千里光脂肪酸脫氫酶（D6D）的保守基序（CSM）與功能結構域分析

王蕾++羅才林++徐德林+錢剛

摘要：Δ6-脂肪酸脫氫酶（Δ6 desaturase，D6D）是不飽和脂肪酸合成途徑中的限速酶。以高等植物千里光為材料，通過構建全長cDNA文庫克隆得到脂肪酸脫氫酶基因（D6D），明確了D6D基因的氨基酸保守基元序列（conserved sequence motif，CSM）對蛋白質功能結構域的決定作用。結果顯示，千里光D6D基因由466個氨基酸殘基組成；預測蛋白分子量為53.40 ku，理論等電點為8.48；進化樹和序列比對結果提示3個富含His的保守基元序列（HisⅠ-片段、HisⅡ-片段、HisⅢ-片段）在不同物種中表現出高度保守性；三維結構預測結果表明，D6D基因的保守結構域以及一個類似于細胞色素（cytochrome，cyt）b5的血紅素結合區是形成底物結合部位和酶催化活性中心的結構基礎。

關鍵詞：千里光；脂肪酸脫氫酶（D6D基因）；保守基元序列（CSM）；三維結構

中圖分類號： S567.23+9.01文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0073-05

收稿日期：2015-11-03

基金項目：國家自然科學基金（31560087）；貴州省優秀科技教育人才省長基金（編號：黔省專合字2008-61號）。

作者簡介：王蕾（1991—），女，黑龍江五大連池人，碩士研究生，主要從事藥用植物分子遺傳學研究。E-mail：1807840035@qq.com。

通信作者：錢剛，博士，教授，主要從事藥用植物分子遺傳學研究。E-mail：pengjiaqiong@163.com。脂肪酸脫氫酶是多不飽和脂肪酸合成途徑中的關鍵酶，分為可溶性脫氫酶和膜結合脫氫酶，其中膜結合脫氫酶又可分為羧基定向的脂肪酸脫氫酶（“frond-end”脫氫酶）和甲基定向的脂肪酸脫氫酶[1]。脂肪酸脫氫酶結構上都有3個保守的組氨酸富集區，除此之外羧基定向的脫氫酶N端還有1個類似于細胞色素b5 Cytb5的血紅素結合區（HPGG）[2-3]。

Δ6-脂肪酸脫氫酶（D6D）屬于羧基定向的膜結合脫氫酶，它以NADH、細胞色素b5氧化還原酶和細胞色素b5作為電子供體催化甘油脂中的脂肪酸脫氫[4]。Δ6-脂肪酸脫氫酶具有催化亞油酸、α-亞麻酸分別脫氫形成γ亞麻酸和十八碳四烯酸的功能[5]。

千里光（Senecio scandens Buch.-Ham. ex D. DO）為菊科（Compositae），屬多年生草本植物，它是中國傳統中藥之一，具有清熱解毒、明目、殺蟲、保肝、涼血、驅風除濕、抗菌、抗鉤端螺旋體等諸多功效[6-7]。迄今為止，已經從藍細菌[8]、黑茶藨子[9]、深黃被孢菌[10]、高山被孢菌[11]、月見草[12]、假狼紫草[13]、雅致枝霉[14]、卷枝毛霉[15]、少根根霉[16]中克隆到Δ6-脂肪酸脫氫酶。盡管Δ6-脂肪酸脫氫酶基因在微生物和植物等不同物種中已有報道[1]，目前，關于D6D基因高級結構和功能關系的研究尚少，該基因在菊科植物的相關研究也未見報道。本研究率先開展藥用植物千里光Δ6-脂肪酸脫氫酶基因的功能研究，分析了該蛋白理化性質和保守基序對功能結構域的決定作用，為深入了解高等植物多不飽和脂肪酸（PUFAs）合成的次生代謝途徑和蛋白質組學研究提供依據。

1材料與方法

1.1材料

試驗材料千里光資源（SC-36）系筆者所在課題組采自貴州省遵義地區野生種。

1.2方法

1.2.1千里光全長cDNA 文庫的構建按照RNA提取試劑盒說明提取千里光葉片組織的總RNA，采用SMART方法構建了千里光的全長cDNA文庫[17]，隨機挑選陽性克隆進行測序（華大基因）。

