根際促生菌D5A菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

陳翠++陳丹丹++馮清++陳祁怡+吳向華

摘要：考察不同碳源、氮源、碳氮比、生長因子、溫度、pH值、裝液量、轉(zhuǎn)速、接種量、時(shí)間等參數(shù)對根際促生菌D5A菌株發(fā)酵的影響。結(jié)果表明，在裝液量為30 mL/250 mL的三角瓶中，按5%接種量將D5A菌株接種到以3%葡萄糖為碳源、1.5%牛肉膏為氮源、碳氮比為2 ∶ 1、生長因子為酵母粉、pH值為6的培養(yǎng)基中，150 r/min、37 ℃培養(yǎng)48 h，可發(fā)酵產(chǎn)生最大生物量。

關(guān)鍵詞：根際促生菌；發(fā)酵；優(yōu)化

中圖分類號： S154.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0516-03

收稿日期：2015-04-29

基金項(xiàng)目：江蘇省大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（編號：201311460046X）；江蘇省“生態(tài)學(xué)”重點(diǎn)一級建設(shè)學(xué)科項(xiàng)目。

作者簡介：陳翠（1992—），女，江蘇淮安人，碩士研究生，主要從事生物學(xué)研究。E-mail：1448405968@qq.com。

通信作者：吳向華，博士，副教授，主要從事微生物學(xué)教學(xué)與研究工作。E-mail：xhw610@163.com。植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR） 是指自由生活在土壤或附生于植物根系的一類可促進(jìn)植物生長及對礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收和利用，并能抑制有害生物的有益菌類[1]。PGPR具有固氮、解磷、釋鉀、產(chǎn)生植物激素和分泌抗生素等能力，或具有其中之一的能力[2-3]。PGPR對植物生長具有直接或間接促進(jìn)作用。PGPR的直接促進(jìn)作用是指某些植物根際促生菌可合成對植物生長發(fā)育有直接作用的物質(zhì)（如生長素等） 以及改變土壤中某些無效元素的形態(tài)，使之有效化而利于植物吸收（如固氮、解磷等）[4-5] 。對植物生長的間接作用是指某些植物根際促生菌抑制或減輕某些植物病害對植物生長發(fā)育和產(chǎn)量的不良影響[6-7]。接種PGPR普遍被認(rèn)為是一種環(huán)境友好、經(jīng)濟(jì)有效的提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)的方法，應(yīng)用前景廣闊。本研究選擇碳源、氮源、碳氮比、生長因子、溫度、pH值、裝液量、轉(zhuǎn)速、接種量、時(shí)間等參數(shù)，探索優(yōu)化根際促生菌D5A菌株的發(fā)酵條件，旨在為工業(yè)化生產(chǎn)根際促生菌D5A菌株提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1菌株

根際促生菌D5A菌株克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）[8]由中國科學(xué)院土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈。

1.2培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[9]。

1.3方法

1.3.1碳源對D5A菌株生長的影響[10-11]以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別以3%糖蜜、3%可溶性淀粉、3%葡萄糖、3%蔗糖、3%玉米糝為碳源，按2%接種量于37 ℃ 連續(xù)培養(yǎng)48 h，測定發(fā)酵液生物量。

1.3.2氮源對D5A菌株生長的影響以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，以篩選出的最適碳源為碳源，分別以1.5%牛肉膏、1.5%硫酸銨、1.5%草酸銨、1.5%蛋白胨、1.5%氯化銨、1.5%硫酸鐵銨、1.5%酵母膏為氮源，按2%接種量于37 ℃ 連續(xù)培養(yǎng)48 h，測定發(fā)酵液生物量。

1.3.3碳氮比對D5A菌株生長的影響以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以篩選出的最佳碳源、氮源為碳氮源，分別用1 ∶ 3、1 ∶ 2、1 ∶ 1、2 ∶ 1、3 ∶ 1、4 ∶ 1、5 ∶ 1碳氮比，按2%接種量于37 ℃ 連續(xù)培養(yǎng)48 h，測定發(fā)酵液生物量。

1.3.4生長因子對D5A菌株生長的影響以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以篩選出的最佳碳氮比為碳氮比，分別用2 020 μg/L維生素B、2 020 μg/L酵母粉、2 020 μg/L葉酸為生長因子，按2%接種量于37 ℃ 連續(xù)培養(yǎng)48 h，測定發(fā)酵液生物量。

