微型大白菜“娃娃菜”優異雙單倍體的創制與評價

王麗麗+王鑫++吳海東++田云+呂艷玲

摘要：以7個“娃娃菜”優良雜交種為試材進行小孢子培養，通過優化培養條件建立高效培養體系。結果表明，不同基因型間的小孢子胚誘導能力差異極顯著，33 ℃條件熱擊48 h，胚誘導率達最大值；NLN-13+0.05 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA為適宜的誘胚培養基，MS+3%蔗糖+0.75%瓊脂+0.1 g/L活性炭是小孢子植株繼代和壯苗的適宜培養基，MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂+0.1 mg/L NAA是小孢子植株適宜的生根培養基。通過游離小孢子培養，獲得大量的小孢子胚狀體和再生植株195株，篩選獲得2個優異的雙單倍體（DH系）植株。

關鍵詞：微型大白菜；游離小孢子培養；胚狀體；再生植株；娃娃菜；雙單倍體（DH系）；熱擊

中圖分類號： S634.102.4文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0236-03

收稿日期：2016-01-07

基金項目：遼寧省科學事業公益基金（編號：2013002001）。

作者簡介：王麗麗（1981—），女，河北滄州人，博士，助理研究員，主要從事十字花科蔬菜遺傳育種研究。E-mai：wanglili_81@163.com。

通信作者：田云，碩士，副研究員。E-mail：cloudtian@163.com。大白菜是我國主要的蔬菜作物之一，備受育種工作者的關注。隨著消費者對大白菜的球色、品質提出更高要求，為滿足市場和消費者需求，研究者傾向于注重球色、品質以及品種的新、奇、特等開展各種類型大白菜品種的育種研究。“娃娃菜”別稱微型大白菜，其名字起源于中國，是一種小株型、具有特殊食用價值的大白菜，外形美觀、可密植、耐貯藏、耐運輸，可保證產品的整齊一致，有利于實現產業化。娃娃菜由于生長周期一般為45～50 d，相對較短，因此病蟲害也較普通大白菜少，在生長過程中施用農藥量也少，是一種綠色、安全的蔬菜。另外，娃娃菜纖維含量較少，營養物質含量更加豐富，口感更好。盡管“娃娃菜”的概念起源于中國，產地和消費市場均在中國，但我國開展娃娃菜育種較國外晚，目前市場上使用最多的卻是韓國和日本品種，選育具有自主知識產權的娃娃菜品種是亟待解決的問題。

游離小孢子培養技術在花椰菜、菜薹、芥藍、普通白菜、大白菜、青梗菜、小松菜等多種蕓薹屬農作物[1-7]上獲得成功，用游離小孢子培養技術創制的雙單倍體純系（DH系）作親本可以加快育種進程。本試驗選用引自韓國的4個娃娃菜雜交種及國內3個娃娃菜雜交種為材料，對影響娃娃菜胚狀體發生及其成苗的關鍵因素如基因型、低溫預處理及激素等進行系統分析，以更好地利用游離小孢子培養技術創制新、奇、特蔬菜品種DH系，創新種質資源，豐富大白菜品種類型。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗于2013年9月在遼寧省農業科學院蔬菜研究所基地進行，試驗材料共7個，分別為愛娃、小巧娃娃菜、明月黃娃娃菜、金玲等4個引自韓國的娃娃菜雜交種及秀麗娃娃菜、津夏三號、金春娃2號等3個中國產的娃娃菜雜交種。試材分3批播種，第1批于8月下旬開始，將萌動種子在4 ℃冰箱中春化處理25 d，9月下旬播種于穴盤，11月初栽植于花盆中溫室培育，12月中旬至翌年3月開花取樣；第2、第3批試材各延遲30 d播種，春化及定植時間順延。

1.2試驗方法

1.2.1游離小孢子培養方法小孢子培養采用常規方法，略有改進。開花期，采集健壯植株上長2～3 mm的花蕾，用流動的清水沖洗5 min，75%乙醇表面消毒30 s，再用0.1% HgCl2溶液滅菌8 min，無菌水洗滌3次，每次5 min；瀝干水分，B5液體洗滌培養基中用玻璃棒碾壓花蕾，擠出小孢子；小孢子懸浮液經孔徑為50 μm的尼龍網過濾，1 100 r/min離心3 min；棄上清液，所得沉淀物即為純凈小孢子；將分離純化的小孢子用NLN-13培養基懸浮，用直徑為60 mm的培養皿分裝，每皿5 mL，Parafilm膜封口；33 ℃條件下暗培養，然后轉至25 ℃條件下暗培養，直至14～21 d長出肉眼可見的胚狀體。

1.2.2小孢子培養體系優化處理方法將分離純化的小孢子懸浮液分別在33 ℃條件下進行24、48、72 h熱擊暗培養 21 d，統計胚誘導率，比較33 ℃熱擊處理不同時間對小孢子胚發生的影響；在NLN-13培養基中添加不同濃度6-BA和NAA培養21 d，統計胚誘導率，比較培養基中6-BA、NAA濃度及其配比對小孢子胚發生的影響；將子葉形胚轉入到添加不同濃度6-BA和NAA的MS培養基中培養25 d，統計胚成苗率，比較MS培養基中6-BA、NAA濃度及其配比對小孢子胚成苗的影響；將分生苗轉入MS培養基中繼代培養，每25～30 d繼代1次，9月下旬，將經過多次繼代培養獲得的試管苗轉入到添加不同濃度NAA的MS培養基中培養25 d左右誘導生根，后移至花盆中溫室培育。

