外源5—氨基乙酰丙酸（ALA）對鹽脅迫下小型西瓜幼苗抗氧化酶活性的影響

陳罡+管安琴++萬云龍++馮偉民++樊平聲++盧昱宇

摘要：以耐鹽性較弱的小型西瓜品種秀麗2號為材料，采用營養液栽培法，研究了外源5-氨基乙酰丙酸（ALA）對NaCl脅迫下西瓜幼苗葉片、根系中超氧陰離子（ O-2 · ）產生速率、丙二醛（MDA）含量、相對電導率和抗氧化酶活性的影響。結果表明，100 mmol/L NaCl處理下，西瓜幼苗葉片、根系中 O-2 · 產生速率、MDA含量和相對電導率均顯著升高；而1.25 mmol/L外源ALA處理顯著提高NaCl脅迫下西瓜幼苗葉片、根系超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶活性，顯著降低了 O-2 · 產生速率、MDA含量和相對電導率。這些結果表明，外源ALA處理可有效清除體內活性氧，降低膜脂過氧化傷害程度，從而緩解鹽脅迫對植株生長的抑制，進而有助于增強西瓜植株對鹽脅迫的耐受性。

關鍵詞：小型西瓜；5-氨基乙酰丙酸（ALA）；鹽脅迫；抗氧化酶活性

中圖分類號： S651.01文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0252-04

收稿日期：2015-08-13

基金項目：江蘇省農業科技自主創新資金[編號：CX（13）5014]。

作者簡介：陳罡（1982—），男，安徽潁上人，博士，助理研究員，主要從事蔬菜栽培生理與生物技術研究。Tel：（025）84391293；E-mail：chengang2891@163.com。

通信作者：馮偉民，研究員，主要從事蔬菜無公害栽培技術研究。E-mail：fweimin@126.com。西瓜（Citrullus lanatus），為葫蘆科西瓜屬的一年生蔓生草本植物，果瓤脆嫩，味甜多汁，含豐富的礦物鹽和多種維生素，可清熱解暑，還對高血壓、腎病具有一定輔助療效，是深受人們喜愛的消夏食品。西瓜是全球廣泛分布的主要園藝作物，也是世界上十大重要水果之一。中國是西瓜生產大國，面積和產量均位居世界首位[1]。近年來隨著我國設施園藝的迅速發展，西瓜反季節保護地栽培面積不斷擴大。由于園藝設施季節性或常年覆蓋生產，土壤長期得不到雨水的淋洗，使鹽分聚集，引起土壤次生鹽漬化，嚴重影響西瓜的生長和發育。

利用外源物質提高植物幼苗的抗鹽性已在多種植物上應用。外源亞精胺可以提高鹽脅迫條件下黃瓜幼苗的耐鹽性[2]。外源脯氨酸處理可以通過減少鹽脅迫下甜瓜植株體內丙二醛（MDA）含量，保護細胞質膜，從而減輕鹽脅迫對植株的傷害[3]。5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA），又名δ-氨基乙酰丙酸，是所有卟啉類化合物生物合成的關鍵前體，參與許多生物體中的生物化學反應，如光合作用、維生素B12和血紅素的合成等，并具有植物生長調節劑的作用[4-5]。Watanabe等在比較12種植物生長調節物質對棉花耐鹽性影響的試驗中觀察到，以1.5% NaCl處理的植株全部死亡，而經100～300 mg/L ALA處理的受害率僅為20%～30%，且植株干質量和鮮質量與未經NaCl處理的差異不顯著[6]。近幾年一些研究表明，ALA可以提高多種蔬菜作物的抗逆性。周月等研究表明，0.1 mmol/L ALA能緩解鹽脅迫下豌豆幼苗的氧化損傷，顯著提高SOD等保護酶活性[7]。外源ALA 處理可以顯著提高櫻桃番茄幼苗葉片的保護酶活性，增強櫻桃番茄幼苗對鹽脅迫逆境的耐受能力，減輕和緩解鹽傷害[8]。劉暉等發現，125 mmol/L NaCl處理下添加 15～30 mg/L ALA可以明顯緩解鹽脅迫對西瓜種子萌發的抑制效應[9]。然而，目前關于ALA如何增強鹽脅迫下西瓜幼苗耐鹽性的研究尚未見報道。

