醬油中抗草甘膦大豆轉基因多種成分的檢測：實時熒光定量PCR和傳統PCR的比較

張文志++魯緋++閆紅

摘要：采用基于SYBR Green探針的實時熒光定量PCR方法和傳統PCR方法對醬油中的大豆轉基因靶基因CaMv35S啟動子、NOS終止子、EPSPS、18S進行了高通量檢測，同時檢測了內源參照Lectin基因。研究發現，醬油樣品中同時存在CaMv35S、NOS、18S靶基因，而不存在靶基因EPSPS，表明轉基因成分EPSPS在食品加工過程中已被降解；熔解曲線分析表明，實時熒光PCR對轉基因的檢測獲得了很好的特異性，與傳統PCR相比，具有快速、高通量、高選擇性、高靈敏度的優勢。本研究建立的對醬油中多種抗草甘膦大豆轉基因成分的快速、高通量、高靈敏的定量檢測方法將在轉基因食品的檢測領域具有很大的應用前景。

關鍵詞：PCR RT-PCR；檢測

中圖分類號： TS264.2+1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0372-05

收稿日期：2015-05-12

作者簡介：張文志（1990—），男，碩士研究生，研究方向為化學生物學分析。E-mail：170850483@qq.com。

通信作者：魯緋，博士，研究員。E-mail：lufeilufei515@sina.com。大豆已經成為人們生活中不可或缺的食物及食品原料，在我國用途非常廣泛，消費市場上大豆制品種類繁多。我國是大豆進口大國，根據資料統計，從開放大豆進口以來，我國每年大豆進口量逐年增加，到2014年我國大豆進口量已超過7 000萬t，且進口大豆中有超過90%為轉基因大豆[1-2]。

我國對于轉基因食品的監管工作非常重視。2001年，國務院頒布了《農業轉基因生物安全管理條例》，對大豆、玉米等國內流通的轉基因產品，規定了統一的標志制度，即確定了食品中轉基因成分的最低限標準[3]。然而，在轉基因食品飽受爭議的今天，我國的轉基因產品監控技術體系依然缺乏。較為落后的檢測設備和相關技術，使得安全評價及審批許可制度缺乏技術保障[4]，嚴重制約了我國對于轉基因產品的安全監管，也嚴重妨礙了廣大消費者對轉基因食品安全性的深入了解[5]。因此，建立可靠、準確、快速、高通量的食品轉基因成分檢測方法迫在眉睫。

傳統的轉基因成分檢測方法主要分為2類：酶聯免疫法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[6]和聚合酶鏈式反應法（polymerase chain reaction，PCR）[7]。分別以蛋白質和核酸為檢測對象。ELISA目前已有商業化試劑盒，它通過間接地檢測轉基因成分表達出的蛋白來推測轉基因成分，雖然其具備很好的選擇性，但缺乏定量準確性，且價格較為昂貴，樣品前處理復雜。傳統的PCR方法直接以提取的基因片段為檢測對象，靈敏度好，但定量能力較差，且非目標片段容易引起信號的假陽性和假陰性。在傳統PCR原理的基礎上，巢式PCR[8]、多重PCR[9]等方法也發展起來，其選擇性和準確性得到很大提高，但仍然是半定量的方法。

實時熒光定量PCR[10]是一種可以特異性靶標樣品中的目標DNA片段，并輸出該目標DNA定量信息新方法，相對于上述方法，這種方法的定量信息更準確，方法更加靈敏，因此在大豆轉基因制品的檢測上得到廣泛應用[11-13]。SYBR Green是一種常用的結合雙鏈 DNA 的染料，本身在激發光下只發出微弱的熒光，結合雙鏈DNA后，熒光增強1 000倍，因此常用來對雙鏈DNA進行定量分析[14]。本研究建立了基于SYBR Green染料的實時熒光定量PCR，用于高通量分析多種醬油中的大豆轉基因成分，希望為轉基因生物標志的監管體系提供更可靠的技術支撐。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要材料試驗所用含抗草甘膦轉基因大豆成分的醬油由北京市食品及釀酒產品質量監督檢驗一站提供。

