一例副豬嗜血桿菌病的綜合診斷

黃銀云++胡新崗++郭廣富++徐婷婷

摘要：以蘇北地區某個體豬場疑似副豬嗜血桿菌感染的病豬為對象，從流行病學調查、臨床癥狀觀察、病理變化剖檢、病原菌株分離鑒定、藥敏試驗等多方面和多手段開展綜合診斷，確診為副豬嗜血桿菌病。

關鍵詞：副豬嗜血桿菌；分離；鑒定；PCR

中圖分類號： S858.28文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0333-02

收稿日期：2015-05-04

基金項目：江蘇省高校“青藍工程”。

作者簡介：黃銀云（1977—），女，江蘇泰州人，碩士，副教授，從事動物疫病防控研究及動物醫學教學工作。E-mail：gxh008@qq.com。副豬嗜血桿菌病是由豬上呼吸道常在菌副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，Hps）引起的一種豬細菌性傳染病，該病由德國專家格拉澤氏（Glasser）于1910年首次報道，故也被稱為豬格氏病（Glasser disease）[1]。副豬嗜血桿菌病常見于 5～8周齡斷奶后及保育階段的豬，發病率約為15%，病豬臨床主要表現為消瘦、發熱、呼吸困難、咳嗽、跛行、共濟失調等，剖檢病變主要為纖維素性胸膜炎、心包炎、關節炎、腦膜炎。臨床上該病多繼發于豬圓環病毒病、豬繁殖與呼吸綜合征或與其混合感染，病死率可達50%，對仔豬和青年豬構成了極大威脅。隨著世界養豬業的規模化、集約化發展，該病已成為嚴重危害養豬業而備受關注的典型細菌性傳染病之一[2-4]。本試驗結合臨床病例開展了副豬嗜血桿菌病的動物流行病學、病原學、病理學、分子生物學綜合診斷實踐，以期為養豬生產中及時有效地診斷與監控該病提供可行方法。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病料無菌采集蘇北地區某個體豬場疑似副豬嗜血桿菌病病豬具有典型病變的心包液、胸膜積液、肺組織。

1.1.2培養基與主要試劑胰酪胨大豆瓊脂培養基（TSA-YE）、胰蛋白胨大豆酵母肉湯培養基（TSB-YE）為紹興天恒生物科技有限公司產品。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、微量生化反應管、藥敏紙片購自杭州微生物試劑公司。PCR反應試劑由寶生物（大連）有限公司提供，細菌DNA抽提試劑盒為上海生工生物工程技術服務有限公司產品。

1.2方法

1.2.1流行病學調查通過查看豬場養殖檔案，掌握豬場的免疫程序、消毒措施、用藥情況、治療效果等，約談豬場工作人員以了解豬群日齡、進場時間、發病時間、飲食情況、管理水平。深入豬舍進行群體觀察和個體檢查，調查豬場周圍環境及當地氣候變化，為副豬嗜血桿菌病的正確診斷提供流行病學依據。

1.2.2臨床癥狀觀察重點觀察患豬的發育情況、呼吸狀態、行走姿態、體表顏色、關節形態等有無異常。

1.2.3病理剖檢常規剖檢病死豬，重點觀察肝臟、脾臟、心臟、肺臟、腎臟、淋巴結有無異常，胸腔有無積液、纖維素性滲出物，關節有無積液。

1.2.4細菌分離培養無菌采集心包液、胸水、腹水及肺、脾的病變組織，分別劃線接種于添加NAD的TSA培養基、不添加NAD的TSA及TSB培養基，燭缸法37 ℃下培養18～24 h。

1.2.5組織觸片鏡檢無菌采集心血、胸水、腹水、肺組織制作抹片或觸片，革蘭氏染色并鏡檢。

1.2.6衛星現象觀察挑取分離菌純培養物水平劃線接種于TSA培養基，再挑取金黃色葡萄球菌于培養基中央垂直劃1條線，置于37 ℃下培養48 h，觀察培養結果。

1.2.7分離株生化試驗將分離菌株純培養物分別接種于預加入5 μL 0.01% NAD的麥芽糖、葡萄糖、半乳糖、棉籽糖、蜜二糖、L-阿拉伯糖、乳糖、蔗糖、木糖、果糖、核糖、吲哚、接觸酶、氧化酶、脲酶等微量生化反應管[5]，以燭缸法于37 ℃下培養48 h，觀察結果。

1.2.8PCR引物設計根據文獻[6]中的方法，按照副豬嗜血桿菌16S rRNA的基因序列合成1對引物，目的基因片段大小為822 bp，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。上游引物序列為：5′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3′；下游引物序列為：5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′。

1.2.9PCR檢測PCR反應體系共25 μL：上下游引物各 1.0 μL（均為10 pmol/μL）、菌液2.0 μL、MgCl2 1.5 μL（25 mmol/L）、緩沖液2.5 μL（不含Mg2+）、dNTPs混合物 2.0 μL（2.0 mmol/L）、Taq DNA聚合酶1.5 U，余量為超純水。PCR反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。試驗設有陰性及陽性對照。對PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.10紙片擴散法藥敏試驗取適量分離菌株的TSB純培養物，均勻涂布于含NAD的TSA固體培養基平板。將選取的20種藥敏紙片貼于平板內，每皿貼5種，以燭缸法于 37 ℃ 下培養48 h，觀察結果。抑菌圈直徑大于15 mm為高度敏感，小于10 mm為不敏感或耐藥，兩者間為中度敏感。

