銀葉樹果殼木質素提取及抗氧化性

龐庭才++熊拯++胡上英+廖燕青

摘要：采用堿液提取法對銀葉樹果殼木質素進行提取分離，以單因素試驗和正交試驗法研究提取溫度、KOH濃度、料液比、提取時間對銀葉樹果殼木質素提取效果的影響，并對所提取木質素進行紫外光譜分析和抗氧化性研究。結果發現，銀葉樹果殼木質素最佳提取工藝參數為：提取溫度60 ℃、KOH濃度0.5 mol/L、料液比1 g ∶ 55 mL、提取時間2 h，在此條件下木質素得率達到10.78%。銀葉樹果殼木質素濃度對羥基自由基、超氧陰離子自由基和對DPPH自由基均有明顯的清除作用，且清除率隨木質素濃度增加而增大。

關鍵詞：銀葉樹果殼；木質素；抗氧化性

中圖分類號： R284.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0385-04

收稿日期：2015-05-10

基金項目：廣西高校科學技術研究（編號：2013YB260；2013LX161）；欽州學院校級科研項目（編號：2014XJKY-58C）；大學生創新創業訓練計劃（編號：201411607064）。

作者簡介：龐庭才（1985—），男，碩士，實驗師，研究方向為植物有效成分提取與分析。E-mail：pangtingcai@126.com。銀葉樹（Heritiera littoralis）屬梧桐科植物，是熱帶、亞熱帶海岸紅樹林中的喬木樹種，主要分布于我國廣東、廣西和臺灣等地區，是比較典型的水陸兩棲紅樹植物種類[1]。銀葉樹的根為板狀根，莖高而大，葉背銀白色，果實形狀奇特，為近心形或近橢圓形或扁圓形，果皮木質化，外果皮堅硬[2]。有關銀葉樹的研究主要集中在地理分布與形態特征[3-4]、生物化學與遺傳多樣性[5-6]、抗性生理[7-8]、育苗造林技術[9-10]、資源利用[11-12]等方面，而對于銀葉樹果殼的研究還比較少。目前銀葉樹果殼常常在果實被采摘之后當作垃圾遺棄，這不僅造成資源的浪費，還對環境造成了一定的危害。因此，為了高效利用銀葉樹資源，有必要開展銀葉樹果殼木質素的研究。木質素是一種在酸作用下難以水解、具有復雜空間網狀結構的聚芳基化合物，主要存在于木質化植物的細胞中，是工業上唯一能從可再生資源中獲取的芳香族化合物[13]，具有較高地利用價值。但是由于木質素自身理化性質不均一、結構復雜、分離提取困難等因素，使得木質素至今沒有被很好的利用。近年來，隨著研究的深入，從花生殼、核桃殼、造紙廢液中提取木質素的研究開始增多[14-16]，但從銀葉樹果殼中提取木質素的研究國內外尚未見報道。本研究采用一般堿法提取銀葉樹果殼中的木質素，并對所提取木質素進行紫外光譜分析和抗氧化性研究。通過對銀葉樹果殼木質素的研究，為提高銀葉樹的綜合利用價值，進一步開發和利用紅樹資源提供一定的理論基礎。

1材料與方法

1.1材料與儀器

銀葉樹果實外種殼，產自廣西防城港北侖河口紅樹林保護區。

試驗用氫氧化鉀、鹽酸、乙醇等試劑均為AR，1，1-二苯基-2苦肼基為BR。主要儀器有紫外可見分光光度計（UV-3200），上海美譜達儀器有限公司；電子天平（EL204）梅特勒-托利多（上海）有限公司；高速離心機（H1850），湖南湘儀實驗儀器開發有限公司；旋轉蒸發器（RE-3000），上海亞榮生化儀器廠；循環水式真空泵[SHZ-D（Ⅲ）]，鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.2方法

1.2.1樣品預處理銀葉樹果殼在60 ℃下干燥至恒質量，粉碎，過80目篩。用甲苯與乙醇混合溶液（體積比為2 ∶ 1）浸提10 h后過濾，回收甲苯-乙醇溶劑，濾渣40 ℃烘干至恒質量，得樣品備用。

1.2.2銀葉樹果殼中木質素的提取稱取預處理后的銀葉樹果殼粉末1.0 g，按一定的料液比加入一定濃度的KOH溶液，在設定的水浴溫度條件下浸提一定時間，抽濾取濾液，用6 mol/L乙酸將濾液pH值調至5.5，減壓蒸餾得樣品濃縮液，加入濃縮液3倍體積的95%乙醇，混勻后靜置，待沉淀完全后，抽濾。濾液通過減壓蒸餾除去乙醇，用6 mol/L HCl 將樣液pH值調至1.5，靜置后過濾，所得濾渣用pH值為2的HCl溶液洗滌，低溫干燥，即得到堿木質素[17]。

木質素得率=木質素產量原料質量×100%。

（1）

1.2.3單因素試驗提取溫度對木質素得率的影響在提取時間1.5 h、料液比1 g ∶ 55 mL、KOH濃度0.5 mol/L條件下，研究不同溫度（40、50、60、70、80 ℃）對木質素得率的影響。