1.1.2主要試劑無水乙醇，異丙醇，70%乙醇（均為分析純）。深加工產品DNA提取試劑盒DP326（天根生化科技有限公司，其中包括GMO1、GMO2、Proteinase K、TE緩沖液）；Carrier RNA（天根生化科技有限公司）。0.1 mol/L Tris-Cl（pH值8.0）；乙酸；EDTA-Na2；ABI熒光染料；2×PCR Reagent（天根生化科技有限公司）；瓊脂糖。

1.1.3主要儀器BIO-RAD CF×96熒光PCR儀；METTLER TOLEDO電子天平（十萬分之一，瑞士梅特勒公司）；Eppendorf移液槍（1 000、100、10、2.5 μL）；湘儀TG16-WS臺式高速離心機；恒溫水浴鍋（恒發）；渦旋振蕩器；磁力攪拌器；BIO-RAD MJ Mini PCR儀。

1.2試驗方法

1.2.1凝膠緩沖液及凝膠的制備凝膠緩沖液：50×TAE溶液：取Tris-HCl 242 g，乙酸 57.1 mL，EDTA-Na2 37.2 g加蒸餾水溶解后定容到1 000 mL。

凝膠：取1.5 g瓊脂糖加入到三角瓶中，加入100 mL稀釋50倍的50×TAE緩沖液，加熱，充分溶解。進行瓊脂糖凝膠電泳之前，將凝膠加熱熔解后使用。

1.2.2DNA的提取采用試劑盒法，按照深加工產品DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）說明步驟操作。

1.2.2.1醬油樣品預處理取醬油30 mL，加入60 mL無水乙醇混勻，置冰箱（-20 ℃）放置10 min后，10 000 r/min離心10 min。棄上清。在沉淀中加入30 mL 0.1 mol/L Tris-Cl（pH值8.0）溶液，用力搖勻，全部轉移到100 mL燒杯中，于磁力攪拌器上攪拌2 h。分裝至1.5 mL離心管中，12 000 r/min 離心10 min。棄上清。沉淀中焦糖色素及鹽等小分子已全部去除，可用于DNA提取 （注：棄上清之后要將分裝后所有沉淀取到1個1.5 mL離心管中，用于后續DNA的提取）。

1.2.2.2DNA提取取上述預處理所得樣品，加500 μL緩沖液GMO1和20 μL Proteinase K（20 g/mL），渦旋振蕩1 min。56 ℃孵育1 h，孵育過程中每15 min振蕩1次。加入200 μL緩沖液GMO2，充分混勻，渦旋振蕩1 min，室溫靜置10 min。12 000 r/min離心5 min，將上清液轉移至新的離心管中。向上清液中加入1 μL Carrier RNA，再加入0.7倍體積的異丙醇，充分混勻。12 000 r/min離心3 min，棄上清，保留沉淀。加入700 μL 70%乙醇，渦旋振蕩5 s，12 000 r/min離心 2 min，棄上清。重復2次。開蓋倒置，室溫5～10 min，徹底晾干殘余的乙醇。加入20 ～50 μL洗脫緩沖液TE，渦旋振蕩 1 min，最終得到DNA緩沖液。

1.2.3PCR引物設計引物參照王媛等的設計[15]，由三博遠志公司合成（表1）。

1.2.4PCR反應體系和反應條件

1.2.4.1普通PCR反應體系和反應條件在96孔板上同時分別對醬油DNA提取液中凝集素（Lectin）基因、CaMv35S啟動子、NOS終止子、18S基因和EPSPS外源基因進行PCR擴增，另外，對Lectin基因、CaMv35S啟動子、NOS終止子、18S基因標準樣品以同樣條件進行PCR擴增。PCR反應體系為25 μL。其中含2×PCR Reagent 12.5 μL；上、下游引物分別0.5 μL；模板DNA 4 μL，用滅菌雙蒸水定容至25 μL。陰性對照不含樣品。