1.3統計與分析方法

利用流式細胞儀鑒定再生植株倍性；應用DPS 2000統計軟件采用鄧肯氏新復極法差對數據進行差異顯著性分析。

2結果與分析

2.1不同品種小孢子胚誘導情況

由表1可知，NLN-13培養基上培養小孢子14～21 d，7個參試品種中有3個品種誘導出胚狀體，誘導率為42.9%；不同品種間的胚誘導能力有極顯著差異，津夏三號相對最高，平均每蕾產胚為1.51個。

2.2小孢子胚誘導體系優化

2.2.1熱擊處理對胚誘導的影響將分離純化的小孢子懸浮液在33 ℃條件下分別熱擊暗培養不同時間。由表2可知，熱擊處理對娃娃菜小孢子胚誘導能力的影響效果明顯，同一品種熱擊培養不同時間，其小孢子胚誘導能力差異極顯著；不進行熱擊或熱擊培養24 h，津夏三號等3個品種均未誘導出小孢子胚狀體；熱擊48 h為最佳培養時間，胚誘導能量達到最大，津夏三號、秀麗娃娃菜、金春娃2號的平均每蕾產胚分別為1.35、1.08、0.45 個，熱擊超過48 h，胚誘導能力下降。

2.2.2激素濃度對小孢子胚狀體誘導的影響由表3可知，添加適宜濃度6-BA和NAA的NLN-13培養基可以提高胚狀體的誘導能力；胚狀體發生培養基適宜的激素濃度為 6-BA 0.05 mg/L+NAA 0.05 mg/L，以津夏三號的胚誘導效果最高，平均每蕾產胚1.35個。

2.2.3振蕩培養對小孢子胚狀體發育的影響將培養15 d的小孢子胚狀體在25 ℃恒溫搖床上50 r/min繼續暗培養發現，與不振蕩培養相比，振蕩培養有利于促進子葉形胚狀體的發育，胚狀體生長速度加快（圖1-A）。

2.3激素濃度對胚成苗的影響

試驗結果表明，子葉形胚轉入不含任何激素的MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂+0.1 g/L活性炭培養基上培養14～21 d，子葉形胚形成愈傷組織（圖1-B），并沒有形成不定芽，而轉入含有 1 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA的MS+3%蔗糖+08%瓊脂+0.1 g/L活性炭培養基上培養，會分生出不定芽（圖1-C），添加激素濃度如過高，則影響不定芽的質量，產生畸形苗。在實際操作過程中，最好先將子葉形胚轉入不含激素的MS培養基培養，形成愈傷組織后再轉入含有激素的MS培養基，以促進更多叢生苗的形成。

2.4繼代和生根培養

將獲得的小孢子分生苗轉入MS+3%蔗糖+0.75%瓊脂+0.1 g/L活性炭培養基上進行繼代培養，每隔25 d左右繼代1次，經2～3次繼代，小孢子由纖弱植株逐漸復壯形成再生植株（圖1-D）；試管苗長到6～7片真葉時，將壯苗轉到MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂+0.1 mg/L NAA的生根培養基上，培養25 d左右即可生出粗壯、整齊的白色根系，煉苗后移栽至花盆在溫室中培育。目前，已經獲得195株小孢子再生植株。須說明的是，小孢子植株繼代和壯苗培養過程中，在培養基中添加0.1 g/L的活性炭會有利于小孢子植株的復壯。

2.5DH系評價

對獲得的再生植株測定其育性及倍性，結果表明，獲得的195株再生植株，可育株有167株，不育株有28株，可育株中單倍體植株有4株，雙單倍體植株有155株，四倍體植株有8株。經秋季田間性狀鑒定，篩選出2個優良的DH系15W05、15W16（圖2）。

3討論與結論

目前，有對春結球黃心大白菜、抗根腫病大白菜、耐抽薹大白菜等游離小孢子培養技術的研究報道[8-10]，主要是對影響胚狀體發生及其成苗的關鍵因素包括基因型、低溫預處理及激素等進行系統分析，完善小孢子培養技術體系。本試驗將游離小孢子培養技術與育種實踐相結合，重點研究娃娃菜游離小孢子的培養，旨在將該技術應用于創制新、奇、特的大白菜品種，以豐富大白菜種質資源。

蔣武生等開展基因型、高、低溫預處理、激素對大白菜胚胎發生影響的研究，結果表明，基因型是決定小孢子胚發生的重要因素之一；適當的低溫預處理或熱擊處理能夠提高小孢子胚的發生頻率；培養基中添加適宜濃度的激素6-BA、NAA能促進小孢子胚狀體產生。本試驗結果表明，不同品種娃娃菜的小孢子胚誘導能力差異顯著；影響小孢子胚狀體發生及發育的關鍵因素主要為熱擊處理、激素濃度及振蕩培養；胚狀體發生培養基中添加濃度均為0.05 mg/L的6-BA、NAA，小孢子胚誘導率最高，這與前人研究結果[11-12]一致。小孢子正常是通過不對稱核分裂后發育成花粉，而要讓小孢子發育成胚，就要阻斷原有的配子體發育，使小孢子進行對稱性分裂向孢子體方向發育，才能誘導小孢子胚的發生[13-16]。姜立榮等觀察白菜小孢子發現，單核晚期，小孢子大部分都有1個清晰的占整個細胞50%以上的大液泡，25 ℃條件下小孢子會進行不對稱分裂，而經過32 ℃處理，對稱分裂成為其主要的分裂方式[13]。本試驗中，熱擊預處理對娃娃菜小孢子胚發生的作用最為明顯，分離純化的小孢子懸浮液在33 ℃條件下熱擊 24 h，未誘導出小孢子胚狀體，熱擊48 h則胚誘導效果達到最大值，熱擊超過48 h時胚誘導能力下降，這說明熱擊處理也是影響小孢子胚發生的重要因素之一。

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