1.2.3.1KOH濃度對木質素得率影響在提取溫度60 ℃、提取時間1.5 h、料液比 1 g ∶ 55 mL條件下，研究不同KOH溶液濃度（0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mol/L）對木質素得率的影響。

1.2.3.2料液比對木質素得率的影響在提取溫度60 ℃、提取時間1.5 h、KOH濃度0.5 mol/L條件下，研究不同料液比（1 ∶ 25、1 ∶ 35、1 ∶ 45、1 ∶ 55、1 ∶ 65，g/mL）對木質素得率的影響。

1.2.3.3提取時間對木質素提取得率的影響在提取溫度60 ℃、料液比1 g ∶ 55 mL、KOH濃度0.5 mol/L條件下，研究不同提取時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）對木質素得率的影響。

1.2.4正交試驗設計以銀葉樹果殼木質素得率為指標，在單因素試驗的基礎上進行L9（34）正交試驗（表1），以確定最佳的銀葉樹果殼木質素提取工藝參數。

1.2.5紫外光譜的測定取一定量提取所得木質素樣品，溶于適量乙醇溶液中，以乙醇溶液為空白，用紫外可見分光光度計測其在200～400 nm范圍內的吸收光譜。

1.2.6木質素抗氧化性研究

1.2.6.1DPPH自由基的清除[18]稱取0.003 8 g的DPPH用無水乙醇溶解，定容至50 mL，搖勻得到濃度為0.2 mmol/L的DPPH溶液，放于冰箱內備用。在具塞試管中分別加入 2 mL 濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL 的木質素樣品溶液，再加入2 mL的DPPH溶液作為試驗組，避光反應30 min后在波長517 nm處測定其吸光度。以2 mL樣品溶液加入2 mL的無水乙醇作對照組，以2 mL的DPPH溶液加入2 mL蒸餾水中作為空白，計算對DPPH自由基的清除率。

清除率=D0-（Di-Di0）D0×100%。

式中：Di為試驗組吸光度；Di0對照組吸光度；D0為空白吸光度；以無水乙醇作為參比。

1.2.6.2羥基自由基（·OH）的清除[19]稱取0.083 4 g FeSO4·7H2O溶于少量蒸餾水中，定容至50 mL，得到 6 mmol/L FeSO4 溶液；稱取0.041 4 g水楊酸溶于少量無水乙醇中，用無水乙醇準確定容至50 mL，得到6 mmol/L的水楊酸-乙醇體系；用微量移液器量取166.7 μL 30%的H2O2用蒸餾水定容至50 mL容量瓶中，得到0.1%的H2O2。在 15 mL 的具塞試管中分別加入2 mL 6 mmol/L FeSO4溶液，2 mL 6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液，再分別加入2 mL濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL樣品溶液，最后加入 2 mL H2O2啟動反應，37 ℃水浴反應30 min后，以 4 000 r/min 速度離心 5 min，取上清液在510 nm處測定吸光度，以此作為試驗組。以蒸餾水代替H2O2作為對照組，以蒸餾水代替樣品作為空白。

清除率=D0-（Di-Di0）D0×100%。

式中：Di為樣品組；Di0為對照組；D0為以蒸餾代替樣品的空白。

1.2.6.3超氧陰離子自由基（ O-2 · ）的清除[20]在25 ℃的恒溫水浴鍋中，將pH值 8.2的Tris-HCl緩沖液和45 mmol/L鄰苯三酚保溫20 min后，取4.5 mL pH值8.2的Tris-HCl 緩沖液，加 0.3 mL 45 mmol/L鄰苯三酚，振蕩器混勻，在 25 ℃ 水浴中反應4 min，加入8 mol/L HCl終止反應，在 325 nm 測吸光度，計算出鄰苯三酚的自氧化率V0。取 4.5 mL Tris-HCl緩沖液，加入不同濃度（0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mg/mL）的銀葉樹果殼木質素溶液2 mL在25 ℃恒溫水浴中放置20 min后，加入 0.3 mL 的25 ℃預熱的鄰苯三酚溶液，振蕩混勻，在25 ℃水浴中反應4 min，加入6 mol/L HCl終止反應，在 325 nm 測吸光度，計算出加入樣品后鄰苯三酚的自氧化率V1。

清除率=[（V0-V1）/V0]×100%。

式中：V0為對照組；V1為樣品組。

2結果與討論

2.1單因素試驗結果

2.1.1提取溫度對木質素得率的影響在40～60 ℃范圍內，隨著溫度的升高，木質素的得率呈明顯上升趨勢，在 60 ℃ 時達到最大值；當溫度繼續升高時，得率反而有所下降（圖1）。其原因可能是當溫度較低時，由于纖維素上木質素結構結合緊密，結構破壞力大，使木質素分離不徹底，部分木質素還殘留在果殼纖維中[21]，所以木質素的得率略低；當提取溫度超過60 ℃時，會導致部分木質素分解，從而影響了木質素得率。因此，最佳提取溫度為60 ℃。

