3種苯胺類對斑馬魚的急性毒性

裘麗萍++范立民+劉琦++陳家長

摘要：為研究N，N-二甲基苯胺、2，4-二甲氧基苯胺、2-甲氧基-6-甲基苯胺對斑馬魚的急性毒性，以斑馬魚（Brachydanio rerio）為試驗生物，采用靜態試驗法，參照《水和廢水監測分析方法（第四版）》中有關急性毒性的方法測定3種藥物對斑馬魚的急性毒性LC50。結果表明，N，N-二甲基苯胺、2，4-二甲氧基苯胺、2-甲氧基-6-甲基苯胺對斑馬魚96 h的半數致死質量濃度LC50分別為66.08、146.15、76.82 mg/L，安全質量濃度分別為6.61、1461、7.68 mg/L。

關鍵詞：苯胺類；急性毒性；斑馬魚；安全質量濃度

中圖分類號： S941.91文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0325-03

收稿日期：2015-05-05

基金項目：國家水產品質量安全風險評估項目（編號：GJFP2014009）。

作者簡介：裘麗萍（1977—），女，黑龍江雙鴨山人，助理研究員，主要從事漁業環境保護研究。E-mail：qiulp@ffrc.cn。

通信作者：陳家長，碩士，研究員，碩士生導師，主要從事漁業生態環境監測與保護、養殖環境修復、健康養殖、生態環境評價等研究。E-mail：chenjz@ffrc.cn。魚類是國際上常用于測試化學品毒性的物種。斑馬魚（Brachydanio rerio）別稱花條魚、藍條魚、斑馬擔尼魚，原產于印度、孟加拉國，由于斑馬魚擁有其他模式生物所不具備的優點，已被廣泛應用于生物學各領域[1-2]。

中國漁業產量連續多年居世界首位，但繁榮的同時卻陷入“漁業資源嚴重衰退，生態債臺高筑”的境地，漁業生態資本嚴重透支，漁業污染陷入難解的僵局。隨著工業經濟的快速發展，漁業污染事故的發生頻率呈上升趨勢，而工業廢水污染是漁業水域最嚴重的污染源[3-6]。目前，漁業生產中使用的農藥等對水生生物的毒性已引起廣大科技工作者重視，并進行了很多重要研究[7-9]。然而，可能導致漁業污染事故的化工產品對水生生物的毒性卻鮮有報道。N，N-二甲基苯胺、2，4-二甲氧基苯胺、2-甲氧基-6-甲基苯胺均是農藥、醫藥、染料重要的中間體，采用這3種化工產品對斑馬魚進行急性毒性試驗，判斷其對魚類的安全性，以期為苯胺類魚類污染事故的預防提供數據支持。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

N，N-二甲基苯胺（含量>99%）、2，4二甲氧基苯胺（含量>98%）、2-甲氧基-6-甲基苯胺（含量>98%）、助溶劑二甲亞砜（含量>98%）均購自上海市安譜科學儀器有限公司，由德國CNW科技公司生產。移液槍（Eppendorf公司產品）、METTLER AL204型電子分析天平、5 L玻璃圓形水槽。

1.2試驗材料

供試斑馬魚購自無錫市南禪寺花鳥魚市場，平均質量為（0.20±0.02） g，平均體長為（2.4±0.2） cm。試驗前對斑馬魚進行篩選，并在水族箱中馴養10 d以上，自然死亡率低于2%。馴養期間每天定時投顆粒餌料，試驗前1 d開始禁食，選擇活動性強的健康魚作為試驗用魚，試驗期間不喂食。試驗用水為曝氣3 d后除氯的自來水，pH值為7.02～7.06，總硬度為8.10～8.15（德國度），水質溶氧量含量保持在5 mg/L以上。水中Zn、Fe含量分別為0.02、0.05 mg/L，Pb、Cu、Cd均未檢出。水質化學需氧量（COD）為2.05～2.25 mg/L，水溫為（27±1）℃。

