利用正交試驗(yàn)法優(yōu)化團(tuán)花不定芽分化培養(yǎng)基

黃浩++蒙愛(ài)東

摘要：為了獲得團(tuán)花不定芽分化的最佳激素組合和外植體類(lèi)型，以團(tuán)花20～30 d無(wú)菌苗的子葉、下胚軸和真葉為外植體材料，采用L9（34）正交試驗(yàn)表，2，4-D、2-iP、6-BA為正交試驗(yàn)的3因素，進(jìn)行直接誘導(dǎo)不定芽分化試驗(yàn)。結(jié)果表明，以真葉為外植體，不定芽分化率最高，為73.3%，激素組合為MS+0.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 2-iP+1.5 mg/L 6-BA；下胚軸的不定芽分化率次之，最高為66.6%；子葉的不定芽分化率最低，最高值僅為40.0%。試驗(yàn)結(jié)果可為工廠(chǎng)化生產(chǎn)優(yōu)良團(tuán)花種苗，并可為團(tuán)花遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：團(tuán)花；組織培養(yǎng)；正交試驗(yàn)；不定芽

中圖分類(lèi)號(hào)： Q813.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）06-0078-03

收稿日期：2015-05-18

基金項(xiàng)目：廣西醫(yī)療衛(wèi)生重點(diǎn)科研課題（編號(hào)：重200907）。

作者簡(jiǎn)介：黃浩（1972—），男，廣西柳州人，助理研究員，主要從事藥用植物育種和栽培研究。E-mail：hmouse@163.com。

通信作者：蒙愛(ài)東，教授，從事藥用植物育種和組織培養(yǎng)。E-mail：mengaidong@126.com。團(tuán)花[Neolamarckia cadamba（Roxb.）Bosser]為茜草科（Rubiaceae）團(tuán)花屬（Neolamarckia Bosser）植物，為亞洲熱帶十分罕見(jiàn)的闊葉速生樹(shù)種。由于團(tuán)花生長(zhǎng)迅速，樹(shù)干通直，因而被譽(yù)為“奇跡樹(shù)”，早在20世紀(jì)70年代就受?chē)?guó)內(nèi)外普遍關(guān)注。其木材淡黃色，紋理通直，不易開(kāi)裂和變形，是較好的家具、建筑裝飾等用材。早在印度古醫(yī)“阿優(yōu)吠陀”經(jīng)中，就有用樹(shù)皮治療疾病的記載；樹(shù)皮含有豐富的生物堿類(lèi)，其中 3α-二氫卡丹賓和3β-二氫卡丹賓為治療高血壓藥物“鉤藤總堿”的有效成分，具有強(qiáng)而持久的降壓作用，其效價(jià)已經(jīng)接近利血平[1]。樹(shù)葉含較高蛋白質(zhì)，可作動(dòng)物飼料；花是良好的蜜源。因用途廣泛而具有較高開(kāi)發(fā)價(jià)值和較大應(yīng)用前景[2-4]。

團(tuán)花在中國(guó)僅有1種[5]，主要分布于廣東、廣西、云南海拔50～1 100 m的山谷溪旁或雜木林下；在云南省海拔 1 080 m 以下的亞熱帶地區(qū)有集中分布[5-6]，喜溫不耐寒。國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要開(kāi)展團(tuán)花的樹(shù)皮藥用成分[1，7-11]、引種和栽培[12-18]生物技術(shù)[19-21]研究，并取得較好的進(jìn)展。盡管利用大田苗頂芽或側(cè)芽通過(guò)以芽繁芽的組織培養(yǎng)方式[22-23]進(jìn)行團(tuán)花植株再生研究已獲得一定的成效，由于僅作為繁殖優(yōu)良植株的目的，無(wú)法利用該不再生體系進(jìn)行進(jìn)一步的分子試驗(yàn)如遺傳轉(zhuǎn)化研究。本試驗(yàn)擬利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過(guò)器官直接分化方式對(duì)團(tuán)花3種不同外植體進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)研究，以期優(yōu)化出較好的外植體和激素組合。本試驗(yàn)不僅可快速獲得大量健壯不定芽，也可為團(tuán)花遺傳轉(zhuǎn)化特別是轉(zhuǎn)抗寒或其他抗性基因的研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料和試劑

成熟、飽滿(mǎn)的團(tuán)花種子，采自廣西藥用植物園本草綱目園。經(jīng)洗凈晾干后于低溫種子柜保存。

NaClO溶液500 mL塑料瓶包裝，天津市津宇精細(xì)化工有限公司生產(chǎn)；滅菌工作溶液配制：將50 mL NaClO原液加入到950 mL無(wú)菌水中搖勻；2，4-D、2-iP、6-BA、瓊脂、蔗糖購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2方法

