櫻桃谷肉雛鴨感染鴨瘟、副黏病毒的PCR鑒定與防控

胡新崗++黃銀云++吳雙++郭廣富

摘要：根據發病情況、臨床癥狀、病理變化，初診江蘇省泰州市某肉鴨養殖戶飼養的肉鴨群疑似感染鴨瘟，通過PCR方法鑒定該群病鴨混合感染鴨瘟病毒和副黏病毒，采取全群撲殺、徹底消毒、撲滅疫情等措施進行防治，并針對我國肉鴨養殖中鴨瘟、鴨副黏病毒病流行的新態勢提出具體的防控舉措。

關鍵詞：櫻桃谷雛鴨；鴨瘟；副黏病毒；PCR；疫情；防控

中圖分類號： S858.32文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0344-02

收稿日期：2015-03-26

基金項目：江蘇省高校“青藍工程”。

作者簡介：胡新崗（1974—），男，安徽宿州人，碩士，副教授，從事動物疫病防控研究及動物醫學教學工作。E-mail：gxh008@qq.com。鴨瘟（DP）別稱鴨病毒性腸炎，由鴨瘟病毒（DPV）引起，屬于急性、高致死性的病毒性傳染病，該病在我國廣大養鴨地區散在發生，不同齡期、性別、品種的鴨均可發生典型鴨瘟，臨床以蛋鴨、成年種鴨多見[1]。隨著我國肉鴨養殖業的不斷發展，鴨瘟在肉鴨群中的發病率明顯上升，未免疫鴨群的死亡率可達100%[2]。鴨副黏病毒病也被稱為鴨源新城疫，由禽副黏病毒Ⅰ型的鴨副黏病毒（DPMV）引起，屬于急性、高度接觸性傳染病[3]。在肉鴨養殖中，鴨瘟及鴨副黏病毒病的臨床病例報道不多，同一病例呈現鴨瘟病毒和副黏病毒混合感染的現象更無報道，筆者在工作中意外遇到了1例罕有病例，確診為櫻桃谷肉鴨混合感染鴨瘟和鴨副黏病毒病，鑒于目前我國肉鴨養殖業對這2種病的認識和重視程度不足，疫情防控缺乏經驗，特將案例報道如下。

1疫情調查

1.1發病情況

2014年4月，江蘇省泰州市某肉鴨養殖戶反映，其大棚飼養的2 000余羽13日齡櫻桃谷肉鴨于9日齡起感染發病，在臨床癥狀、病理變化等方面與鴨瘟相似，但考慮到10日齡左右的鴨苗不太可能會發生鴨瘟，因此未予重視，懷疑是細菌性傳染病，養殖戶自行購買氟苯尼考等多種抗菌藥物進行防治，使用效果不佳，每天死亡十幾羽至幾十羽不等，由于此前幾批鴨也有類似情況，為弄清病因，找到有效的防治措施，養殖戶請求江蘇農牧科技職業學院幫助診斷，此時鴨群死亡率已近70%。鴨主反映該鴨群系本地某鴨場繁育的鴨苗，未予接種任何疫苗，基本上不進行任何消毒。現場走訪可見鴨場管理不善，鴨舍環境臟亂，人員流動無阻。

1.2臨床癥狀及病理變化

發病鴨表現出采食減少或食欲廢絕、飲欲增加、運動失調、兩腿無力、行走時搖擺不穩、頭縮頸軟、角弓反張等神經癥狀。個體檢查可見病鴨流淚，眼有分泌物，腹瀉，排出淡綠色稀糞，泄殖腔黏膜充血。剖檢可見肝臟腫大，棕紅色，有灰白色、針頭大壞死灶，實質較脆，膽囊腫大，充滿較濃的墨綠色膽汁，心包液增量，心包膜增厚，纖維素性心包炎，纖維素性氣囊炎，氣囊上有塊狀纖維素性滲出物附著，脾臟腫大，表面斑駁呈大理石狀，氣管環充血、出血，腦膜充血、水腫，腸黏膜充血、出血，胰腺發炎、充血，胸壁有淡黃色膠樣滲出物。根據病理變化，結合發病過程及多種抗菌藥物療效不佳等情況，初步診斷為鴨瘟，懷疑感染副黏病毒。

