小口徑電紡組織工程血管支架的研究進展

楊錦秀　綜述　何樂人　審校

小口徑電紡組織工程血管支架的研究進展

楊錦秀綜述何樂人審校

【提要】小口徑血管是組織工程血管領域的重要部分，臨床實用性強。小口徑血管支架的合成是構建小口徑人工血管的基礎，而電紡技術作為一種新型的組織工程材料制備技術，可利用高壓靜電場產生微米級甚至是納米級的纖維，再經過一系列加工處理，形成類似細胞外基質的結構，刺激細胞的黏附和增殖。本文對小口徑電紡組織工程血管支架的相關材料、制備工藝、表面修飾和評價進行綜述。

【關鍵詞】電紡組織工程血管支架小口徑

目前，臨床上常用的血管移植物主要包括自體血管、異體血管和人造血管，在實際應用中各有利弊。自體或異體血管的來源有限，同時造成供區損傷；人造血管，如滌綸、膨脹聚四氟乙烯等，已成功應用于大血管的替換，但在直徑<6 mm的小口徑血管移植應用中并不理想[1]，常因血流速度慢、灌注壓低，而出現內膜增厚、血管狹窄、血栓形成、感染等情況，導致遠期通暢率低。理想的小口徑血管移植替代物的制備，仍是血管移植和組織修復領域亟待解決的難題。

近年來，生物新材料的不斷涌現，以及制備工藝的不斷創新，為合成具有更加優良生物學性能的組織工程血管（Tissue Engineering Blood Vessel，TEBV）奠定了基礎。TEBV是指利用正常血管壁的細胞和ECM成分重建或再生的血管，其中支架材料及其制備方法是組織工程血管發展的重要制約因素之一。目前，相關支架的制備方法主要包括靜電紡絲法、溶液澆筑浸漬法、細胞自組裝法和熱致相分離法等。

靜電紡絲（電紡，Electrospinning）是一種新型組織工程材料制備技術，其原理是利用高壓靜電場產生微米級甚至納米級的纖維。該方法由Formhals[2]首次報道，并在本世紀初應用于組織工程血管支架（Tissue Engineering Blood Vessel Grafts，TEVGs）的制備。靜電紡絲法制備的材料具有孔隙率高、比表面積大、機械性能良好等特點，理論上可較好地模擬細胞外基質（ECM）結構，有利于血管內皮細胞的黏附和增殖[3]。因此，該方法在小口徑組織工程血管的研究中具有較強的技術優勢和廣闊的應用前景。

1　電紡TEVGs的材料

合成電紡支架的材料主要有三大類：天然大分子材料、可降解聚合物材料和復合材料。

1.1天然大分子材料

天然大分子材料是由生物合成的有機大分子物質，如膠原（Collagen）、絲素蛋白（Silk fibroin）、彈性蛋白（Elastin）、明膠（Gelatin）和殼聚糖（Chitosan）等。這些材料通常含有促進細胞黏附、增殖的識別信號分子，組織相容性好，免疫排斥反輕微。植入體內后逐步降解，終產物一般為H2O、CO2等可被人體吸收的無毒小分子。

絲素蛋白是從蠶絲中提取的天然高分子纖維蛋白，含量約占蠶絲的70%～80%,具有良好的機械性能和理化性質，如一定的柔韌性和抗拉伸性、透氣透濕、釋放緩慢等。研究表明，絲素蛋白具有較好的生物相容性，適宜細胞附著、延伸和增殖，是有前景的支架生物材料之一[4-5]。Soffer等[6]成功利用電紡技術將絲素蛋白制備成直徑5 mm的血管支架；Marelli 等[7]利用絲素蛋白制備出直徑6 mm的納米管狀支架，動物實驗表明該支架的生物相容性良好。

膠原蛋白和彈性蛋白是天然細胞外基質的主要成分，對正常細胞的生長與依附具有重要作用，可將其用于制作小口徑組織工程血管。Boland等[8]曾使用電紡方法制備出膠原蛋白和彈性蛋白混合納米纖維支架，表明兩種甚至多種材料混合形成小口徑血管支架在技術上具有可行性。

但是，實驗及應用研究發現，天然大分子材料在力學性能上存在缺陷，很難在生理狀態的血壓下長期維持三維管狀形態，在血運豐富的區域，高流速的灌注血流可使其發生破損或斷裂；另外，降解速率過快，難以匹配組織工程血管的形成時間，導致血管構建的失敗[9]。

