小鼠口服五氯柳胺混懸劑的急性毒性研究

張吉麗++司鴻飛++李冰++程富勝++周緒正+張繼瑜

摘要：通過進行小鼠急性毒性試驗，對五氯柳胺混懸劑的安全性進行初步評價。預試驗采用遞增法確定給藥的劑量范圍、正式試驗分組以及組距等。正式試驗按照簡化寇氏法進行，觀察給藥后小鼠的體征變化，統計死亡率，記錄死亡時間，計算五氯柳胺混懸劑的半致死劑量（LD50）以及95%的可信限。結果表明，小鼠口服五氯柳胺混懸劑的LD50值為1.679 g/kg，95%的置信區間為1.439～1.947 g/kg，按照化學物毒性分級可得：五氯柳胺混懸劑為低毒物質。

關鍵詞：五氯柳胺混懸劑；小鼠；急性毒性試驗；半致死劑量（LD50）

中圖分類號： S855.9文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0340-02

收稿日期：2016-01-14

基金項目：國家科技支撐計劃（編號：2015BAD1101）；國家現代農業產業技術體系專項（編號：CAR-38）。

作者簡介：張吉麗（1992—），女，黑龍江大慶人，碩士，研究方向為動物抗寄生蟲藥。E-mail：zhangjlzjl@sina.com。

通信作者：張繼瑜，研究員，博士生導師，研究方向為獸醫藥理學與毒理學。E-mail：infzjy@sina.com。五氯柳胺是廣譜高效的水楊酰苯胺類化學合成抗寄生蟲藥物，主要用于治療牛、羊的肝片吸蟲感染，在抗絳蟲、線蟲等方面也具有較好的治療效果[1]。自20世紀中后期報道其抗蟲活性后，國外對其進行了大量研究，并相繼報道了五氯柳胺在臨床試驗中顯著的治療效果[2-3]。國內并未對其進行系統性研究，相關報道較少。因其水溶性差，有一定的毒性，限制了其臨床應用。五氯柳胺混懸劑，克服了五氯柳胺的難溶性，且性質穩定、質量可控、治療效果確切，本研究采用改良寇氏法進行小鼠的急性毒性試驗，從而評價五氯柳胺混懸劑的安全性。

1材料與方法

1.1試驗動物

SPF級昆明系小鼠110只，購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所。體質量在18～22 g之間，雌雄各半，雌性未產未孕。試驗前飼養3～5 d，自由飲水覓食，以適應試驗環境。

1.2供試藥品

五氯柳胺口服混懸劑，由中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所農業部新獸藥工程重點實驗室制備。試驗前，精確稱定處方中主藥及輔料，配制成0.209 g/mL的混懸劑，待用。按照處方中各輔料的用料配比，配制輔料對照組的濃度為 0.100 g/mL。

1.3預試驗

本試驗采用遞加法分別對五氯柳胺混懸劑組以及輔料對照組進行預試驗。

五氯柳胺混懸劑預試驗組：將20只SPF級昆明系小鼠，隨機分為5組，每組4只，雌雄各半，分別給小鼠稱體質量，計算給藥劑量。最高劑量組給藥量為3.375 g/kg體質量，最低劑量組給藥量為1.000 g/kg體質量。灌胃給藥，觀察7 d，記錄小鼠的死亡數，確定最小致死劑量（LD100）和最大耐受劑量（LD0）。從而確定正式試驗組數（N）以及各組間劑量比（r）。

輔料對照組預試驗同樣采用20只SPF級昆明系小鼠，雌雄各半，隨機分為5組，每組4只，分別給小鼠稱體質量，計算給藥劑量。最高給藥劑量為5.000 g/kg體質量，最低給藥劑量為1.000 g/kg體質量。記錄死亡數，確定最小致死劑量（LD100）和最大耐受劑量（LD0）。

1.4正式試驗

根據預試驗得到的最小致死劑量（LD100）和最大耐受劑量（LD0），采用簡化寇氏法計算正式試驗組數（N）以及各組間劑量比（r）。由于輔料試驗的LD100值大于5.000 g/kg體質量，將小鼠樣本量增至10只，雌雄各半，仍未出現死亡現象，按照化學藥物毒性分級，可以得到結論：混懸劑輔料實際無毒。

根據五氯柳胺混懸劑預試驗結果將正式試驗分為6組，包括空白對照組和5個不同劑量試驗組。將60只小鼠，雌雄各半，體質量為18～22 g，隨機分為6組，試驗組的給藥劑量為：3.375、2.488、1.836、1.355、1.000 g/kg體質量。空白對照組給予等量的飲用水。灌胃給藥，觀察7 d，觀察給藥后小鼠的外觀體征、采食狀況、行為活動等相關癥狀，記錄每組小鼠死亡數、死亡時間，并對死亡小鼠進行剖檢，觀察病理變化。用改良寇氏法計算LD50以及95%的置信區間。