2結果與分析

2.1流行病學調查結果

該豬場飼養商品豬400余頭，多批次引進導致豬體質量大小不一。2015年3月進欄80余頭，從未接種過疫苗，閹割約3 d后接種了豬瘟、口蹄疫疫苗，隨即發病。病豬起初表現為發熱、厭食、皮膚發紅，之后皮膚發紫、干裂起痂皮；5 d左右波及全群，病豬體質量減輕，嚴重者體質量下降可達15 kg，至送檢時發病率達80%以上，死亡率約為35%。采用替米考星、氟苯尼考等藥物進行治療，效果不明顯。

2.2臨床癥狀

臨床檢查可見病豬被毛粗亂、精神沉郁、食欲不振或廢食、體溫升高至40 ℃以上，部分病豬腹瀉或便秘。發病豬頭頸、腹下、尾部皮膚發紅（圖1），部分病豬的耳尖至耳背面、腹下、臀部、尾部皮膚發紺或干裂起痂（圖2），后肢關節腫大、癱瘓、伏臥不走。病豬消瘦、頻繁咳嗽，以腹式呼吸為主。

2.3病理剖檢變化

胸腔大量積液呈淡黃色，心包積液、擴張，心包壁層附著纖維素性滲出物，形成“絨毛心”（圖3）。肺臟廣泛性肉變，肺間質增寬，彈性變差（圖4）。腫大的關節內有較多淡黃色液體（圖5）。腸系膜淋巴結腫大、出血、壞死。脾臟腫大，呈暗紅色（圖6）。

2.4細菌培養特性

添加NAD的TSA平板上形成的菌落呈針尖狀，邊緣齊整、圓形隆起、光滑濕潤、無色透明，直徑約為1 mm；未添加NAD的TSA平板上不生長或生長不良。TSB中含NAD時，肉湯均勻渾濁，反之則肉湯透明。可見，該菌株對NDA具有依賴性。

2.5分離菌株的形態特點

分離菌株革蘭氏染色呈陰性，菌體散在或成雙、成鏈，形態不一。菌體細小，呈短小桿菌。

2.6衛星現象

TSA平板上可見金黃色葡萄球菌線兩側有透明的灰白色露珠樣菌落，距線越近菌落越大，距線越遠菌落越小，呈典型的“衛星現象”。分離菌株的生長對金黃色葡萄球菌產生的NAD（V因子）具有依賴性，符合副豬嗜血桿菌的生長特點。

2.7分離菌株的生化特點

分離菌株的生化反應結果見表1。該結果符合副豬嗜血桿菌的生化特性。

2.8PCR檢測結果

以分離菌株的抽提DNA為模板進行PCR檢測，得到副豬嗜血桿菌目的基因片段，片段大小為822 bp（圖7），與預期結果相符。

2.9藥敏試驗結果

分離菌株對頭孢噻呋、頭孢他啶、頭孢唑啉、頭孢噻吩、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢曲松高度敏感，對強力霉素、丁胺卡那、安普霉素、紅霉素、慶大霉素、四環素中度敏感，對青霉素G、氨芐西林、鏈霉素、替米考星、氟苯尼考、復方新諾明、新霉素均不敏感。

3結論與討論

副豬嗜血桿菌定居于豬上呼吸道，屬于條件性致病菌，有15個以上血清型[7]。臨床上須對患豬全身各病變部位廣泛采樣，才能準確診斷該病。該豬場對仔豬群體閹割時不重視消毒，閹割后幾天內進行疫苗接種，造成仔豬抵抗力下降，進而感染發病。該豬場引入的苗豬質量不一，混群飼養，給防疫造成了很大困難，且發病時未及時隔離病豬，自行診斷用藥，這不僅是缺乏防疫意識的表現，也是使豬場發病率高達80%的重要原因。應執行自繁自養、全進全出制度，每購進一批苗豬必須隔離飼養并觀察一段時間，確認無傳染性疫病、不攜帶病原后方可混群飼養。進豬的首周內循序漸進更換飼料，加強飼養管理，嚴格進行預防性消毒，減少應激因素，使豬充分適應新環境。待豬完全適應并恢復正常生活后再進行閹割、接種等工作。

副豬嗜血桿菌病屬于細菌性傳染病，理論上診斷該病最有效、最準確的方法為分離鑒定菌株。然而，副豬嗜血桿菌對營養的要求較高[8]，故分離成功率一般不高；病豬是否用藥也有很大影響，使用過抗生素的病豬病原分離率較低；在實踐中，分離副豬嗜血桿菌的技術要求較高，耗時耗材。PCR技術具有快速、準確、靈敏度高、可靠性強的特點，在疫病診斷中輔以PCR檢測可極大提高準確率。

臨床治療副豬嗜血桿菌病時，應避免盲目、超劑量、單一長期用藥，最好于發病早期進行藥敏試驗，選擇高敏藥物并全群按療程注射給藥，避免治療不徹底及過度治療。如果藥物用足療程仍不見效，應及時更換藥物，西藥無效時可嘗試中藥治療。臨床用藥要有整體觀念，治療副豬嗜血桿菌病時，采用抗生素消滅細菌是手段，使豬康復是根本目的；因此，治療時須綜合考慮抗菌、抗炎、抗過敏、退熱、防脫水、維持機體水鹽平衡各個方面，以獲得良好的臨床效果。

參考文獻：

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