PCR擴增條件：退火 94 ℃ 3 min；退火及延伸 94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，70 ℃ 1 min，37個循環；循環結束后70 ℃ 5 min。

1.2.4.2RT-PCR反應體系和反應條件在96孔板上同時分別對醬油DNA提取液中Lectin基因、CaMv35S啟動子、NOS終止子、18S基因和EPSPS外源基因進行實時熒光定量PCR擴增。PCR反應體系為25 μL。其中含2×PCR Reagent 12.5 μL；上、下游引物各0.5 μL；模板DNA 4 μL，用滅菌雙蒸水定容至25 μL。陰性對照不含樣品。

RT-PCR擴增條件：退火 94 ℃ 30 s；退火及延伸 94 ℃ 5 s，60 ℃ 80 s，40個循環。 循環結束后開始熔解階段，溫度從65 ℃升至95℃，每升高0.5 ℃儀器自動收集熒光信號。

按照以上反應條件和反應體系進行PCR和RT-PCR反應，普通PCR反應結束后，取5 μL反應產物與1 μL loading buffer混勻，加入到進樣孔中在180 V/0.1 A下進行凝膠電泳，38 min后取出凝膠，在凝膠成像系統下觀察結果。

2結果與分析

2.1基因組的提取結果

要成功進行PCR擴增，首先需保證DNA樣品的純度。經分光光度計測量，試劑盒提取的樣品DNA的濃度為100～500 ng/μL，DNA純度較好，適合進行PCR擴增。

2.2醬油中轉基因成分定性PCR和凝膠電泳分析

Lectin基因作為內源性的大豆看家基因，在大豆細胞中基因組的表達量基本恒定，很少受外部環境影響，因此，本研究選取了Lectin基因作為內部參照[16]，考察Lectin基因的擴增，也可以判斷提取的DNA的量和純度是否合適進行PCR分析，排除假陰性結果的存在。根據圖1的3、4條帶可以看出，醬油中提取的DNA中含有足夠的Lectin基因用于PCR擴增，擴增效果良好。擴增產物約100 bp。然而Lectin的陰性對照組出現模糊的亮帶，可能來自于外部基因污染。

此外，由圖1可以看出，在醬油所提取的DNA的PCR擴增結果中，抗草甘膦轉基因大豆中的調控元件CaMv35S啟動子、NOS終止子和18S基因均得到明顯的擴增產物，其對照組均為陰性。而外源基因EPSPS沒有擴增產物。結果表示醬油樣品中的轉基因成分含有CaMv35s啟動子、Nos終止子和18S基因，而抗草甘膦基因中的EPSPS成分可能已被降解。

各種基因標準樣品PCR擴增后的結果與圖1的條帶結果一致，進一步證明了在醬油基因組提取中，無需進一步分離就能夠得到純度較高的轉基因成分進行PCR擴增分析，其結果較為準確（圖2）。值得特別注意的是，之前Lectin基因陰性對照中的條帶已經基本消失不見，進一步證明在圖1的試驗中，PCR反應或凝膠電泳過程中對Lectin基因陰性對照組造成了外部污染。同時，圖2-B中的NOS陰性對照中出現

了模糊的亮帶，而圖1中NOS陰性對照組并未出現條帶。這個現象也進一步說明了陰性對照存在著假陽性外部污染。

2.3實時熒光定量PCR擴增結果分析

目前，定性PCR和凝膠電泳分析僅能夠對醬油中的轉基因成分完成初步的定性和篩選，實驗發現其結果容易因外部污染造成假陽性，因此準確性較差。而實時熒光定量PCR可對醬油樣品中提取出的轉基因成分進行進一步定性確認和定量標定。