1.3分子生物學診斷

1.3.1病料來自上述疑似感染鴨瘟病毒及副黏病毒且臨床癥狀及病理變化明顯病例的肝、脾、肺、胰等。

1.3.2常用分子生物學試劑病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，Murine RNase Inhibitor和HiScriptReverse Transcriptase 購自南京諾唯贊生物科技有限公司，2×Lamp MasterMix（含染料）購自康為世紀生物科技有限公司，6 nt隨機引物購自Fermentas公司。

1.3.3雙抗PBS的配制根據OIE推薦的配方略作調整，用pH值7.2的PBS溶液配制運輸液，溶液中抗生素劑量為：Penicilin （青霉素） 10 000 U/mL、Streptomycin （鏈霉素） 10 mg/mL，最后用10 mol/L NaOH溶液調節pH值為7.2。

1.3.4引物設計與合成根據EMBL/GenBank公布的3種病毒的相關基因序列，運用Primer Premier 5.0引物設計軟件設計4對引物，由上海英濰捷基生物技術有限公司，序列見表1。

1.3.5病毒的RNA、DNA提取將發生疑似病毒感染雛鴨器官病料剪碎研磨，加入預冷雙抗的PBS，反復凍融3次后經2 000～3 000 r/min離心10 min，每份吸取200 μL上清用于病毒基因組提取。根據病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書進行RNA、DNA提取，測其含量為720 μg/μL，用6 nt隨機引物進行反轉錄（65 ℃ 加熱5 min，迅速置于冰上驟冷，并靜置2 min），根據HiScript Reverse Transcriptase說明書進行反轉錄獲得病毒的cDNA（置PCR儀上反應，50 ℃ 45 min，85 ℃ 5 min）。

1.3.6基因片段的擴增根據2×Lamp MasterMix（含染料）說明書進行PCR擴增。PCR反應條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s；根據引物調整退火溫度，DPV、NDV、NDV-HN均為 55 ℃，DHV為50 ℃，72 ℃下延伸時間依次為 20 s、2 min、

1.2 min、30 s，30個循環；72 ℃ 5 min。PCR產物凝膠電泳檢測。

1.3.7基因片段的擴增結果對上述DNA和cDNA進行PCR擴增，電泳檢測發現，DPV和NDV-HN出現的條帶與預期結果一致（圖1）。PCR擴增結果確診該鴨群感染了鴨瘟病毒及副黏病毒。

