基于SSR的鐵皮石斛實生群體遺傳多樣性研究

韓曉霞++章靜鋼++張鵬博++宗宇++陳文榮++郭衛東

摘要：鐵皮石斛屬于傳統名貴中藥，由于人們的過度采挖，其野生資源日益減少，遺傳多樣性遭到嚴重破壞，人工栽培是對石斛資源進行保護的有效措施之一。本研究采用15對SSR引物對5個實生群體的100株鐵皮石斛進行了遺傳多樣性分析，以期檢測群體之間和群體內部的遺傳分化，確定純化株系，為后期優良品種選育提供理論參考。結果表明，15個位點共檢測到185個等位基因，群體B6的等位基因數目最大，為7.14個；群體B11等位基因數最少，為 5.42個；觀察雜合度（Ho）最大的種群為B6（0.376），群體B10最小（0.286）。近交系數（Fis）最大值出現在群體B10中，為0.241；群體B6近交指數最小，僅為0.091。STRUCTURE遺傳結構分析發現5個石斛實生群體可能來自2個同源基因庫。實生群體B10遺傳背景單一，可以用于后續的鐵皮石斛純化育種，群體B6具有較高的雜合度，可以用作種間雜交的良好材料，有利于種間差異性狀的整合。

關鍵詞：鐵皮石斛；SSR；實生群體；遺傳多樣性

中圖分類號： S567.23+9.03文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0090-04

收稿日期：2015-05-02

基金項目：浙江省金華市科學技術局農業類重點項目（編號：2012-2-018）。

作者簡介：韓曉霞（1993—），女，山西朔州人，碩士研究生，主要從事特色經濟植物研究。E-mail：15268636679@163.com。

通信作者：宗宇，博士，講師，研究方向為植物種質資源與遺傳。E-mail：yzong@zjnu.cn。鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是蘭科（Orchidaceae）石斛屬植物，屬于傳統名貴中藥，由于人們的過度采挖，鐵皮石斛野生資源日益減少，已近枯竭，遺傳多樣性遭到嚴重破壞。1987年鐵皮石斛因數量銳減，被列入《國家重點保護野生藥材物種名錄》[1-2]。鐵皮石斛的人工栽培是對石斛資源進行保護的有效措施之一，雖然近幾年人工栽培鐵皮石斛取得了較大的進展，但由于種質混雜、盲目引種等原因，致使鐵皮石斛質量和產量差異較大，擾亂了消費市場，阻礙鐵皮石斛產業的正常、有序發展[3-8]。因此，開展鐵皮石斛種質資源和遺傳多樣性研究，對鐵皮石斛優良品種的選育具有重要意義。

遺傳多樣性是生物多樣性的基本組成元素，豐富的遺傳多樣性可以維持種群動態平衡，為物種的進化提供基本保障；評價一個物種的遺傳多樣性也是制定該物種科學保護策略的重要前提。前人在鐵皮石斛遺傳多樣性研究方面取得了一定進展，沈潔等利用RAMP標記對9個野生居群的112株鐵皮石斛進行了檢測，結果表明，不同居群間存在豐富的遺傳多樣性，而且居群之間存在一定地域相關性[9]。丁鴿等采用RAPD技術對8個鐵皮石斛野生居群的遺傳多樣性和親緣關系進行研究，發現引物S412可以有效鑒別8個野生居群；同樣發現居群的地理分布與居群間的遺傳關系呈現良好的正相關性[10]。Li等利用AFLP標記對12個鐵皮石斛居群的遺傳多樣性進行研究，發現居群間分化系數變幅為0.047～0.578，居群間的遺傳變異平均值為26.97%[11]，研究結果支持將這12個鐵皮石斛居群分為3大類群。Ding等利用SRAP標記對鐵皮石斛的9個野生種的84個植株進行研究，發現在物種水平上遺傳多樣性較高，而在居群水平上差異性較低[12]。Shen等利用ISSR標記技術將 8個野生鐵皮石斛居群區分開來，發現了16個具有特異性標記的DNA片段[13]。謝明璐等利用開發的SSR標記成功對鐵皮石斛種質進行了純度鑒定[14]。但是基于SSR的鐵皮石斛遺傳多樣性研究仍鮮有報道，更缺乏對人工栽培鐵皮石斛實生群體的遺傳多樣性分析，相關研究缺失不利于鐵皮石斛優良品種的選育，會造成雜交親本的盲目選擇。