1.2.1浸種和無(wú)菌幼苗的獲得用小袋包好種子，放入裝有約100 mL無(wú)菌水的250 mL玻璃組培瓶中，在37 ℃恒溫振蕩箱振蕩浸泡24 h。在無(wú)菌超凈臺(tái)上，將包著種子的小袋浸于NaClO工作溶液中滅菌15 min，再用無(wú)菌水徹底沖洗5次，最后將種子播于不含任何激素的MS培養(yǎng)基中（培養(yǎng)室溫度為（25±2）℃，誘導(dǎo)不定芽分化時(shí)前30 d采用暗培養(yǎng)，之后進(jìn)行光培養(yǎng)（光周期為14 h），人工光照強(qiáng)度2 000 lx。）20～30 d后，即可得到含1對(duì)子葉和第1對(duì)真葉、高度為5～10 mm的無(wú)菌苗。

1.2.2外植體的獲得外植體分別為無(wú)菌苗子葉、真葉、下胚軸。在無(wú)菌超凈臺(tái)中，子葉、真葉（均含葉柄）可用鑷子從上述無(wú)菌幼苗小心剝下，不含子葉節(jié)的下胚軸直接用解剖刀切取。每種外植體均按L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行單獨(dú)的正交試驗(yàn)。

1.2.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用L9（34）正交表，將培養(yǎng)基中的3個(gè)激素2，4-D、2-iP、6-BA設(shè)為正交試驗(yàn)的3因素，每因素設(shè)3水平，為避免在試驗(yàn)過(guò)程中人為因素導(dǎo)致的系統(tǒng)誤差，因素水平數(shù)（激素濃度）在試驗(yàn)表中不完全按數(shù)值大小遞增或遞減順序排列，而按隨機(jī)化方法排列，空列作為方差分析的誤差列[24]。試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 2。

1.2.4培養(yǎng)基培養(yǎng)基均以MS作為基本培養(yǎng)基，添加瓊脂6 g/L，蔗糖30 g/L，添加激素后調(diào)整pH值內(nèi)5.8，然后在 0.1 MPa、121 ℃高溫滅菌20 min，自然冷卻凝固，放置1 d后使用。

1.3統(tǒng)計(jì)與數(shù)據(jù)處理

外植體接種后40 d，統(tǒng)計(jì)不定芽分化率，同時(shí)觀(guān)察不定芽的生長(zhǎng)情況。采用直觀(guān)分析和方差分析法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。每種外植體重復(fù)3次，每次15個(gè)外植體，分化率為3次重復(fù)的平均值。

不定芽分化率=（長(zhǎng)出不定芽的外植體個(gè)數(shù)/外植體總數(shù)）×100%。

數(shù)據(jù)處理和作圖用Excel 2007完成。

2結(jié)果與分析

2.1不定芽分化率和直觀(guān)分析

不同外植體的不定芽分化率結(jié)果見(jiàn)表 2。從極差項(xiàng)的結(jié)果可看出，在3個(gè)不同的外植體中，生長(zhǎng)素2，4-D極差項(xiàng)均為最大值，表明2，4-D對(duì)3個(gè)外植體的不定芽分化影響最大。影響子葉直接分化不定芽的主次因素依次為2，4-D、2-iP（或6-BA）、6-BA（或2-iP），最優(yōu)激素組合為0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 2-iP+1.5 mg/L 6-BA，與試驗(yàn)號(hào)4吻合，子葉的不定芽分化率最高達(dá)40%。影響下胚軸直接分化不定芽的主次因素依次為2，4-D、2-iP、6-BA，最優(yōu)激素組合為0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 2-iP+2.0 mg/L 6-BA，與試驗(yàn)號(hào)1吻合，下胚軸的不定芽分化率最高達(dá)40%。影響真葉直接分化不定芽的主次因素依次為2，4-D、6-BA、2-iP，最優(yōu)激素組合應(yīng)為0.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 2-iP+1.5 mg/L 6-BA，沒(méi)有試驗(yàn)號(hào)與其吻合。

2.2不同激素誘導(dǎo)不定芽分化率比較

2.2.1不同激素誘導(dǎo)子葉不定芽分化率不同激素誘導(dǎo)子葉不定芽分化率見(jiàn)圖1。隨著2，4-D、2-iP、6-BA濃度升高，子葉誘導(dǎo)不定芽分化率均出現(xiàn)先增大后下降的趨勢(shì)，當(dāng)2，4-D濃度為0.5 mg/L，2-iP濃度為0.5 mg/L，6-BA濃度為1.5 mg/L時(shí)，不定芽分化的效果最佳。