1.2.2D6D基因生物信息學的分析依據測序結果，通過NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）的BLAST進行核苷酸序列比對，并利用ORF finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析開放閱讀框；采用Expasy ProtParam程序（http：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白質的分子量、等電點和氨基酸組成；使用MEGA 5.0軟件鄰接法（Neighbor-Joining）構建系統發生樹；依據軟件DNAMAN進行多物種氨基酸序列比對并確定蛋白質保守結構域；使用在線工具SOPM（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopm.html）對千里光D6D基因進行二級結構分析；通過NCBI 數據庫GenBank和Conserved domains分析蛋白質保守結構域；將氨基酸序列信息提交（European Bioinformatics Institute（http：//www.isb-sib.ch），采用同源模型服務軟件SWISS-MODEL構建D6D基因的3-D結構[17]，根據最小疊合法利用Swiss-Pdb Viewer軟件對3-D結構進行修正和疊合[18]。

2結果與分析

2.1千里光D6D基因的理化性質

從表1可以看出，該千里光D6D基因的分子量為 53.40 ku，理論等電點pI為8.48，不穩定系數為42.98，表明該千里光D6D基因狀態不穩定；脂溶指數為90.58；平均疏水指數為 0.078。該千里光D6D基因由20種氨基酸組成，亮氨酸含量較高，為12.0%，不含脯氨酸和硒半胱氨酸；原子組成為C2462H3694N640O64S25。

2.2D6D基因系統進化分析

利用MEGA 5.0軟件，選擇NJ法構建系統進化樹（圖1）。

結果表明，D6D基因與鉤柱花草（XP_003588984.1）、苜蓿（ABU98945.1）處于同一進化分支上，表明它與二者親緣關系較近；與月見草（ACB47482.1）、野生大豆（KHN01208.1）親緣關系較遠。

2.3D6D基因的保守基序分析

根據D6D基因遺傳進化樹，選擇包含千里光在內的5個親緣關系差異最大的物種進行序列比對。序列比對結果顯示，這5個親緣關系差異最顯著的物種表現出高度同源性，同源性為76.31%。序列比對結果發現，3個富含組氨酸的保守基元序列HisⅠ-片段、HisⅡ-片段、HisⅢ-片段和N端的1個類似于細胞色素b5（Cytb5）的血紅素結合區（HPGG）在不同物種中表現出高度保守性（圖2）。

2.4D6D基因二級結構分析

使用在線工具SPOM分別對這5個物種的D6D基因進行二級結構分析，結果表明，D6D基因的二級結構主要由α-螺旋、β-轉角、線性結構和自由卷曲等4種基本結構組成（表2），其中不同物種的二級結構組成比例都十分相近，例如α-螺旋的比例最高，自由卷曲的組成比例次之，β-轉角的含量最低。

結果表明，酶脫氫所共有的3個組氨酸保守區，分別在氨基酸序列的172～176、209～213、395～402處。結合D6D基因保守基序形成的二級結構，結果發現，即使在親緣關系相距最遠的5個物種中，無論是保守基序還是非保守基序所形成的二級結構都非常相近（圖3）。

2.5D6D基因的保守結構域與三維結構比對分析

利用Blast搜索高等植物脂肪酸脫氫酶功能結構域，結果表明，D6D是羧基定向的脂肪酸脫氫酶，它包含3個組氨酸保守結構域，分別為HXXXH、HXX（X）HH、H/QXX（X）HH，其N端存在類似于細胞色素b5（Cytb5）的血紅素結合區（HPGG） （圖2），這也在D6D結構域預測圖中得到進一步證明（圖4）。三維結構結果表明，包括千里光在內的5個遺傳差異最為顯著的物種中，D6D基因具有高度相似的三維結構。如圖5所示，在3-D結構中，D6D基因結構成分以α-螺旋和自由卷曲為主；3個組氨酸保守區以及類似于細胞色素b5（Cytb5）的血紅素結合區（HPGG）是形成底物結合部位和酶催化活性中心的結構基礎。

