白，使蛋白的分離純化成本得到顯著降低[1]。油用向日葵（Helianthus annuus L.）簡稱油葵，是世界第二大油料作物，也是我國四大油料作物之一[2]，因其產量和含油率高，被認為是構建植物油體表達體系較為理想的植物。另外，油葵是一種耐旱作物，可在鹽堿地、干旱地區甚至沙漠等惡劣環境下種植，不僅不會與糧食“爭地”，還有利于提高我國山嶺薄地、干旱貧瘠地塊的利用率，適于大面積推廣，有助于緩解我國耕地緊張的壓力。目前，成功用于構建植物油體表達體系的種子特異性啟動子有油菜（Brassica campestris）油體蛋白基因啟動子、菜豆蛋白基因啟動子、擬南芥油體蛋白基因啟動子等。油菜油體蛋白基因啟動子驅動一種新型降鈣素基因，與芝麻油體蛋白基因在棉花種子和油菜種子中成功融合表達[3]；菜豆蛋白基因啟動子驅動擬南芥18 ku油體蛋白單鏈抗體和阿樸脂蛋白AI米蘭突變體，與融合基因在紅花種子中表達[4]；擬南芥油體蛋白基因啟動子驅動擬南芥油體蛋白基因和水蛭素基因在油菜種子中融合表達[5]。驅動外源基因在油葵種子中特異表達的研究比較少。

油菜是我國非常重要的油料作物，油菜籽含油量高達42%～45%，油菜20 ku油體蛋白是24 ku油體蛋白含量的10倍，賈世榮等成功利用20 ku油體蛋白基因在油菜和棉花種子中驅動外源基因的表達[3]。本試驗從油菜基因組DNA中克隆油菜20 ku油體蛋白基因上游903 bp的調控序列NOP，構建植物表達載體并轉化油葵，經檢測，該啟動子能驅動GUS基因在油葵種子中的特異表達。這為油葵植物生物反應器的構建提供了優良的備選啟動子資源，同時也為油葵的油脂基因工程改良提供了候選啟動子。

1材料與方法

1.1試驗材料、菌株與質粒

植物材料為“精選”油葵品種的恢復系，由河北華豐種業開發有限公司惠贈。雙元表達載體pBI121：GUS，由pCAMBIA1301中的GUS基因替換pBI121中的GUS基因，河北化工醫藥職業技術學院實驗室構建保存；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態細胞，購自博邁德生物科技有限公司；限制性內切酶、連接酶，購自寶生物工程（大連）有限公司；KOD-plus，購自東洋紡（上海）生物科技有限公司；Taq DNA聚合酶，購自鼎國生物技術公司。瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒提取試劑盒，購自天根生物科技（北京）有限公司；卡那霉素 （kanamycin），購自Roche公司。

1.2油菜基因組的提取

采用SDS法[6]提取油菜基因組。

1.3PCR擴增和植物表達載體pNOP：GUS的構建

依據GenBank發表的油菜20 ku油體蛋白基因啟動子（序列號：AF134411）設計上下游引物，引物為：NOP F：5′-CCCAAGCTTTTCAACGTGGTCGGATCATGACG-3′；NOP R：5′-CGC-GGATCCGAATTGAGAGAGATCGAAGAG-3′（下劃線為酶切位點）；在上下游引物上分別引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位點，以油菜品種青油14的基因組DNA為模板，擴增油菜油體蛋白基因啟動子；PCR擴增產物經限制性內切酶HindⅢ和BamHⅠ酶處理，插入pBI121：GUS的HindⅢ位點和BamHⅠ位點之間，獲得植物表達載體pNOP：GUS；對2個陽性克隆由上海生物工程技術有限公司進行測序驗證。

1.4油葵的轉化

參照劉芳等的方法[7]，采用花粉管通道法轉化精選油葵恢復系。

1.5轉基因油葵的PCR檢測與組織化學分析

以SDS 法小量提取轉基因油葵T1代幼苗基因組DNA為模板，NOP F、NOP R為引物進行PCR 檢測，鑒定獲得轉化植株；依據Rueb等的方法[8]，對轉化植株的根、莖、葉、種子進行GUS檢測，以驗證NOP啟動子的功能。