本研究采用營養液栽培，通過外源ALA處理鹽脅迫下小型西瓜幼苗，研究外源ALA對鹽脅迫下西瓜幼苗葉片、根系中 O-2 · 產生速率、MDA含量、相對電導率和抗氧化酶活性的影響，探討外源ALA緩解鹽脅迫對西瓜傷害的生理機制，為闡明ALA增強西瓜植株耐鹽性機理提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

試驗于2014年9—11月在江蘇省農業科學院玻璃溫室內進行。選用耐鹽性較弱的小型西瓜品種秀麗2號（安徽省農業科學院園藝研究所提供）為材料，種子經消毒、浸種后，在30 ℃恒溫培養箱中下催芽2 d，待芽長0.5 cm時播于裝有基質的50孔塑料穴盤中育苗。溫室內晝溫20～30 ℃、夜溫13～18 ℃，光合有效輻射（PPFD）最大為800 μmol/（m2·s）左右，相對濕度維持在60%～70%，每天澆水保持基質濕潤，幼苗第1片真葉展開后澆1/2劑量的Hoagland營養液：Ca（NO3）2· 4H2O 945 mg/L、KNO3 607 mg/L、NH4H2PO4 115 mg/L、MgSO4·7H2O 493 mg/L、H3BO3 2.86 mg/L、MnSO4·4H2O 2.13 mg/L、ZnSO4·7H2O 0.22 mg/L、CuSO4·5H2O 0.08 mg/L、（NH4）6Mo7O24·4H2O 0.02 mg/L、NaFe-EDTA 30 mg/L。3葉1心時選取生長整齊一致的幼苗定植于裝有1/2劑量Hoagland營養液的塑料水箱中（20 L），營養液pH值調至6.5±0.1，電導率（EC）2.0～2.2 mS/cm，并早晚各用氣泵通氣30 min。ALA為Sigma公司生產的分析純藥品。

1.2試驗處理

植株預培養5 d后，向營養液中添加NaCl（分析純），分2次加入，開始處理時營養液中NaCl濃度為50 mmol/L，第2天使營養液中NaCl終濃度為100 mmol/L，此時定為鹽脅迫處理開始時間。試驗設4個處理：（1）無鹽對照（CK）：正常營養液栽培；（2）無鹽對照+1.25 mmol/L ALA；（3）鹽脅迫（NaCl）；（4）鹽脅迫+1.25 mmol/L ALA（NaCl+ALA）。待幼苗4～5片真葉展開開始NaCl處理時，當天下午17：00用小型噴霧器噴施ALA（添加0.01% Triton作展著劑），葉面、葉背均勻噴灑，以藥液附于葉面但不下滴為準，噴施量每株 3 mL。每個水箱15株，試驗隨機排列，每處理重復3次。開始處理8 d后，選生長點以下第3片展開真葉用液氮速凍后置于 -80 ℃ 超低溫冰箱中保存備測。本試驗所采用的NaCl脅迫濃度（100 mmol/L）和葉面噴施的ALA濃度（1.25 mmol/L）均由預備試驗篩選得出。

1.3生理指標測定

O-2 · 產生速率按照王愛國等的方法[10]測定。丙二醛（MDA）含量采用Heath等的方法[11]測定。相對電導率參照Gong等的電導率儀法[12]測定。超氧化物歧化酶（SOD）活性采用Giiannopolitis等的方法[13]測定，以抑制氮藍四唑（NBT）光還原50%為1個酶活性單位（U）。過氧化物酶（POD）活性按照曾韶西等的方法[14]測定，以D470 nm 1 min增加0. 01為1個酶活性單位（U）。過氧化氫酶（CAT）活性采用Dhindsa等的方法[15]測定，以1 min減少0.1個吸光度值所需酶量為1個活力單位（U）。

1.4數據分析

試驗數據均采用SAS 13.0統計分析軟件進行數據分析，Duncans多重比較法進行統計分析。

2結果

2.1外源ALA對NaCl脅迫下小型西瓜幼苗 O-2 · 產生速率、MDA含量和相對電導率的影響

由圖1可知，NaCl脅迫處理8 d后，西瓜幼苗葉片和根系 O-2 · 產生速率顯著提高，與無鹽對照相比，分別顯著提高了122.4%和136.2%；NaCl脅迫下噴施外源ALA可以顯著降低 O-2 · 產生速率，其葉片和根系分別顯著降低了42.5%和44.7%，說明外源ALA能有效降低NaCl脅迫引起的 O-2 · 產生速率的增加，從而降低由活性氧引起的傷害；無鹽條件下，施用外源ALA對西瓜幼苗葉片和根系 O-2 · 產生速率無明顯影響。