1.3.5pH值對D5A菌株生長的影響以篩選出的最佳碳氮比、生長因子配制培養(yǎng)基，分別調(diào)節(jié)pH值至5、6、7、8、9，按2%接種量于37 ℃連續(xù)培養(yǎng)48 h，測定發(fā)酵液生物量。

1.3.6溫度對D5A菌株生長的影響以篩選出的最佳培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，按2%接種量分別于28、37、42 ℃ 連續(xù)培養(yǎng)48 h，測定發(fā)酵液生物量。

1.3.7裝液量對D5A菌株生長的影響以篩選出的最佳培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，按2%接種量將D5A菌株分別接種到裝液量為30、50、80、100、150 mL的250 mL培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，于37 ℃ 連續(xù)培養(yǎng)48 h，測定發(fā)酵液生物量。

1.3.8轉(zhuǎn)速對D5A菌株生長的影響以篩選出的最適裝液量、最適培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，按2%接種量接入D5A菌株，分別在100、150、180 r/min下于37 ℃連續(xù)培養(yǎng)48 h，測定發(fā)酵液生物量。

1.3.9接種量對D5A菌株生長的影響以篩選出的最佳培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，分別按1%、2%、5%、10%、20%的接種量將D5A菌株分別接種到裝液量為30 mL/250 mL的培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，于37 ℃連續(xù)培養(yǎng)48 h，測定發(fā)酵液生物量。

1.3.10培養(yǎng)時(shí)間對D5A菌株生長的影響以篩選出的最佳培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，按5%接種量將D5A菌株接種到裝液量為30 mL/250 mL的培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，分別于37 ℃ 培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h，測定發(fā)酵液生物量。

1.3.11生物量的測定按照稀釋平板計(jì)數(shù)法[12]測定活菌總數(shù)。

1.3.12數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 16.0軟件分析數(shù)據(jù)。

2結(jié)果與分析

2.1最適碳源選擇

由圖1可知，葡萄糖作為碳源能獲得最大生物量，其次是糖蜜、蔗糖、玉米糝，D5A菌株在可溶性淀粉中生長狀況最差。究其原因，可能是由于葡萄糖、蔗糖都屬于速效性碳源，適合菌體大量生成，玉米糝、淀粉都屬于緩釋型碳源，需要分解為單糖后菌體才能大量生長。因此，選擇葡萄糖作為最適碳源。

2.2最適氮源選擇

由圖2可知，D5A菌株在牛肉膏中生長最好，但與硫酸鐵銨差異不顯著，但顯著高于硫酸銨、蛋白胨、氯化銨。牛肉膏不僅可以作為氮源，而且在碳源不足時(shí)可補(bǔ)充碳源，也可提供微量元素，故選擇牛肉膏為最適氮源。

2.3最適碳氮比選擇

以葡萄糖、牛肉膏作為碳氮源，分別按1 ∶ 3、1 ∶ 2、1 ∶ 1、2 ∶ 1、3 ∶ 1、4 ∶ 1、5 ∶ 1比例配制培養(yǎng)基，按2%接種量于 37 ℃ 連續(xù)培養(yǎng)48 h，測定生物量。由圖3可以看出，碳氮比為 2 ∶ 1 時(shí)D5A菌株生長狀況最好，其次為1 ∶ 1，1 ∶ 3、5 ∶ 1比較差，且2 ∶ 1、1 ∶ 1組處理下菌株生物量與其他幾組之間存在顯著差異，故選用2 ∶ 1為最佳碳氮比。

2.4最適生長因子選擇

以維生素B、酵母粉、葉酸為生長因子，按2%接種量于

37 ℃ 連續(xù)培養(yǎng)48 h，由圖4可以看出，不同生長因子下根際促生菌的發(fā)酵情況由好到差依次為：酵母粉>葉酸>維生素B，且酵母粉與其2兩組之間無顯著差異，選用酵母粉為最佳生長因子。

2.5最適pH值選擇

由圖5可知，D5A菌株在pH 值為6時(shí)生長最好，其次是pH值為9、5，在pH值為7、8時(shí)D5A菌株生長較差。pH值為6處理下菌落數(shù)與pH值為7、8存在顯著差異，因此選擇pH值為6為最佳pH值。