核基因SSR標記在真核生物基因組中分布非常普遍，由于其豐富的多態性和共顯性遺傳等特征，被廣泛應用于種內和種群間遺傳變異的分析。本研究利用15對SSR引物對鐵皮石斛不同實生群體的遺傳多樣性進行了分析，主要目的在于：（1）評估石斛實生群體的近交系數，確定純化株系；（2）檢測石斛實生群體之間和群體內部的遺傳分化；（3）為后期人工雜交育種提供理論參考。

1材料與方法

在鐵皮石斛實生苗群體中選取表觀性狀優良的5個群體，分別標記為B4、B6、B10、B11、B12，每個群體隨機選擇長勢較為一致的鐵皮石斛20株，單株編號分別為1～20，共100株用于遺傳多樣性分析。分別從100個單株上取健康幼嫩的葉片，帶回實驗室，置于-80 ℃的超低溫冰箱中備用。

1.1DNA提取

利用優化后的CTAB法[15]進行DNA提取。從葉片中提取基因組總DNA（圖1），每份樣品使用1 g葉片。DNA提取后使用TE緩沖液溶解，置于-20 ℃的冰箱中備用。

1.2PCR擴增及測序

使用15對前人報道的、在石斛中擴增穩定、多態性好的SSR引物進行PCR反應（表1）。引物由Invitrogen（上海）公司合成，并合成5′端經過熒光修飾（FAM和HEX 2種熒光）的M13-Tail通用引物（序列為：TGTAAAACGACGGCCAGT）[19]。PCR體系為20 μL，各組分體積見表2。

PCR反應步驟及條件：94 ℃預變性5 min；隨后是94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環后反應條件設置為94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，12個循環；最終72 ℃延伸6 min。

PCR反應結束后，取4 μL擴增產物用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測（圖2），確認得到單一且長度正確的片段后，將PCR產物送至生工（上海）生物工程有限公司進行基因分型（圖3）。

1.3數據處理

為盡可能避免基因分型過程中的偏差，確定等位基因大小后進行了2次人工校對。對于每個種群和SSR位點，使用GenAlEx 6.501[20]計算等位基因個數（Na）、有效等位基因個數（Ne）、觀察雜合度（Ho）、期望雜合度（He）和近交系數（Fis）。利用FSTAT 2.9.3[21]計算經過香農多樣性指數（I）。

利用STRUCTURE 2.3.4軟件[22]計算同源基因庫的數

目，該方法利用貝葉斯概率統計將鐵皮石斛個體或預定義的群體劃分到K個支系中來解釋其遺傳結構。本研究中，STRUCTURE 2.3.4的運行選擇混合模型和關聯等位基因頻率等參數配置，將同源基因庫個數的賦值為1～8（N+3），每個K值進行10次重復計算來推測最佳的K值。每一次運行使用200 000個循環的馬爾科夫鏈-蒙特卡洛模擬（MCMC），初始收斂周期為100 000；其他參數設為默認值。運行后結果上傳到STRUCTURE HARVESTER（http：//taylor0.biology.ucla.edu/structureHarvester/）確定最佳K值，運行結束后利用CLUMPP軟件處理對10次獨立運行得到的分配系數進行均一化處理，然后使用DISTRUCT軟件繪制計算結果。

2結果與分析

2.1SSR引物多樣性

15對SSR引物共檢測到185個等位基因，每個位點的等位基因數目從2.3個（DNeSSR86）到22.6個（DOeSSR41）不等，平均每個位點有12.3個等位基因。有效等位基因數從1.3個（DNeSSR86）到9.2個（DOeSSR41），平均值為5.5個。香農多樣性指數最大值是2.61（DOeSSR41），最小值是0.31（DNeSSR86），平均值為1.82。觀察雜合度最大值是0.756（DOeSSR44），最小值是0114（DNeSSR86），平均值為0.604。期望雜合度最大值為0.786（DNeSSR37），最小值為0.169（DNeSSR86），平均值為0.654。表明本研究中使用的SSR引物大部分多態性良好，可用于后續的群體遺傳信息分析；其中引物DOeSSR33、DNeSSR86、DOeSSR117多態性顯著低于其他引物（表3）。