2.1.2KOH濃度對木質素得率的影響隨著堿液濃度的增大，木質素得率呈上升趨勢，堿液濃度為0.5 mol/L時木質素

得率達到最大值，之后得率趨于平穩（圖2）。結果表明，適宜的堿濃度可斷裂木質素與糖聚物之間的酯鍵和醚鍵，而堿濃度較高時，木質素可能發生氧化和自身縮合反應造成損失。因此，最佳KOH濃度為0.5 mol/L。

2.1.3料液比對木質素得率的影響料液比在1 g ∶ （25～55） mL之間，木質素得率逐漸升高，料液比1 g ∶ 55 mL時得率達到最大值，之后隨著料液比的繼續增大，木質素得率反而有所降低（圖3）。其原因可能是當料液比較小時，隨著提取溶液的增加有利于木質素的溶出；但當料液比超過 1 g ∶ 55 mL 時，木質素得率趨于平穩，基本不再提高。因此，最佳料液比為 1 g ∶ 55 mL。

2.1.4提取時間對木質素得率的影響隨著提取時間的增加，木質素得率呈上升趨勢，當提取時間為2 h時，木質素得率達到最大值，之后隨著提取時間繼續增加，得率反而有所降低（圖4）。其原因可能是在一定的時間范圍內，隨著提取時間的延長，木質素與纖維素分離程度逐漸提高，使得木質素得率也隨之增大；而當提取時間達到2.0 h后，樣品中木質素基本已經全部溶出，之后隨著提取時間的繼續延長，木質素得率也趨于平穩。因此，最佳提取時間為2.0 h。

2.2正交試驗結果與方差分析

影響銀葉樹果殼木質素得率的因素主次為：KOH濃度

（B）>提取溫度（A）>料液比（C）>提取時間（D）。提取木質素的最佳工藝參數為：A2B2C3D2，即提取溫度為60 ℃、KOH濃度為0.5 mol/L、料液比為1 g ∶ 65 mL、提取時間為 2.0 h。在此條件下對最佳提取工藝進行驗證試驗，驗證試驗得到的木質素平均得率分別是10.68%、10.79%、10.80%、10.90%、10.74%（表2）。因此，銀葉樹果殼木質素得率為10.78%，說明該木質素提取工藝穩定可行。

2.3紫外吸收波譜分析

在200～400 nm范圍內掃描，測得本試驗所提取的木質素的紫外吸收光譜（圖5）。在216 nm處產生最大吸收峰，這些是苯環物質典型的特征吸收峰，說明所提取得到的木質素為芳香族化合物。由紫外光譜分析表明，所提取的木質素含有苯環結構，具有較好的化學活性。

2.4抗氧化性研究結果

2.4.1對DPPH自由基的清除效果銀葉樹果殼木質素對 DPPH 自由基具有明顯的清除作用，DPPH的清除率隨著木質素濃度的提高而升高，當銀葉樹果殼木質素濃度達到 0.25 mg/mL 時，對DPPH自由基的清除率可達到80.6%（圖6），說明銀葉樹果殼木質素具有較強的DPPH自由基清除能力。

2.4.2對羥基自由基（·OH）的清除效果銀葉樹果殼木質素對羥基自由基（·OH）具有明顯的清除作用，羥基自由基（·OH）的清除率隨著木質素濃度的提高而升高，當銀葉樹果殼木質素濃度為0.5 mg/mL時，對羥基自由基（·OH）的清除率為26.8%，當濃度達到2.5 mg/mL時，清除率可達到 83.7%（圖7），說明銀葉樹果殼木質素具有較強的羥基自由基（·OH）清除能力。

2.4.3對超氧陰離子（ O-2 · ）的清除效果銀葉樹果殼木質素對超氧陰離子自由基（ O-2 · ）具有明顯的清除作用，超氧陰離子自由基（ O-2 · ）的清除率隨著木質素濃度的提高而升高，當銀葉樹果殼木質素濃度為0.1 mg/mL時，對超氧陰離子自由基（ O-2 · ）的清除率為45.1%，當濃度達到 0.9 mg/mL 時，清除率可達到89.8%（圖8），說明銀葉樹果殼木質素具有較強的超氧陰離子自由基（ O-2 · ）清除能力。

3結論

（1）經正交試驗分析，得到最佳提取工藝條件：提取溫度為60 ℃、KOH濃度為0.5 mol/L、料液比1 g ∶ 65 mL、提取時間為2 h，在此條件下木質素得率達到10.78%。各因素對木質素得率的影響順序為：KOH濃度>提取溫度>料液比>提取時間。

（2）紫外光譜分析表明，在216 nm附近有較強的吸收帶，所提取的木質素含有苯環結構，具有較好的化學活性。

（3）抗氧化性研究表明，對DPPH自由基、羥基自由基（·OH）、對超氧陰離子自由基（ O-2 · ）的清除率隨著銀葉樹果殼木質素的濃度提高而提高，清除率最高分別為80.6%、83.7%、89.8%。

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