1.2可降解聚合物材料

可降解聚合物材料與生物材料相比具有良好的機械性能，易于加工、可控性強，可根據實際需求制作出不同形態、不同機械性能的支架。另外，可降解聚合物支架可設定分解速率，最終隨組織的再生而完全降解，且基本避免了免疫排斥反應。目前這種材料的研究較多，其特性適用于小口徑電紡組織工程血管的制備。常用的可降解聚合物材料主要有聚羥基乙酸（PGA）、聚乳酸（PLA）、PGA和PLA共聚體 PLGA （Poly lactic-co-gly colic acid）、聚己內酯 （PCL）、聚乙烯醇（PVA）和聚羥基丁酸酯（PHB）等。

西方歌劇發展至今經久不衰，正是因為有這些歌劇改革者的不懈努力，有了他們的緊跟時代的創作，才留下了這么多歷久彌新的經典歌劇，雖然這三位作曲家遠遠不能概括歐洲歌劇的發展，但我們可以從中窺探到歌曲發展到今天的不易，了解到了歌劇藝術發展的輝煌歷程。

Mo等[10]將PLLA與PCL兩種聚合物材料溶于丙酮溶液，利用混合電紡技術制成P(LLA-CL)血管支架，并接種人管狀動脈平滑肌細胞，支架移植成功且遠期通暢率尚可。之后，Petok等[11]將PCL溶于三氯甲烷與乙醇的混合溶液中，利用電紡技術制造出直徑2 mm的血管支架，并植入大鼠體內，6個月后解剖發現支架仍保持了完整的結構。

可降解聚合物材料具有較好的可控性及機械性能，并在一定程度上彌補了天然材料的缺陷，但同時也存在一些需要解決的問題，如部分材料的細胞親和不佳、親水性和細胞黏附力較差，容易造成局部的無菌炎癥反應等。

1.3復合材料

復合材料是天然大分子材料與可降解聚合物材料按一定比例組合形成的新型材料。天然大分子有良好的生物相容性，易于細胞的粘附與增殖，而可降解聚合物材料具有較好的機械性能和可控性。這兩種材料相互補充，利用彼此的優點所形成的復合材料，更能滿足電紡組織工程血管支架的需要，是未來這一領域的主要發展方向。近十年來小口徑電紡組織工程血管支架的進展概況見表1。

表1　小口徑電紡組織工程血管支架的進展概況

2　小口徑電紡TEVGs的制備

2.1制備原理

電紡技術制備的小口徑血管支架是在數萬伏電壓作用下，使高聚合物的溶液或熔融體帶上電荷，隨著電場強度的增加，電荷達到臨界，靜電斥力使溶液克服表面張力形成噴射細流；溶劑在噴射過程中揮發，通過不同口徑的旋轉軸心收集裝置得到定向或隨機排列的納米纖維管。該方法可產生模仿生理血管形態和機械性能的圓管狀支架結構[20]。

2.2制備方法

電紡制備小口徑血管支架的主要方法有單一材料電紡、共混電紡、同軸共紡及特殊制備法等。

單一材料電紡是指以單種高分子聚合物為電紡材料，存在降解快、生物相容性差等問題，難以適應臨床需求。

以上兩種均為傳統電紡方法，所制備的血管支架是單層結構，缺乏部分生理及力學功能。同軸共紡由傳統方法改進而來[21]，其特點為兩種或兩種以上的電紡材料形成的納米纖維呈“殼-芯”結構。該方法沿用了傳統方法的原理，但是在制作工藝上模仿了人體正常血管內、中、外膜的三層結構，將互不相溶的芯層和殼層材料溶液分別裝入不同注射器中，利用噴絲系統中兩個同軸的毛細管，使其以適當的流速通過該噴絲裝置，殼層液體流出與芯層溶液匯合，形成同心分層流，在同一電壓下通過同軸靜電紡絲得到“殼-芯”結構納米纖維[22]。Zhang等[12]利用同軸共紡法制備了膠原-PCL殼-芯納米纖維支架，體外實驗對比發現，該結構支架可促進細胞黏附增殖，具有良好的機械性能，其結構更加接近于天然的ECM。

除了上述一些常見的合成方法外，還有一些研究探索了種子細胞接種與支架合成相結合的方法。Wagne等[23]在電紡制備納米纖維血管支架的同時，將細胞懸液通過電噴霧直接種植于支架表面。還有的研究在兩層電紡支架中種植一層細胞，重復進行，形成支架-細胞-支架結構的多層電紡血管支架。Vaz等[13]應用層-層電紡技術，將PCL和PLA組成雙層血管支架（長2 cm，內徑6 mm，約600 μm厚）。外層由強度較硬、規則排列的PLA纖維組成，模擬血管的外纖維層，內層由彈性較強、排列不規則的PCL纖維構成。通過模擬正常血管的形態和力學特性，有效地提高了TEBV的機械強度。