2.2鐵皮石斛群體的遺傳多樣性

對5個石斛實生群體進行遺傳多樣性分析，發現群體B6的等位基因數目最多，為7.14個，其次是群體B12，為6.50個；群體B4和B10等位基因數均為5.64個；群體B11等位基因數最少，為5.42個；5個實生群體的有效等位基因數存在一定的差異，以群體B6的有效等位基因數目最大，為6.57

個，最小值雖然出現在群體B11中，但是與群體B4幾乎沒有差異（表4）。觀察雜合度最大的種群是B6，為0.376，群體B12略低于B6，為 0.361；群體B4、B11沒有顯著差別，觀察雜合度分別為 0.309、0.329；群體B10最小，僅為0.286。期望雜合度表現出的趨勢與觀察雜合度相似，最大值和最小值分別出現在群體B6和群體B11，群體B6為0.654，群體B11為0.514。分別對5個石斛種群的近交系數進行了計算。近交系數最大值出現在群體B10中，為0.241；其次為群體B4，為0.168；群體B6近交指數最小，僅為0.091。

2.3鐵皮石斛群體的遺傳結構

為了進一步檢驗群體的遺傳多樣性信息，基于貝葉斯統計法對5個鐵皮石斛實生群體進行了遺傳結構分析。STRUCTURE結果顯示，對5個群體的K值范圍設為1～8，運行10次重復后，將STRUCTURE的運行結果上傳到STRUCTURE HARVESTER并通過前人描述的方法確定最佳的K值，在K=2處觀察到ΔK的最大值（圖4），結果表明，5個石斛實生群體可能來自2個同源基因庫（圖5）。

從STRUCTURE結果中我們發現，除群體B6中的一些個體表現出較為明顯的多源遺傳背景外，其他4個群體種質純度較高，以群體B10遺傳背景最為單一，與之前的雜合度、近交系數等遺傳多樣性參數保持一致。

3結論與討論

本研究采用15對微衛星引物對5個石斛實生群體共100個個體進行了PCR擴增，15個位點共檢測到185個等位基因，群體B6的等位基因數目最多，群體B11等位基因數最少，5個石斛實生群體可能來自2個同源基因庫。雜合度水平可以在很大程度上反映植物的遺傳多樣性[23-24]。雜合度較低與石斛的繁育系統有關，鐵皮石斛自交和雜交均可育，試驗使用的實生種群來自于自交群體，但人工授粉失敗或隔離措施不完善可能造成一些個體是開放式授粉形成的實生苗，這可能是導致B6群體雜合度高于其他群體的原因。

近交系數的取值為[-1，1]，負值表示群體種雜合個體較多，群體的形成可能受到了外源基因流的影響，并非自交育種過程中成功構建的群體。正值表明群體間的近交繁殖有所增加，對于自然群體來講可能是因為群體大小的減小或人為的干預[20]。本研究石斛實生群體為近親或自交形成的種系，有較高的近交系數是正常現象，而且群體B10近交系數最大，表明其遺傳背景較為單一，種質比其他實生群體更加純化，這一點也能通過B10具有最小的觀察雜合度得到佐證。

基于種質雜合背景，因遺傳背景單一，實生群體B10可以用于后續的純化選擇，但是否屬于石斛特征性狀（石斛多糖、石斛堿含量等）還需進一步研究。與其他實生群體相比，群體B6具有較高的雜合度，可以用作石斛種間雜交的良好材料，有利于種間差異性狀的整合。

參考文獻：

[1]姚領愛，胡之璧，鄭志仁，等. 鐵皮石斛種質資源研究中的DNA條形碼初探[J]. 上海農業學報，2012，28（1）：49-54.

[2]張志勇，齊澤民，黃作喜. 鐵皮石斛生物技術研究進展[J]. 核農學報，2014，28（4）：605-610.