實時熒光定量PCR對醬油樣品DNA提取物中的Lectin基因、CaMv35S啟動子、NOS終止子、18S基因、EPSPS外源基因進行了研究（圖3）。上述前4種基因都存在擴增產物，EPSPS 外源基因不存在擴增產物，根據軟件分析結果，其中Lectin、CaMv35S、NOS、18S、EPSPS的CT平均值分別為 33.46、33.15、30.16、35.45、0.00，該結果與定性PCR結果一致。同時所有5組陰性對照試驗均沒有擴增產物，進一步證明了試驗結果的準確性，與定性PCR相比，避免了外部污染引起的假陽性。因為該醬油樣品來源于抗草甘膦轉基因大豆，而EPSPS基因是抗草甘膦基因的重要序列。因此，該檢測結果也準確地說明了EPSPS基因在食品中存在著降解和損耗。

為驗證該方法的重現性和準確性， 開展了4次實時熒光

定量PCR的重復試驗（圖4）。結果表明，對于相同批次的醬油樣品，PCR擴增結果重現性較好，Lectin、CaMv35S、NOS、18S 這4種基因都產生了擴增產物，其相對豐度基本一致，EPSPS基因均沒有擴增產物。

2.4熔解曲線分析

本研究中使用的是SYBR Green染料，能與雙鏈DNA發生非特異性結合，引發其熒光增強，由于這種結合的非特異性，所以假陽性擴增產物也可能引發熒光信號的增強，影響檢測的準確度[14]。因此，需要結合熔解曲線來分析PCR擴增反應的特異性。

在完成PCR擴增后，逐漸增加反應體系的溫度，同時監測每一步的熒光值（RFU），隨著反應產物中雙鏈DNA在高溫下逐步解鏈，熒光強度隨時間逐漸降低。做-d（RFU）/dT與溫度的關系圖，則得到PCR產物的熔解曲線，這里T為時間。一般的，特異性擴增產物解鏈溫度的峰值（Tm值，即雙鏈DNA解鏈50%的溫度）比非特異性擴增產物的Tm值高，因此可區別出特異性信號和非特異性信號。

由圖5可見，醬油樣品中提取的轉基因成分里，CaMv35S、NOS、18S基因的PCR擴增產物的熔解曲線均為單峰，為典型的特異性擴增，解鏈溫度分別為83.1、75.8、84.5 ℃。Lectin基因擴增產物的熔解曲線在82.8 ℃有1個明顯的特異性擴增峰，另外，在77.5 ℃處還有1個非特異性擴增產生的小峰，這個結果也一定程度說明了定性PCR陰性對照中的凝膠電泳亮帶的來源（圖1條帶3），為非特異性擴增產生。同時，與前面的結果一致，因為EPSPS基因沒有產生擴增產物，所有其熔解曲線沒有任何特征峰。

3結論與討論

PCR技術已經被廣泛應用于基因組DNA的檢測中，具有特異性高、靈敏度高等特點。實時熒光定量PCR通過在PCR反應體系中加入熒光基團，利用信號的采集和積累來實時檢測PCR反應進度，根據反應CT值做到對基因的定量檢測。這種方法的定量信息更準確，方法更加靈敏，因此可以用于大豆轉基因制品的檢測。

本研究完成了對醬油這樣的實際樣品中所含的多種大豆抗草甘膦轉基因成分的快速、高通量檢測。首先，采用試劑盒成功從醬油樣品中提取出了基因組DNA，并設計5組探針，針對樣品中大豆的抗草甘膦轉基因成分進行了定性PCR和實時熒光PCR擴增，對比標準樣品，對定性PCR的結果進行了凝膠電泳分析。試驗結果顯示，利用抗草甘膦轉基因大豆（或豆粕）為原料產出的醬油中含有抗草甘膦轉基因大豆的調控元件CaMv35s啟動子、Nos終止子、以及18S基因，并同時可以檢測到內源基因Lectin。然而，EPSPS外源基因并沒有檢測到。說明EPSPS外源基因在食品加工中可能被降解。

本研究利用實時熒光定量PCR技術同時成功檢出了多種醬油中所含的抗草甘膦轉基因大豆成分，內源參照基因Lectin的CT值和目的基因的CT值相近，說明結果可靠有效，達到了極高的檢測靈敏度。試驗儀器采用的BIO-RAD MJ Mini PCR為96孔，可同時測定32個樣本，每個樣本為3個平行，可以進行高通量實時分析，與傳統PCR相比節約了大量的時間。