3　小口徑電紡TEVGs的表面修飾

為了給細胞提供更加適宜的生長環境，除了要設計好支架的直徑、材料和結構外，還需要對支架進行表面修飾，即在支架的表面添加一定的物質來增加細胞的黏附、促進細胞增殖和分化。支架表面與細胞直接接觸，可對細胞應答和組織修復產生影響，因此表面修飾已成為支架制備中不可或缺的步驟之一。長久以來，一些小口徑血管支架研究未能達到預期的主要原因就在于移植后血管內血栓引起血管再狹窄，支架的表面修飾在一定程度上可以解決該問題。

現已建立了多種表面接種與表面修飾技術，包括將各種細胞因子，如血管內皮細胞生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、血小板衍生因子（PDGF）、黏附多肽及一些氨基酸殘基序列（RGD序列，Arg-Gly-Asp）等結合于支架表面，增強種子細胞的黏附、生長及組織構建能力[24]。不同的細胞因子的作用不盡相同，其中VEGF支架可有效促進支架表面細胞的內皮化，PDFG支架趨化中性粒細胞與成纖維細胞，參與血管的形成，RGD序列蛋白支架可通過促進血管內皮細胞的黏附，模擬生理條件下的血管內層功能。此外，通過內皮化或肝素化可使支架具有一定的抗凝功能。內皮化是將內皮細胞黏附于支架表面，加速支架結構內皮化進程，使血管保持通暢從而防止血栓形成[25]。使用抗凝藥物肝素或其類似物固定于支架材料表面可以抑制血管阻塞。對不同的實驗或臨床研究，選用合適的表面修飾物質進行篩選和鑒定，在保證安全性的基礎上使材料的效果達到最佳。

4　小口徑電紡TEVGs的評價

植入體內的組織工程血管支架必須滿足以下基本條件：無毒副作用、無刺激性、無致敏性，對人體各系統無潛在損傷且性能穩定。理想的電紡小口徑血管支架則要經過一系列生理和機械性能評價，符合一定標準后才能作為移植物在人體中使用。

4.1生理功能評價

4.1.1生物相容性

生物相容性包括組織相容性和血液相容性，一般認為材料的生物相容性與植入體內的安全性成正比。在制備血管支架后，有必要設計科學、合理而又準確的實驗，對支架的生物相容性進行統一的評價。評價主要包括形態學觀察，膠原蛋白、肌動蛋白、肌鈣蛋白和肌球蛋白表達量測定，細胞間黏連分子、層黏連分子表達測定，von-Willebrand因子、血小板內皮細胞黏附因子和組織因子受體檢測，細胞外基質蛋白釋放能力、細胞活性和新陳代謝評估等[26]。

4.1.2可降解性

組織工程血管的支架材料需要具備生物降解能力。在理想狀態下，支架整體降解速度應與移植組織的再生速度基本一致，這樣才能保證完整的組織再生。對于小口徑血管，支架在血管內皮化完成后降解可以保持正常血管的結構完整和內環境穩定，降低支架內壁形成血栓的風險。PLA、PGA和PLGA等聚合物降解周期較長，在小口徑人工血管支架中具有一定優勢。

4.2機械性能評價

4.2.1孔徑及孔隙率

小口徑人工血管支架的孔徑、孔隙率與排列方式等參數影響細胞的生物活性。當孔隙率達90%、孔徑為100～300 μm時，最有利于細胞黏附與基質合成。滲透性由支架的孔度及孔隙率決定，滲透性過大將增加術中血液滲漏的發生可能，并與術后血腫等并發癥密切相關，影響移植血管的愈合能力。

4.2.2機械強度

小口徑組織工程血管需要能夠承受一定的縫線牽張拉力和血液灌注壓力，要求血管支架具備一定的機械強度。機械強度應包括軸向拉伸強度、血管爆破強度及縫合強度。因小口徑組織工程血管的直徑等理化參數不一，目前對支架機械強度各項指標并未形成統一的標準。