2.2.2不同激素誘導(dǎo)下胚軸不定芽分化率不同激素誘導(dǎo)下胚軸不定芽分化率見(jiàn)圖2，隨著2，4-D、2-iP、6-BA濃度升高，下胚軸誘導(dǎo)不定芽分化率變化較大。當(dāng)2，4-D濃度為0 mg/L，2-iP濃度為0.5 mg/L，6-BA濃度為2.0 mg/L時(shí)，不定芽分化效果最佳。此外，不定芽分化率有隨6-BA濃度升高而提高的趨勢(shì)，適當(dāng)提高6-BA的濃度，有可能會(huì)得到更優(yōu)的誘導(dǎo)不定芽分化組合。

2.2.3不同激素引導(dǎo)真葉不定芽分化率不同激素引導(dǎo)真葉不定芽分化率見(jiàn)圖3，當(dāng)2，4-D濃度為0.5 mg/L，2-iP濃度為1.0 mg/L，6-BA濃度為1.5 mg/L時(shí)，不定芽分化的效果最佳。不定芽分化率有隨2-iP濃度升高而提高的趨勢(shì)，

適當(dāng)再提高2-iP的濃度，有可能會(huì)得到真葉誘導(dǎo)不定芽分化的更優(yōu)方案。與下胚軸誘導(dǎo)不定芽分化率隨6-BA濃度的升高而提高的趨勢(shì)不同。

2.3方差分析

方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

從表3看出，除了2，4-D對(duì)子葉誘導(dǎo)不定芽分化具有顯著影響外，2，4-D對(duì)其他2個(gè)外植體的不定芽誘導(dǎo)無(wú)顯著影響；2-iP、6-BA對(duì)3種外植體不定芽誘導(dǎo)均無(wú)顯著影響。

3討論與結(jié)論

從試驗(yàn)的總體結(jié)果來(lái)看，子葉誘導(dǎo)不定芽分化率較低；從試驗(yàn)號(hào)1到試驗(yàn)號(hào)6，下胚軸誘導(dǎo)分化率最低為33%，最高為66.7%，誘導(dǎo)分化的總體狀況較好；而真葉除了在試驗(yàn)號(hào)4和試驗(yàn)號(hào)6的誘導(dǎo)分化率較高外，其余試驗(yàn)均低于30%。另外，無(wú)論是從子葉、下胚軸還是真葉誘導(dǎo)分化出來(lái)的不定芽，生長(zhǎng)均較健壯，生長(zhǎng)狀況無(wú)明顯差異（圖4）。

不同外植體的最佳不定芽分化率并不出現(xiàn)在同一個(gè)激素組合（即同一個(gè)試驗(yàn)號(hào)），可能是不同外植體組織（或細(xì)胞）在相同生長(zhǎng)時(shí)期具不同生長(zhǎng)特性，導(dǎo)致對(duì)相同激素組合的響應(yīng)不同。

當(dāng)2，4-D濃度為 0 mg/L 時(shí)，下胚軸的不定芽分化率較好；當(dāng)2，4-D濃度為0.5 mg/L時(shí)，子葉和真葉的不定芽分化率較好；當(dāng)2，4-D濃度為1.5 mg/L時(shí)，不論2-iP、6-BA濃度如何變化，3個(gè)不同外植體不定芽分化的誘導(dǎo)率均很低，可能是高濃度2，4-D對(duì)這些幼嫩的外植體產(chǎn)生一定的傷害，導(dǎo)致組織或細(xì)胞較難直接分化甚至死亡；而2-iP、6-BA對(duì)不定芽分化率影響不如2，4-D的變化顯著。

在誘導(dǎo)真葉直接分化試驗(yàn)中，從直觀(guān)分析和趨勢(shì)中均可看出，最好的激素組合應(yīng)為0.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 2-iP+1.5 mg/L 6-BA，理論上應(yīng)比試驗(yàn)號(hào)6的分化率（即最大值73.3%）高，但此激素組合并不在本試驗(yàn)的激素組合中。在下一步試驗(yàn)中可對(duì)主要因素（主要是2，4-D）的水平作適當(dāng)調(diào)整，選取更優(yōu)水平，以期獲得更高的誘導(dǎo)分化率。

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，為獲得質(zhì)量較好的不定芽，可用MS+0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 2-iP+2.0 mg/L 6-BA作為下胚軸的誘導(dǎo)培養(yǎng)基；或用MS+0.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 2-iP+1.5 mg/L 6-BA作為真葉的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。這2種方法均可通過(guò)直接分化的方式獲得健壯的不定芽，避免通過(guò)愈傷組組再分化的途徑獲取再生芽而產(chǎn)生的變異苗的可能；在獲得不定芽后，按鄧小梅等的方法[22-23]選取健壯的芽，進(jìn)行擴(kuò)繁、生根和移栽，即可獲得再生小苗。移栽1年后，經(jīng)與初生種子苗對(duì)比，在生長(zhǎng)性狀上無(wú)明顯差異。通過(guò)直接分化獲得不定芽，在很大程度上減少了培養(yǎng)周期、人力和物力，也為進(jìn)一步進(jìn)行團(tuán)花遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]鐘紀(jì)育，王文端. 卡丹賓——團(tuán)花莖皮的主要生物堿[J]. 云南植物研究，1985，7（3）：359-360.