1.3試驗設計

按照國家環境保護總局等編著的《水和廢水監測分析方法（第四版）》[10]中有關急性毒性的方法進行測定。通過預備試驗分別獲得N，N-二甲基苯胺、2，4-二甲氧基苯胺、2-甲氧基-6-甲基苯胺致受試魚100%存活的最高質量濃度、致受試魚100%死亡的最低質量濃度，并在兩者間選擇下一步正式試驗的濃度范圍，確定5個試驗質量濃度組。試驗期間不喂食、不充氧。前8 h連續觀察，記錄魚的反應情況并及時撈出死亡個體；分別于24、48、72、96 h觀察魚的死亡情況并記錄。如果魚的腹部向上，鰓蓋停止運動，用玻璃棒或鑷子反復輕擊魚的尾部均不產生任何應激反應，即判定死亡。

1.3.1N，N-二甲基苯胺對斑馬魚的急性毒性向盛有3 L曝氣自來水的圓形玻璃水槽中加入N，N-二甲基苯胺儲備液，使水中N，N-二甲基苯胺的質量濃度分別為50、60、65、70、80 mg/L。將水體攪拌均勻，放入10尾健康的受試斑馬魚，進行96 h的觀察記錄。每個質量濃度設3個平行組，并設空白對照組、助溶劑對照組。

1.3.22，4-二甲氧基苯胺對斑馬魚的急性毒性向盛有 3 L 曝氣自來水的圓形玻璃水槽中加入2，4-二甲氧基苯胺儲備液，使水中2，4-二甲氧基苯胺的質量濃度分別為120、140、165、170、185 mg/L。將水體攪拌均勻，放入10尾健康的受試斑馬魚，進行96 h的觀察記錄。每個質量濃度設3個平行組，并設空白對照組、助溶劑對照組。

1.3.32-甲氧基-6-甲基苯胺對斑馬魚的急性毒性向盛有3 L曝氣自來水的圓形玻璃水槽中加入2-甲氧基-6-甲基苯胺儲備液，使水中2-甲氧基-6-甲基苯胺的質量濃度分別為60、70、80、85、90 mg/L。將水體攪拌均勻，放入10尾健康的受試斑馬魚，進行96 h的觀察記錄。每個質量濃度設3個平行組，并設空白對照組、助溶劑對照組。

1.4結果分析

根據各組試驗魚在24、48、72、96 h的死亡數計算平均死亡率，再轉化為概率單位，計算出試驗液質量濃度的對數。采用直線回歸法求出概率單位數與試驗液質量濃度對數的回歸方程，根據方程分別求出N，N-二甲基苯胺、2，4-二甲氧基苯胺、2-甲氧基-6-甲基苯胺在24、48、72、96 h對魚類的半致死質量濃度LC50和安全質量濃度[10]。

2結果與分析

2.1N，N-二甲基苯胺對斑馬魚的急性毒性試驗結果

在N，N-二甲基苯胺對斑馬魚的96 h急性毒性試驗期間，空白對照組、助溶劑對照組的受試斑馬魚全部存活，活動正常；50 mg/L質量濃度組的受試魚在試驗35 h后開始死亡，96 h死亡率為20%；60 mg/L質量濃度組的受試魚在試驗 30 h 后開始死亡，48 h死亡率為20%，96 h死亡率為30%；65 mg/L 質量濃度組的受試魚在試驗18 h后開始死亡，96 h死亡率為40%；70 mg/L質量濃度組的受試魚在試驗10 h后開始死亡，96 h死亡率為60%；80 mg/L質量濃度組的受試魚在試驗3 h后開始死亡，96 h死亡率為80%（表1）。由表1還可知，N，N-二甲基苯胺對斑馬魚24、48、72、96 h的半數致死質量濃度LC50分別為83.90、77.50、73.10、66.08 mg/L，安全質量濃度為6.61 mg/L。