軸向拉伸強度：體內正常血管在承受血壓波動時（約80～ 120 mmHg）易發生形變，分別為軸向形變與圓周形變，軸向形變通常代表血管支架的軸向拉伸強度。爆破強度：爆破強度是指連續通過液體或空氣對血管支架施加壓力，測得的樣本突然破裂時的最大壓力。主要方法有薄膜劈裂強度法、探頭破裂強度法和加壓破裂強度法等。其中最常用的方法為加壓法，可以直觀、真實地反映移植入體內的血管的抗壓能力?？p合強度：移植的人工血管與體內正常血管的成功吻合需要手術縫線縫合完成，因此兩者縫合邊緣必須能夠抵抗術中縫線的牽拉而不出現破漏或破損。測量方法為沿軸向截取一段支架，將其一端拉直，以縫線在樣品另一端的邊緣內2 mm處穿過，縫線以50～200 mm/min的速度拉伸，記錄縫線拉出致使血管壁損傷的拉力大小及縫線尺寸。

4.3順應性

順應性是指在正常舒張壓下，人工血管管腔內壓力作用引起的管壁擴張程度。組織工程血管支架順應性過小會限制血流通過，造成血管管腔內狹窄，導致移植失敗[27]。

5　小口徑電紡TEVGs的挑戰

組織工程血管的迅速發展，為臨床組織缺損及血管損害的修復提供了更好的選擇。靜電紡絲技術在生物工程領域的不斷深入，為小口徑人工血管的合成提供了新的方法。目前組織工程血管主要應用于心外科或血管外科，多使用單根大血管的替換。創傷修復與局部器官移植、再造中，需要小口徑的血管替代物，通過電紡技術合成支架，選取來源合適的細胞作為種子細胞，可嘗試構建適宜的血管移植物。目前在電紡技術應用過程中仍存在一些需要解決的問題：如何進一步提高支架的表面性能，減少對種子細胞黏附與增殖的負面影響；如何設計和選擇不同種子細胞種植時的相應最佳孔隙率；支架內機械強度、降解速率的優化與平衡等。隨著電紡技術在組織工程領域中的不斷發展與進步，會有更多性能優良的支架結構和合成方法出現，對促進小口徑組織工程血管的構建并最終用于臨床提供幫助。

參考文獻

[1]Hong Y,Ye SH,Nieponice A,et al.A small diameter,fibrous vascular conduit generated from a poly(ester urethane)urea and phospholipid polymer blend[J].Biomaterials,2009,30(13):2457-2467.

[2]Formhals A.Process and apparatus for preparing artificial threads: US,1975504[P].1934-10-02.

[3]Lee SJ,Yoo JJ.Guidance of cell attachment,migration,and alignment on electrospunnanofiber scaffolds.//Khang G.The handbook of intelligent scaffold for regenerative medicine[M]. Singapore:Pan Stanford Publishing Ltd,2012:201-218.

[4]Wang D,Liu H,Fan Y.Silk fibroin for vascular regeneration[J]. Microsc Res Tech,2015,[Epub ahead of print].

[5]Catto V,Farè S,Cattaneo I,et al.Small diameter electrospun silk fibroin vascular grafts:Mechanical properties,in vitro biodegradability,and in vivo biocompatibility[J].Mater Sci Eng C Mater Biol Appl,2015,54:101-111.

[6]Soffer L,Wang X,Zhang X,et al.Silk based electrospun tubular scaffolds for tissue engineered vascular grafts[J].J Biomater Sci Polym Ed,2008,19(5):653-664.

[7]Marelli B,Alessandrino A,Farè S,et al.Compliant electrospun silk fibroin tubes for small vessel by-pass grafting[J].Acta Biomater,2010,6(10):4019-4026.

[8]Boland ED,Matthews JA,Pawlowski KJ,et al.Electrospinning collagen and elastin:preliminary vascular tissue engineering[J]. Front Biosci,2004,9:1422-1432.

[9]Venkatraman S,Boey F,Lao LL.Implanted cardio vascular polymers:Natural,synthetic and bioinspired[J].Prog Polym Sci, 2008,33(9):853-874.

[10]Mo XM,Xu CY,Kotaki M,et al.Electrospun P(LLA-CL) nanofiber:A bio-mimetic extracellular matrix for smooth muscle cell and endothelial cell proliferation[J].Biomaterials,2004,25 (10):1883-1890.

[11]Pektok E,Nottelet B,Tille JC,et al.Degradation and healing characteristicsofsmalldiameterpoly(caprolactone)vascular grafts in the rat systemic arterial circulation[J].Circulation, 2008,118(24):2563-2570.

[12]Zhang YZ,Venugopal J,Huang ZM,et al.Characterization of the surface biocompatibility of the electrospun PCL-collagen nanofibers using fibroblasts[J].Biomacromolrcules,2005,6(5):2583-2589.