[2]林協(xié). 速生樹(shù)木——團(tuán)花[J]. 浙江林業(yè)科技，1974（2）：9.

[3]祁承經(jīng)，湯庚國(guó). 樹(shù)木學(xué)[M]. 北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2005：521.

[4]鐘紀(jì)育，王文端，張壯鑫，等. 團(tuán)花樹(shù)皮的化學(xué)成分[J]. 云南植物研究，1990，12（4）：453-456.

[5]中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志：第71卷第1分冊(cè)被子植物門(mén)雙子葉植物綱茜草科（一）[M]. 北京：科學(xué)出版社，1999.

[6]楊正杰. 淺談團(tuán)花育苗及造林技術(shù)[J]. 云南林業(yè)，1984（1）：20.

[7]劉玲麗，朱鋒，邸迎彤，等. 團(tuán)花樹(shù)中一個(gè)新的環(huán)烯醚萜苷[J]. 云南植物研究，2010，32（4）：378-380.

[8]張雪. 銹毛千斤拔根及團(tuán)花樹(shù)皮化學(xué)成分研究[D]. 西雙版納：中國(guó)科學(xué)院研究生院，西雙版納熱帶植物園，2008.

[9]韋宏. 團(tuán)花樹(shù)皮的吲哚生物堿成分[J]. 廣西科學(xué)院學(xué)報(bào)，1999，15（2）：52-55.

[10]陳耀武，鄧萬(wàn)華，沈鎮(zhèn)德，等. 團(tuán)花（Anthocephalus chinensis）種子和果實(shí)中抑制物質(zhì)的研究[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，1985，11（1）：93-100.

[11]趙瑤金. 印度團(tuán)花（Anthocephalus indicus Rioh.）樹(shù)皮的化學(xué)研究 第2部分生物堿類(lèi)成分[J]. 南藥譯叢，1962（1）：19.

[12]耿云芬，邱瓊，楊德軍. 團(tuán)花容器苗的育苗期施肥試驗(yàn)[J]. 西部林業(yè)科學(xué)，2010，39（1）：73-76.

[13]蘇光榮，易國(guó)南，楊清. 團(tuán)花生長(zhǎng)特性研究[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，22（5）：49-52.

[14]李秀全. 團(tuán)花在平和縣引種試驗(yàn)研究初報(bào)[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007，13（7）：103-104.

[15]陶永強(qiáng). 團(tuán)花育苗及造林技術(shù)[J]. 云南林業(yè)，2005，26（4）：25-26.

[16]楊德軍，邱瓊，王達(dá)明，等. 團(tuán)花育苗技術(shù)研究[J]. 廣西林業(yè)科學(xué)，2004，33（2）：93-95，101.

[17]任盤(pán)宇，鄒壽青. 熱帶速生樹(shù)種團(tuán)花的造林技術(shù)[J]. 林業(yè)實(shí)用技術(shù)，2004（6）：6-8.

[18]鄒壽青. 團(tuán)花北移試種情況調(diào)查報(bào)告[J]. 熱帶植物研究，1977（11）：26-35.

[19]歐陽(yáng)昆唏. 黃梁木α擴(kuò)展蛋白的基因克隆及功能研究[D]. 北京：北京林業(yè)大學(xué)，2013：133.

[20]馬圣俊. 團(tuán)花樹(shù)形成層X(jué)ET基因的克隆及功能初步分析[D]. 北京：北京林業(yè)大學(xué)，2010.

[21]李偉，李娜，陳曉陽(yáng). 團(tuán)花樹(shù)木葡聚糖轉(zhuǎn)葡糖苷酶cDNA克隆及序列分析[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，32（5）：45-49.

[22]鄧小梅，詹艷玲，張倩，等. 黃梁木組培快繁技術(shù)研究[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，33（2）：216-219，224.

[23]林碧珍，張樹(shù)河，林加耕. 團(tuán)花樹(shù)組培快繁技術(shù)研究[J]. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)，2009（3）：46-47.

[24]李云雁，胡傳榮. 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：257.