3結論與討論

1993年，Reddy等首先從1株產6，9，12-十八碳三稀酸的藍細菌（Synechocystis sp. PCC6803）中克隆得到Δ6-脂肪酸脫氫酶基因，并在Δ6-脂肪酸脫氫酶缺陷的藍細菌（Anabaena sp. PCC7120）中得到功能性表達[8]。這一科研成果為后續脂肪酸脫氫酶的深入研究奠定了基礎。目前，通過 cDNA 文庫篩選、cDNA文庫隨機測序和cDNA末端擴增技術（RACE）等多種方法已經從動植物和真菌等不同生物中克隆到Δ6-脂肪酸脫氫酶基因[19]。本研究是基于提取并且純化千里光葉片mRNA構建的全長cDNA文庫[20]，表明D6D基因合成中產物對高等植物千里光有重要作用。目前，可以推測D6D是決定千里光合成多不飽和脂肪酸的關鍵基因之一。但由于大部分高等植物不能合成Δ6位脫氫的脂肪酸，所以D6D基因在高等植物中的具體作用機制還有待于進一步研究。

研究證實，用蛋白質氨基酸序列所構建的遺傳進化樹分支不僅可以反映物種間的親緣關系，還可以作為蛋白功能相關性評價的依據，這是因為植物在長期適應環境的進化過程中，執行相關生理功能的基因因其重要的保護作用會表現得相對保守[21-22]。本研究構建了D6D基因的遺傳進化樹，選擇了與千里光親緣關系差異較大的4個物種進行結構與功能分析，發現其基元序列變異性較高，說明在代謝過程中可以有其他代謝途徑將D6D基因替代，同時，這種較高的變異性也可以加速物種的進化，說明并不是所有生物體內都必須含有D6D基因。

為準確分析基元序列特征，本研究選擇與高等植物千里光親緣關系差異最為顯著的4個物種，由此可見，該保守基序是構成羧基定向的膜結合脫氫酶功能域的基本結構單位，通過保守結構域的分析也證實了這一點。氨基酸序列分析發現D6D的N端和C端部分缺乏明顯的同源性，但中部序列相對保守，含有3個極度保守的組氨酸富集區。Fox等提出，這3個保守區可能參與酶活性中心位點的形成，這一點已經在二價鐵酶中得到驗證[23]。D6D基因除了有這3個組氨酸富集區以外，在其N末端的1個類似Cytb5的亞鐵血紅素結合區，刪除這段特殊序列區，或者對關鍵氨基酸位點進行突變，都會導致酶功能的紊亂[24]，同時根據其基元序列，發現D6D基因的保守基序以及HPGG血紅素結合區氨基酸片段高度保守，進一步證實D6D基因底物結合部位和酶催化活性中心的結構基礎是3個組氨酸保守結構域和1個類似于細胞色素b5的結構域。除此之外，Δ6-脂肪酸脫氫酶還有2個特殊的組氨酸H53和H76，它們在Δ6-脂肪酸脫氫酶中的位置和血紅素上的2個組氨酸在細胞色素中位置一致；推斷這2個組氨酸與血紅素的穩定性有關；對His53HPGG56序列進行預測，發現脂肪酸脫氫酶存在β-折疊，這樣可以使His53更容易結合于血紅素上而發揮Δ6-脂肪酸脫氫酶的活性[20]，證明其三維結構中存在β-折疊的重要性。本研究為進一步闡明蛋白質結構和功能相關性，依據氨基酸的保守序列對結構蛋白和功能蛋白進行3-D同源建模[25-26]。研究發現，D6D基因保守結構域是以α-螺旋和β-轉角相互作用形成的獨立結構，進一步折疊形成蛋白質的三級結構[27]，是脂肪酸脫氫酶底物結合位點和催化位點功能域的基本單位；千里光D6D基因所形成的高級結構相對較松散，表明D6D基因在形成四級結構的過程中，須要結合更大官能團的輔酶或輔基，抑或可為輔酶或輔基提供多個結合位點；意味著高等植物D6D基因在催化多不飽和脂肪酸的反應過程中，有利于結合并且轉運較大基團的反應底物。

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