[13]Vaz CM,Tuijl SV,Boutea CV,et al.Design of scaffolds for blood vessel tissue engineenng using a multi-layering electrospanning technique[J].Acta Biomater,2005,1(5):575-582.

[14]Inoguchi H,Kwon IK,Inoue E,et al.Mechanical responses of a compliant electrospun poly(L-lactide-co-ε-capro lactone)smalldiameter vascular graft[J].Biomaterials,2006,27(8):1470-1478.

[15]Stitzel J,Liu J,Lee SJ,et al.Controlled fabrication of a biological vascular substitute[J].Biomaterials,2006,27(7):1088-1094.

[16]Smith MJ,McClure MJ,Sell SA,et al.Suture-reinforced elctrospun polydioxanone-elsstin small-diameter tubes for use in vascular tissue engineering:A feasibility study[J].Acta Biomater,2008,4 (1):58-66.

[17]Lee SJ,Liu J,Oh SH,et al.Development of a composite vascular scaffolding system that withstands physiological vascular conditions [J].Biomaterials,2008,29(19):2891-2898.

[18]Wang SD,Zhang YZ,Wang HW,et al.Fabrication and properties of the electrospun polylactide/silk fibroin-gelatin composite tubular scaffold[J].Biomacromolecules,2009,10(8):2240-2244.

[19]McClure MJ,Sell SA,Simpson DG,et al.A three electrospun matrix to mimic native arterial architecture using poly caprolactone, elastin,and collagen:A preliminary study[J].Acta Biomater, 2010,6(7):2422-2433.

[20]向萍,李敏.靜電紡絲制備小直徑血管支架[J].材料導報,2011,25 (3):132-135.

[21]Sun Z,Zussman E,Yarin AL,et al.Compound core-shell polymer nanofibers by co-electrospinning[J].Adv Mater,2003,15(22): 1929-1932.

[22]Su Y,Li X,Liu Y,et al.Encapsulation and controlled release of heparin from electrospun poly(L-Lactide-co-epsilon caprolactone) nanofibers[J].Biomater Sci Polym Ed,2011,22(1-3):165-177.

[23]Stankus JJ,Soletti L,Fujimoto I,et al.Fabrication of cell microintegrated blood vessel constructs through electro hydrodynamic atomization[J].Biomaterials,2007,28(17):2738-2746.

[24]Crombez M,Chevallier P,Gaudreauh RC,et al.Improving arterial prosthesis neo-endothelialization:application of a proactive VEGF construct onto PrFE surfaces[J].Biomaterials,2005,26(35):7402-7409.

[25]李桂瓊,陳慶偉.內皮祖細胞移植策略研究進展[J].心血管病學進展,2011,32(3):411-414.

[26]竇皓,左保齊.靜電紡絲法構建小口徑人造血管的研究進展[J].現代絲綢科學與技術,2012,27(5):203-207.

[27]Nezarati RM,Eifert MB,Dempsey DK,et al.Electrospun vascular grafts with improved compliance matching to native vessels[J]. Biomed Mater Res B Appl Biomater,2015,103(2):313-323.

【中圖分類號】Q813.1+2

【文獻標識碼】B

【文章編號】1673－0364（2016）03－0191－04

doi:10.3969/j.issn.1673-0364.2016.03.014

基金項目：首都臨床特色應用研究（Z12110700100000）。

作者單位：100144北京市中國醫學科學院北京協和醫學院整形外科醫院整形七科。

通訊作者：何樂人（E-mail：heleren@sina.com）。

收稿日期：（2016年2月16日；修回日期：2016年4月20日）

Research Progress in Small-Diameter Tissue Engineering Blood Vessel Grafts by Electrospinning

YANG Jinxiu,HE Leren.The Seventh Plastic Department,Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100144,China.Corresponding author:HE Leren(E-mail:heleren@sina.com).

【Summary】The preparation of small-diameter blood vessels is an important part in the field of tissue engineering blood vessels,which has strong practicability in clinic.Synthesis of small-diameter vascular grafts is the basic of the construction of small-diameter artificial blood vessels.Electrospinning is a new technology of tissue engineering preparations.It can use a high voltage electrostatic field to produce micron grade even the nanoscale fibers.And through a series of processing,making the grafts simulate to extracellular matrix,cell adhesion and proliferation can be stimulated.In this paper,the materials, preparation technics,surficial decorations and evaluation system of the small-diameter tissue engineering blood vessel grafts were all reviewed.

【Key words】Electrospinning;Tissue engineering blood vessel;Grafts;Small-diameter