與傳統PCR相比，RT-PCR方法具有更好的分析特異性[17]。凝膠電泳分析結果顯示，定性PCR反應結果Lectin基因陰性對照組中有1條模糊的條帶，即造成了外界污染；而在相應的RT-PCR中，Lectin基因陰性對照組并沒有擴增產物。該現象表明傳統PCR容易在定性分析中因外界污染造成假陽性，具有技術上的缺陷，而實時熒光定量PCR克服了這一缺陷。熔解曲線的分析能夠很好地區分特異性擴增產物和非特異性擴增產物，進一步證實了Lectin基因擴增中產生了非特異性產物，有效地提高了分析的準確性。

本研究建立的RT-PCR方法作為一種更直觀、更準確和更快速的轉基因成分高通量檢測方法可以為食品質量監管機構提供更好的技術支持，有利于管理市場上轉基因產品和規范轉基因原料的流通。

參考文獻：

[1]張文銀，安永平，王彩芬，等. 主要轉基因作物研究現狀及其產業化進展[J]. 生物技術通報，2008（5）：1-4，9.

[2]張成，劉定富，易先達.全球轉基因作物商業化進展及現狀分析[J]. 湖北農業科學，2011，50（14）：2819-2823.

[3]侯守禮. 轉基因食品是否加貼標簽對消費者福利的影響[J]. 數量經濟技術經濟研究，2005，22（2）：64-73，94.

[4]仇煥廣，黃季焜，楊軍. 關于消費者對轉基因技術和食品態度研究的討論[J]. 中國科技論壇，2007（3）：105-108，51.

[5]齊振宏，周慧. 消費者對轉基因食品認知的實證分析——以武漢市為例[J]. 中國農村觀察，2010（6）：35-43.

[6]Engvall E，Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）：quantitative assay of immunoglobulin G[J]. Immunochemistry，1971，8（9）：871-874.

[7]Kppel R，Zimmerli F，Breitenmoser A. Multiplex real-time PCR for the simultaneous detection and quantification of DNA from three transgenic rice species and construction and application of an artificial oligonucleotide as reference molecule[J]. European Food Research and Technology，2010，230（5）：731-736.

[8]黃昆侖，羅云波.用巢式和半巢式PCR檢測轉基因大豆Roundup Ready及其深加工食品[J]. 農業生物技術學報，2003，11（5）：461-466.

[9]白月，才華，欒鳳俠，等. 多重PCR結合DHPLC方法檢測番茄中轉基因成分[J]. 作物雜志，2011（2）：28-31.

[10]Christian A H，Junko S. Real-time quantitative PCR[J]. Genome Research，1996，6：986-994.

[11]劉光明，蘇文金，蔡慧農，等. 基于分子信標探針的熒光定量PCR方法檢測轉基因食品[J]. 應用與環境生物學報，2006，12（2）：273-277.

[12]蔡慧農，劉光明，蘇文金，等. TaqMan探針用于轉基因食品的熒光定量PCR檢測[J]. 食品與發酵工業，2003，29（12）：1-7.

[13]陳穎，徐寶梁，蘇寧，等. 實時熒光定量PCR技術檢測轉基因大豆方法的建立[J]. 食品與發酵工業，2003，29（8）：65-69.

[14]王小花，李建祥，王國卿，等. SYBR Green實時熒光定量PCR檢測大豆轉基因成分[J]. 食品科學，2009，30（8）：171-176.

[15]王媛，葛毅強，陳穎，等. 大豆加工食品中轉基因成分多重PCR檢測體系的建立[J]. 食品與發酵工業，2004，30（10）：118-121.

[16]柯納德·J·海勒. 基因工程食品——生產方法與檢測技術[M]. 北京：化學工業出版社，2005：137-138.

[17]任春梅，程兆榜，楊柳，等. 江蘇省葫蘆科作物6種病毒的多重RT-PCR方法及應用[J]. 江蘇農業學報，2015，31（4）：756-763.