2.6最適溫度的選擇

由圖6可知，37 ℃時(shí)菌株生長情況最好，其次是42、28 ℃，但各溫度處理之間無明顯差異。菌株一般在37 ℃時(shí)生長較好，本試驗(yàn)也說明了這點(diǎn)，溫度過高或過低對酶都有一定影響，有可能導(dǎo)致酶失活，故選用37 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

2.7最適裝液量的選擇

由圖7可知，D5A菌株在30 mL/250 mL裝液量處理下生長最好，其次是50 mL/250 mL、100 mL/250 mL，較差的是80 mL/250 mL、150 mL/250 mL，因此裝液量選擇 30 mL/250 mL 最佳。

2.8轉(zhuǎn)速對D5A菌株生長的影響

由圖8可知，150 r/min 轉(zhuǎn)速處理下D5A菌株生長狀態(tài)最佳，150、180 r/min處理下菌落數(shù)差異性較小，但150 r/min與100 r/min之間存在顯著差異，故轉(zhuǎn)速選擇150 r/min對D5A菌株進(jìn)行培養(yǎng)。

2.9接種量對D5A菌株生長的影響

由圖9可知，隨著接種量的增加，菌株的生長情況變好，但是當(dāng)接種量增長到20%時(shí)菌落數(shù)明顯減少。5%、10%接種量處理下菌株生長較佳，且兩者之間無顯著差異，10%接種量與20%接種量之間差異顯著。考慮到經(jīng)濟(jì)因素，選擇5%接種量更為合適。

2.10培養(yǎng)時(shí)間對D5A菌株的影響

由圖10可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，菌株的生長狀態(tài)逐漸變好，但當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間增加為72 h時(shí)，菌落數(shù)有所下降。培養(yǎng)時(shí)間為48、60 h時(shí)菌株的生長狀態(tài)最好，且兩者之間無顯著差異。培養(yǎng)時(shí)間為12 h時(shí)菌株生長情況最差。綜合考慮，選擇48 h培養(yǎng)時(shí)間最為合適。

3結(jié)論

本試驗(yàn)設(shè)置碳源、氮源、碳氮比、生長因子、溫度、pH值、裝液量、轉(zhuǎn)速、接種量、發(fā)酵時(shí)間等單因子試驗(yàn)，獲得根際促生菌的最適發(fā)酵條件是在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，以3%葡萄糖為碳源、1.5%牛肉膏為氮源，碳氮比為2 ∶ 1，生長因子為酵母粉，在37 ℃、pH值為6、裝液量30 mL/250 mL、5%接種量、150 r/min 條件下培養(yǎng)48 h，根際促生菌產(chǎn)量最高。

參考文獻(xiàn)：

[1]李引. 紅壤中花生根際促生菌的篩選鑒定及其應(yīng)用[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[2] Karakurt H，Kotan R. Effects of plant growth promoting rhizobacteria on fruit set，pomological and chemical characteristics，color values，and vegetative growth of sour cherry （Prunus cerasus cv.Kütahya） [J]. Turkish Journal of Biology，2011，35（3）：283-291.

[3] Weyens N，van der Lelie D，Taghavi S. Exploiting plant-microbe partnerships to improve biomass production and remediation[J]. Trends Biotechnol，2009，27（10）：591-598. .

[4]沈崇靈. 法理學(xué) [M]. 北京：北京大學(xué)出版社，2014.

[5]康貽軍，程潔，梅麗娟，等. 植物根際促生菌作用機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2010，21（1）：232-238.

[6]黃曉東，季尚寧，Bernard Glick，等. 植物促生菌及其促生機(jī)理[J]. 現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)，2002（6）：7-15.

[7]梁建根，施躍峰，竺利紅. 植物根圍促生細(xì)菌作用機(jī)制的研究[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008（17）：133-135.

[8]張國壯. 產(chǎn)ACC脫氧酶根際促生菌的分離鑒定及其接種對小麥乙烯代謝和生長的效應(yīng)[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2014.

[9]沈萍，陳向東. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 4版. 北京：高等教育出版社，2013.

[10]馬海林，邢尚軍，劉方春，等. 櫻桃根際促生細(xì)菌YT3的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化 [J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，41（5）：126-129.

[11]洪鵬，安國棟，胡英美，等. 解淀粉芽孢桿菌HF-01發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 中國生物防治學(xué)報(bào)，2013，29（4）：569-578.

[12]周德慶，徐德強(qiáng). 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M]. 3版. 北京：高等教育出版社，2010.