2結果與分析

2.1預試驗結果

由預試驗可得：輔料預試驗組的LD0大于5.000 g/kg，增加試驗動物數量至10只，仍未出現死亡現象，按照化學藥物的毒性分級可以視為混懸劑輔料實際無毒。

五氯柳胺混懸劑預試驗組的LD100為3.375 g/kg，LD0為1.000 g/kg。從而確定正式試驗的組數（N）為5。各組之間的劑量比值為r=1.355。由此將預試驗分為6組，其中包括不同劑量試驗組5組以及空白對照組。

2.2正式試驗結果

觀察給藥后動物表現出的癥狀為：給藥后出現精神沉郁、伏臥不動、眼睛微閉、被毛凌亂、食欲減退，給藥3.5 h后出現死亡現象，死亡時間集中在5～12 h，死亡前出現全身震顫、側翻現象，大約持續5 min死亡。剖檢未見明顯的病理變化。給藥36 h后，再無死亡現象，但高劑量組存活小鼠依然表現為精神沉郁，3 d后逐漸恢復飲食飲水。將存活小鼠體質量變化與空白組對比可以發現，給藥組小鼠增長緩慢。

五氯柳胺混懸劑試驗組的死亡數見表1，根據死亡情況計

算五氯柳胺口服混懸劑的LD50以及95%的可信度區間如下：

LD50=lg-1[Xm-i（∑p-0.5）]

Sx50=i（∑pq/n），

LD50的95%可信限=lg-1（lgLD50±1.96×Sx50）。

式中：Xm為最大劑量的對數；i為組距，相鄰兩組劑量對數值之差；p為各劑量組死亡率；q為各劑量組存活率；n為各組動物數；Sx50為lgLD50的標準誤差。

經計算得五氯柳胺口服混懸劑的LD50為1.674 g/kg，95%的可信度區間為1.439～1.947 g/kg。

3討論與結論

為了保證試驗動物本身清潔無污染，有效地消除試驗動物本身造成的試驗誤差，本研究選用SPF級昆明系小鼠。在整個試驗過程中，嚴格按照《獸藥研究技術指導原則匯編》中關于化學物急性毒性相關的試驗指導原則[4]進行。在給藥過程中，嚴格按照灌胃給藥的操作，以防由于灌胃方法不當導致小鼠死亡，影響試驗結果的準確性。

由于配制五氯柳胺混懸劑的母液濃度為0.209 g/mL，遵照《獸藥研究技術指導原則匯編》中關于小鼠受試物給藥體積的相關規定為：小鼠1次給藥量為每10 g體質量給藥量在0.1～0.2 mL之間。所以在給藥過程中，為了避免給藥體積過大，需要進行多次給藥，2次給藥時間間隔為1～2 h，1次給藥體積不得超過0.4 mL，防止小鼠因灌胃受試物的體積過大而撐死。

寄生蟲作為一類重要的病原，嚴重危害人類和畜禽的健康，造成了畜牧養殖業的重大損失。動物抗寄生蟲藥物是預防和治療寄生蟲類疾病、保障畜牧業健康發展和公共衛生安全的最有效手段。五氯柳胺是一種廣譜抗寄生蟲類化學合成藥物，是臨床抗寄生蟲的首選。為了滿足獸醫臨床對五氯柳胺的需求，本研究研制了五氯柳胺的口服混懸劑，并對其急性毒性進行了評價。由試驗結果可知：五氯柳胺口服混懸劑的LD50為1.674 g/kg，95%的可信度區間為1.439～1.947 g/kg，這為五氯柳胺混懸劑后續研究及臨床推廣奠定了基礎。

參考文獻：

[1]崔瑩. 驅蟲藥五氯柳胺的制備[J]. 現代商貿工業，2010，22（20）：300-300.

[2]Sanabria R，Moreno L，Alvarez L，et al. Efficacy of oxyclozanide against adult Paramphistomum leydeni in naturally infected sheep[J]. Veterinary Parasitology，2014，206（3/4）：277-281.

[3]Arias M S，Sanchis J，Francisco I，et al. The efficacy of four anthelmintics againist Calicophoron daubneyi in naturally infected dairy catlle[J]. Veterinary Parasitology，2013，197：126-129.

[4]農業部獸藥評審中心. 獸藥研究技術指導原則匯編[M]. 北京：化學工業出版社，2012