[3]斯金平，諸燕，朱玉球. 鐵皮石斛人工栽培技術研究與應用進展[J]. 浙江林業科技，2009，29（6）：66-70.

[4]鄭希龍，蔡時可，邱道壽，等. 鐵皮石斛種質資源研究進展[J]. 廣東農業科學，2011（增刊1）：110-114.

[5]包英華. 鐵皮石斛種質資源的鑒定與評價研究[D]. 廣州：廣州中醫藥大學，2014.

[6]包英華，潘超美，白音，等. 鐵皮石斛種質資源遺傳多樣性的SRAP分析[J]. 北京中醫藥大學學報，2014，37（5）：349-353.

[7]武榮花. 我國石斛屬植物種質資源及其親緣關系研究[D]. 北京：中國林業科學研究院，2007.

[8]張啟香，方炎明. 鐵皮石斛組織培養及試管苗營養器官和原球莖的結構觀察[J]. 西北植物學報，2005，25（9）：1761-1765.

[9]沈潔，徐慧君，袁英惠，等. 鐵皮石斛野生居群基于RAMP標記的遺傳多樣性評價[J]. 藥學學報，2011，46（9）：1156-1160.

[10]丁鴿，丁小余，沈潔，等. 鐵皮石斛野生居群遺傳多樣性的RAPD分析與鑒別[J]. 藥學學報，2005，40（11）：1028-1032.

[11]Li X E，Ding X Y，Chu B H，et al. Genetic diversity analysis and conservation of the endangered Chinese endemic herb Dendrobium officinale Kimura et Migo （Orchidaceae） based on AFLP[J]. Genetica，2008，133（2）：159-166.

[12]Ding G，Zhang D Z，Ding X Y，et al. Genetic variation and conservation of the endangered Chinese endemic herb Dendrobium officinale based on SRAP analysis[J]. Plant Systematics and Evolution，2008，276（3/4）：149-156.

[13]Shen J，Ding X Y，Liu D Y，et al. Intersimple equence repeats（ISSR）molecular fingerprinting markers for authenticating populations of Dendrobium officinale Kimura et Migo[J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin，2006，29（3）：420-422.

[14]謝明璐，侯北偉，韓麗，等. 珍稀鐵皮石斛SSR標記的開發及種質純度鑒定[J]. 藥學學報，2010，45（5）：667-672.

[15]Doyle J J. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J]. Phytochem Bull，1987，19：11-15.

[16]Lu J J，Kan J Y，Ye S R，et al. Isolation and characterization of novel EST-SSRs in the showy dendrobium，Dendrobium nobile（Orchidaceae） [J]. Genet Mol Res，2014，13：986-991.

[17]Lu J J，Suo N N，Hu X，et al. Development and characterization of 110 novel EST-SSR markers for Dendrobium officinale（Orchidaceae）[J]. American Journal of Botany，2012：e415-e420.

[18]Hou B W，Tian M，Luo J，et al. Genetic diversity assessment and ex situ conservation strategy of the endangered Dendrobium officinale （Orchidaceae） using new trinucleotide microsatellite markers[J]. Plant Systematics and Evolution，2012，298（8）：1483-1491.

[19]Schuelke M. An economic method for the fluorescent labeling of PCR fragments[J]. Nature Biotechnology，2000，18（2）：233-234.

[20]Peakall R，Smouse P E. GENALEX 6：genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research[J]. Molecular Ecology Notes，2006，6：288-295.

[21]Goudet J F. A computer program to calculate F-statistics（version 2.9.3）[J]. Journal of Heredity，1995，86：485-486.

[22]Pritchard J K，Stephens M，Donnelly P. Inference of population structure using multilocus genotype data[J]. Genetics，2000，155（2）：945-959.

[23]Gregorius H，Roberds J H. Measurement of genetical differentiation among subpopulations[J]. Theoretical and Applied Genetics，1986，71：826-834.

[24]Miller J C，Tanksley S D. RFLP analysis of phylogenetic relationships and genetic variation in the genus Lycopersicon[J]. Theoretical and Applied Genetics，1990，80：437-448.