2.22，4-二甲氧基苯胺對斑馬魚的急性毒性試驗結果

在2，4-二甲氧基苯胺對斑馬魚的96 h急性毒性試驗期間，空白對照組、助溶劑對照組的受試斑馬魚全部存活，活動正常；120 mg/L質量濃度組的受試魚在試驗40 h后開始死亡，96 h死亡率為20%；140 mg/L質量濃度組的受試魚在試驗30 h后開始死亡，48 h死亡率為20%，96 h死亡率為30%；165 mg/L質量濃度組的受試魚在試驗20 h后開始死亡，96 h死亡率為60%；170 mg/L質量濃度組的受試魚在試驗8 h后開始死亡，96 h死亡率為90%；185 mg/L質量濃度組的受試魚在試驗2 h后開始死亡，96 h死亡率為100%（表2）。由表2還可知，2，4-二甲氧基苯胺對斑馬魚24、48、72、96 h的半數致死質量濃度LC50分別為161.70、165.04、15865、146.15 mg/L，安全質量濃度為14.61 mg/L。

2.32-甲氧基-6-甲基苯胺對斑馬魚的急性毒性試驗結果

在2-甲氧基-6-甲基苯胺對斑馬魚的96 h急性毒性試驗期間，空白對照組、助溶劑對照組的受試斑馬魚全部存活，活動正常；60 mg/L質量濃度組的受試魚在試驗80 h后開始死亡，96 h死亡率為10%；70 mg/L質量濃度組的受試魚在試驗40 h后開始死亡，48 h死亡率為10%，96 h死亡率為20%；80 mg/L質量濃度組的受試魚在試驗20 h后開始死亡，96 h死亡率為40%；85 mg/L質量濃度組的受試魚在試驗 13 h 后開始死亡，96 h死亡率為80%；90 mg/L質量濃度組的受試魚在試驗7 h后開始死亡，96 h死亡率為90%（表3）。由表3還可知，2-甲氧基-6-甲基苯胺對斑馬魚24、48、72、96 h的半數致死質量濃度LC50分別為91.77、88.96、8420、76.82 mg/L，安全質量濃度為7.68 mg/L。

隨著時間的延長，各質量濃度組受試魚的死亡率均呈增加趨勢；在同一時間下，高質量濃度組受試魚的死亡率明顯高于低質量濃度組。可見，受試藥物對斑馬魚的毒性作用隨藥物暴露時間的延長及暴露質量濃度的增大而增強。

3討論

3.13種苯胺類藥物對斑馬魚的急性毒性級別判定

本研究使用的3種苯胺類藥物的24～96 h半致死質量濃度依次降低，表明3種苯胺類藥物對魚的毒性均隨藥物暴露時間的延長而增強。以96 h半致死質量濃度為評判對象，由魚類急性毒性分級標準[10]可知，N，N-二甲基苯胺、2-甲氧基-6-甲基苯胺均屬于中毒物質，2，4-二甲氧基苯胺屬于低毒物質。

3.23種苯胺類藥物對斑馬魚的毒性評價

由表4可知，在96 h試驗期間，N，N-二甲基苯胺、2，4-二甲氧基苯胺、2-甲氧基-6-甲基苯胺對斑馬魚表現出的毒性癥狀及毒性規律相似，96 h的LC50與安全質量濃度接近。可見，苯胺類化合物在苯環或氨基上引入甲基或甲氧基對其毒性影響不大，處理這類物質的漁業污染事故時可參考相似結構的化合物。

硝基苯等國內常用化工產品均會對受試魚類產生遺傳毒性[11]及對抗氧化應激酶（過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等）[12]造成影響，甚至具有強烈的致癌、致畸、致突變作用[13]。N，N-二甲基苯胺、2，4-二甲氧基苯胺、2-甲氧基-6-甲基苯胺是農藥、醫藥、染料重要的中間體，在農藥、醫藥、燃料的使用和生產過程中進入水體，可能殘留于水體中的魚類體內，進而危害機體。N，N-二甲基苯胺、2，4-二甲氧基苯胺、2-甲氧基-6-甲基苯胺長期暴露對魚類是否產生毒害，及其分子生物學機制有待進一步研究。

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