2結果與分析

2.1啟動子片段的克隆、植物表達載體pNOP：GUS的構建及啟動子序列分析

試驗結果表明，以油菜青油14品種基因組DNA為模板進行PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳檢測發現，擴展產物有1條約0.9 kb的擴增條帶，將該片段插入pBI121：GUS的HindⅢ和BamHⅠ位點之間，可獲得植物表達載體pNOP：GUS，經HindⅢ和BamHⅠ雙酶切鑒定，獲得預期大小0.9 kb的目的片段（圖1），這說明該植物表達載體構建正確。將NOP 核苷酸序列在NCBI中運用Blast進行比對，結果顯示，NOP與油菜油體蛋白基因的啟動子序列同源性為95%，這說明NOP是油菜20 ku油體蛋白基因的啟動子。NOP 核苷酸序列經Place數據庫查詢分析，結果表明，此序列包含TATA-box，可能序列為ATATAT，位于817～822位，主要功能是保證轉錄得以精確起始；包含ABRES元件，可能序列為ACACGTGGC，位于758～766位，在生長組織中介導脫落酸（ABA） 應答，是種子成熟階段不可缺少的順式調控元件之一；含有1個G-box，可能序列為TGACGTGG，位于536～543位，這在種子特異性啟動子中普遍存在，高度保守，是光調控的應答元件，對種子特異基因的表達在時間和空間上起到重要的順式調節作用，發生突變的種子特異性啟動子將喪失大部分活性[9]；包含2個CAAT-box，可能序列為CAAAT，位于669～673、359～363 位，存在比較廣泛，與基因表達的種子特異性和活性相關，主要起數量調節作用[10-11]；包含1個I-box，序列為TTTCAAA，位于666～672位。

2.2轉基因油葵的獲得

經花粉管通道法轉化精選油葵恢復系，將收獲的種子進行種植，每株取幼嫩真葉提取基因組，PCR檢測，結果表明，擴增產物得到約0.9 kb的特異條帶，與以pNOP：GUS為模板的陽性對照擴增結果一致，這初步說明目的片段已整合到油葵基因組DNA中。

2.3轉基因油葵的GUS檢測

為驗證所克隆啟動子的功能，取轉基因油葵植株不同部位的組織進行GUS檢測，結果表明，啟動子驅動下的基因不能在油葵根、莖和葉中表達，只能在油葵種子中表達（圖2）。這說明油菜油體蛋白基因啟動子可以驅動外源基因在油葵種子中特異表達。

3結論與討論

油菜籽粒含油量高，20 ku油體蛋白是24 ku油體蛋白含量的10倍，因此，20 ku油體蛋白基因的啟動子被推測是一個較強的種子特異性啟動子，朱亞蘭等克隆了該基因并構建了植物表達載體[12]。本試驗從青油14中克隆了油菜油體蛋白啟動子，包含基因表達的重要特征元件及TATA-box、ABRES、G-box、I-box、CAAT-box等種子特異表達所必需的核苷酸序列，與GenBank中序列號為AF134411的油菜 20 ku 油體蛋白基因啟動子同源性為95%，與劉昱輝等克隆到的油菜油體蛋白基因啟動子[13]同源性為100%。在此基礎上，構建油菜油體蛋白啟動子與GUS基因融合表達載體，轉化油葵，經組織化學染色，結果表明，該啟動子可以驅動GUS基因在油葵種子中的特異表達，這為油葵利用轉基因技術構建生物反應器和油脂基因工程改良奠定了基礎。

本研究選用花粉管通道法轉化油葵，該方法有效地利用了自然生殖過程，可直接得到轉化種子，無需進行繁瑣的組織培養。但是，花粉管通道法也有缺點，由于將基因導入受體基因組會引起性狀的大量分離，需要經過多代的自交純化，才能得到目標性狀穩定的純合后代[14]。本試驗主要目的是為研究油菜油體蛋白基因啟動子能否驅動外源基因在油葵種子中的特異性表達，采用花粉管通道轉化是一種較快較好的選擇，且也獲得了比較理想的試驗結果。

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