2疫情處理方法

鑒于鴨瘟、鴨副黏病毒病均為嚴重危害肉鴨養殖的重要傳染病，建議立即全群撲殺剩余鴨，焚燒后深埋處理。從鴨棚移出各種生產用具，用0.02%二氯異氰尿酸鈉溶液、5%漂白粉溶液等浸泡洗刷。徹底清除鴨棚內的糞便、墊草、墊料及雜物，能焚燒的予以焚燒，不能焚燒的拌合生石灰粉后深埋。采用5%過氧乙酸、0.5%癸甲溴銨溶液交叉反復多次消毒地面及環境。按1 m3空間25 mL福爾馬林、12.5 mL水、25 g高錳酸鉀的比例進行鴨舍熏蒸消毒12～24 h，熏蒸消毒完成后，通風換氣，空舍2～4周后再引入鴨苗。疫苗免疫是控制鴨瘟流行的主要措施，肉鴨雖然飼養周期短，但免疫不能掉以輕心。據報道，鴨接種弱毒疫苗數小時后，即可不同程度地抵抗鴨瘟野毒的攻擊[4]。因此，為預防雛鴨感染鴨瘟，購買鴨苗時必須問清種鴨是否免疫鴨瘟活疫苗，以確定鴨苗體內的母源抗體情況，如種鴨未免疫鴨瘟活疫苗，則雛鴨必須盡早免疫。可在雛鴨1日齡時注射鴨瘟活疫苗，按瓶簽標明羽份，用生理鹽水稀釋，每羽腿肌或頸側皮下注射0.25 mL，免疫期1個月。也可嘗試用鴨瘟活疫苗按1 ∶ 5（1個免疫量溶于5 mL水中）進行飲水免疫，飲水免疫前應停止供水一段時間，增加鴨的飲欲，以便通過飲水快速攝入足夠的疫苗。建議免疫前進行環境徹底消毒，免疫后1周內不要進行環境消毒[5]。嚴格執行獸醫衛生制度，及時清除糞便及受污染的墊草墊料，及時通風換氣，保證空氣清新，定期消毒鴨舍、運動場、水池，勤清洗消毒水槽、料槽。疫情發生后，應每天全面消毒，直至撲滅疫情。發現病鴨及時隔離診治，盡量不自行用藥，應向當地獸醫部門求助，確保正確診斷、合理用藥。由于鴨瘟病毒能在耐過鴨體內形成潛伏感染并能復發，在感染后4年內仍能向外界排毒而成為傳染源[6]。鴨場發生鴨瘟疫情，撲殺病鴨是清除傳染源的重要手段。調查發現，肉鴨的發病死亡主要發生在2周齡以內，在此期間應注意通過飲水或拌料添加禽用多種維生素，以增強雛鴨的免疫力。如鴨群糞便不正常，可用0.02%高錳酸鉀液飲水或添加抗菌藥物，確保肉鴨健康快速生長、減少病死率、提高養鴨效益。

3結論與討論

通常水禽不能自然感染副黏病毒發病，即使強毒感染也不表現癥狀，但可從鴨、鵝等體內分離出病毒。胡北俠等在規模化養殖場種鴨副黏病毒帶毒監測研究中發現，健康肉用種鴨群在特定的時間副黏病毒帶毒率高達100%[7]。吳峻華在福建省福州市部分鴨場檢出鴨血清樣品副黏病毒抗體陽性率達28.7%，說明鴨副黏病毒感染情況呈現嚴峻態勢[8]。由于種蛋可以攜帶病毒，雛鴨早期發病可能主要與孵化及出雛過程中病毒污染有關。研究表明，人工感染鴨副黏病毒的肉鴨，雖然臨床癥狀不甚明顯，剖檢病變也較輕微，但會導致組織器官持續性嚴重病理損傷，是導致感染鴨群體質量、大小產生顯著發育差異的根本原因，副黏病毒隱性感染的疫情是鴨副黏病毒病的主要流行形式[9]。由此可以解釋本次疫情的2個現象：一是該批肉鴨按常規飼養卻出現體質量、大小具有明顯差異現象，二是鴨群并未表現出副黏病毒感染的明顯癥狀和典型病變。從而也可以推斷本次疫情由鴨瘟病毒感染主導，副黏病毒感染起到了促進發病、死亡的作用。

一般認為，鴨瘟多見于2月齡以上的成年鴨，特別是種鴨、成年蛋用鴨，由于肉鴨鴨瘟很少發生，沒能引起肉鴨飼養戶甚至基層獸醫技術人員的重視，從而造成該病暴發，給養鴨戶造成了較大的經濟損失[10]。因此，隨著肉鴨養殖業的發展和養殖方式的多樣化，生產上應加強肉鴨鴨瘟免疫預防。此外，肉鴨副黏病毒病危害已經比較嚴重，鴨副黏病毒病與雞新城疫疫苗毒株建的同源性較低，現有新城疫疫苗無法對鴨提供有效保護，因此有關方面應盡快制備針對鴨的副黏病毒疫苗，在無有效疫苗之前，肉鴨養殖只能采取“養、防、檢、治”的綜合防疫措施應對該病。

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