從圖1可以看出，NaCl脅迫處理8 d后，西瓜幼苗葉片和根系MDA含量顯著增加，與無鹽對照相比，分別顯著增加了77.7%和94.6%；NaCl脅迫下噴施外源ALA可以顯著降低MDA含量，其葉片和根系分別降低了26.7%和30.3%。無鹽條件下，施用外源ALA對西瓜幼苗葉片和根系MDA含量無明顯影響。MDA是植物在逆境條件下膜脂過氧化的最終分解產物，其含量可以用來衡量植物遭受逆境傷害的程度，此結果說明外源ALA能有效降低NaCl脅迫引起的MDA含量的增加，進而緩解膜脂過氧化損傷，降低細胞膜的受損程度。

由圖1可見，NaCl脅迫處理8 d后，小型西瓜幼苗葉片和根系的相對電導率顯著增加，與無鹽對照相比，分別顯著增加了82.7%和83.2%，NaCl脅迫下噴施外源ALA可以顯著降低相對電導率，其降低程度分別為22.5%和28.3%；無鹽條件下，噴施外源ALA對西瓜幼苗葉片和根系相對電導率無明顯影響。葉片和根系相對電導率是反映細胞膜受損程度的重要指標之一，此結果表明NaCl脅迫破壞了西瓜幼苗細胞膜的穩定性，使膜結構受到損傷，造成細胞內電解質滲漏加劇，而噴施外源ALA可以有效減輕NaCl脅迫對西瓜幼苗細胞膜傷害的程度。

以上結果說明，NaCl脅迫下西瓜植株體內 O-2 · 產生速率、MDA含量和相對電導率增加，導致幼苗活性氧傷害和膜脂過氧化，特別是根系直接處于NaCl脅迫的環境中，受到的傷害程度大于葉片；而噴施外源ALA可以降低 O-2 · 產生速率、MDA含量和相對電導率，從而減緩活性氧對幼苗的傷害，降低膜脂過氧化作用，減輕NaCl脅迫對西瓜細胞膜的傷害。

2.2外源ALA對NaCl脅迫下小型西瓜幼苗超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性的影響

由圖2可見，NaCl脅迫處理8 d后，顯著降低了西瓜葉片和根系中SOD、POD、CAT保護酶的活性，其葉片3種酶活性分別降低了32.2%、28.2%、50.0%，而根系3種酶活性分別降低了33.3%、30.2%、55.9%；葉面噴施外源ALA能夠顯著提高NaCl脅迫下西瓜葉片和根系中SOD、POD、CAT活性，與NaCl脅迫處理相比葉片3種酶活性分別升高了22.5%、25.1%、62.5%，而根系3種酶活性分別升高了19.8%、31.0%、66.7%；無鹽條件下，外源ALA對西瓜幼苗葉片和根系中SOD、CAT活性無明顯影響；而無鹽條件下，外源ALA提高西瓜幼苗根系中POD活性，升高了7.8%。上述結果表明，NaCl脅迫處理8 d后，西瓜幼苗自身的調節能力減弱，內源抗氧化酶系統清除活性氧、防止膜脂過氧化作用的能力下降，幼苗會受到傷害；葉面噴施外源ALA可以提高NaCl脅迫下西瓜幼苗體內抗氧化酶的活性，增強植株對體內活性氧的清除能力，有效降低氧化損傷，從而提高植株的抗鹽性。3討論

植物自身的抗氧化酶和抗氧化劑防御系統能使體內活性氧的產生與清除之間維持在一個動態平衡之中。非生物逆境誘導植物體內活性氧（ROS）積累增多，過量的ROS攻擊植物體內蛋白質、脂質、碳水化合物和DNA，最終導致氧化脅迫抑制植物的生長[16]。Parida 等指出，鹽脅迫加快了植物體內膜脂過氧化作用的進程，植物體內ROS代謝平衡被打破，ROS含量增加，細胞膜脂過氧化和脫脂化，細胞膜結構和完整性被破壞，引起膜流動性降低，使質膜透性增加，植物細胞生理代謝發生紊亂，而導致細胞的傷害或死亡，抑制植物生長[17]。本試驗中，NaCl脅迫處理8 d后，西瓜幼苗葉片和根系 O-2 · 產生速率加快，SOD、POD和CAT活性降低，對ROS的清除能力降低，來不及清除大量的ROS，導致了西瓜幼苗膜脂過氧化傷害，進一步抑制了植株的生長。

細胞膜是受逆境脅迫最敏感的部位之一。環境脅迫會使植物體內活性氧自由基大量積累，而積累的活性氧自由基會導致膜脂肪酸中的不飽和鍵被過氧化形成MDA。活性氧自由基誘導的膜脂過氧化是脅迫造成的細胞水平上的傷害，膜脂過氧化過程中產生的MDA含量的高低和相對電導率的大小都是反映細胞膜脂過氧化作用強弱和質膜破壞程度的重要指標[18]。MDA積累多，說明 O-2 · 與羥自由基（·OH）可能是高水平。本研究發現，西瓜幼苗受到NaCl脅迫后，其MDA含量和組織相對電導率顯著升高，說明細胞質膜發生了過氧化作用，引起質膜正常生理功能發生紊亂；但當用外源ALA處理以后，其MDA含量和組織相對電導率顯著降低，說明ALA對減緩鹽脅迫所造成的過氧化傷害具有積極的緩解作用，并以1.25 mmol/L的ALA處理效果最好。

鹽脅迫逆境會提高細胞ROS水平，而造成氧化損傷的ROS主要包括 O-2 · 和H2O2，其中 O-2 · 對植物體的傷害更重。植物抗氧化酶系統的SOD、POD和CAT酶在維持膜結構完整性、清除ROS自由基、緩解膜脂過氧化傷害方面發揮著重要作用，可有效提高植物對逆境脅迫的適應性[19]。SOD主要存在于細胞質、葉綠體和線粒體內，是植物體內抵御氧化脅迫的第一道防線。當植物受脅迫、活性氧增加時，SOD的合成表達便會增強， O-2 · 在SOD的催化作用下發生歧化反應，生成H2O2和O2。同時POD、CAT在植物組織中廣泛存在，POD能夠催化以H2O2為氧化劑的氧化還原反應，將H2O2還原為H2O；CAT可將代謝中產生的H2O2分解為H2O和O2。這3種抗氧化酶協同作用可以有效降低植株體內自由基的水平，保護細胞膜結構，從而防止自由基對植物的傷害[20]。本研究中，NaCl脅迫下施用ALA處理能顯著提高西瓜幼苗葉片和根系SOD、POD和CAT酶活性，而 O-2 · 產生速率、MDA含量和相對電導率顯著降低。說明施用ALA后高活性的SOD、POD和CAT酶能協同作用，提高了西瓜幼苗葉片和根系的抗氧化能力，減少細胞中ROS的含量，降低膜脂過氧化，使得膜脂過氧化產物MDA含量和相對電導率顯著降低。

外源噴施適宜濃度的ALA能夠刺激誘導抗氧化酶的活性，加速ROS的清除[21]，這可能是ALA提高脅迫條件下植物抗性的一種作用機制。ALA是亞鐵血紅素（Heme）的合成前體，而Heme作為輔基普遍存在于POD和CAT中，因此推測作為四吡咯類化合物合成的關鍵前體，外源ALA可能通過轉化為Heme進而導致POD活性增加，從而提高抗氧化脅迫能力[4，22]，并認為ALA可能是促進NaCl脅迫下西瓜種子萌發的原因之一[9]。在豌豆、櫻桃番茄等多種蔬菜作物上發現，ALA提高抗逆性總是伴隨著抗氧化酶活性的增加，因此推測ALA誘導SOD、POD、CAT等抗氧化酶活性上升是其增強植物抗逆性的主要原因[7-8，23-24]。

綜上所述，鹽脅迫顯著抑制小型西瓜幼苗生長，施用 1.25 mmol/L ALA能有效緩解鹽脅迫誘導的生長抑制，ALA通過提高鹽脅迫下西瓜幼苗的抗氧化酶活性，加強清除活性氧能力，降低了膜脂過氧化程度，維持了細胞膜的穩定性，從而緩解西瓜幼苗所受的氧化損傷，增強植株對鹽脅迫的抗性。

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