精氨酰-tRNA合成酶在局灶性腦缺血再灌注大鼠中的表達及機制研究

沈 寅，范云智，范宇蔥，符 榮

?

·論著·

精氨酰-tRNA合成酶在局灶性腦缺血再灌注大鼠中的表達及機制研究

沈 寅，范云智，范宇蔥，符 榮

430030湖北省武漢市，華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院神經外科

【摘要】背景目前，臨床上針對哺乳動物氨基酰-tRNA合成酶的研究主要集中在精氨酰-tRNA合成酶、亮氨酰-tRNA合成酶、甲硫氨酰-tRNA合成酶、丙氨酰-tRNA合成酶的結構和功能方面，對哺乳動物尤其是大鼠腦缺血與氨基酰-tRNA合成酶關系的研究報道極少。目的探討精氨酰-tRNA合成酶在局灶性腦缺血再灌注大鼠中的表達及機制。方法選取清潔級健康雄性SD大鼠60只，其中4只大鼠進行預實驗，采用線栓法栓塞大腦中動脈建立局灶性腦缺血再灌注模型。然后將剩余的56只大鼠隨機分為正常組8只、假手術組8只、腦缺血再灌注組40只。正常組不做任何外科處理；假手術組大鼠外科操作步驟與腦缺血再灌注組相同，只是線栓不進入頸內動脈、不造成腦缺血；腦缺血再灌注組大鼠建立局灶性腦缺血再灌注模型。采用反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)測定正常組、假手術組、腦缺血再灌注組大鼠再灌注后不同時間點精氨酰-tRNA合成酶mRNA相對表達量，采用Western Blotting法測定正常組、假手術組、腦缺血再灌注組大鼠再灌注后不同時間點精氨酰-tRNA合成酶蛋白相對表達量。結果假手術組與腦缺血再灌注組大鼠再灌注2 h、腦缺血再灌注組再灌注48 h精氨酰-tRNA合成酶mRNA相對表達量及蛋白相對表達量比較，差異無統計學意義(P>0.05)；假手術組大鼠精氨酰-tRNA合成酶mRNA相對表達量及蛋白相對表達量均低于腦缺血再灌注組再灌注6 h、12 h及24 h(P<0.05)；腦缺血再灌注組大鼠再灌注6 h精氨酰-tRNA合成酶mRNA相對表達量及蛋白相對表達量均高于再灌注2 h和12 h(P<0.05)；腦缺血再灌注組大鼠再灌注24 h精氨酰-tRNA合成酶mRNA相對表達量及蛋白相對表達量均高于再灌注12 h和48 h(P<0.05)。結論大鼠局灶性腦缺血再灌注后6 h及24 h精氨酰-tRNA合成酶表達明顯升高，可能與缺血和再灌注兩次損傷有關。

【關鍵詞】腦缺血；再灌注損傷；精氨酰-tRNA合成酶

沈寅，范云智，范宇蔥，等.精氨酰-tRNA合成酶在局灶性腦缺血再灌注大鼠中的表達及機制研究[J].實用心腦肺血管病雜志，2016，24(6)：54-58.[www.syxnf.net]

SHEN Y，FAN Y Z，FAN Y C，et al.Expression of arginyl-tRNA synthetase in rats with focal cerebral ischemia reperfusion and the mechanism[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2016，24(6)：54-58.

缺血性腦卒中是指由于腦供血動脈狹窄或閉塞導致的腦組織缺血缺氧甚至壞死，可嚴重威脅患者生命健康。目前，缺血性腦卒中的治療手段較多，但治療效果不理想。腦缺血耐受是機體自身一種強大的內源性保護機制，但其確切的分子作用機制尚不清楚。ANDERSON等[1]研究發現，線蟲氨基酰-tRNA合成酶基因被抑制后，蛋白質翻譯明顯減少，線蟲的低氧耐受能力明顯增強，故認為抑制氨基酰-tRNA合成酶基因能夠抑制基因轉錄，導致細胞生物學行為變化，如三磷腺苷(ATP)消耗減少等。臨床研究顯示，基因轉錄抑制導致能量消耗急劇下降是冬眠動物在長期缺氧環境下存活的一種行之有效的內在機制[2]，提示急性缺血狀態下氨基酰-tRNA合成酶基因沉默極有可能是一種新的腦缺血耐受保護機制。迄今為止，有關哺乳動物腦缺血耐受與氨基酰-tRNA合成酶基因抑制關系的研究報道極少。本研究擬通過建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，觀察精氨酰-tRNA合成酶在局灶性腦缺血再灌注大鼠中的表達，間接判斷缺血腦組織半暗帶細胞能量代謝的變化規律，旨在探究精氨酰-tRNA合成酶在局灶性腦缺血再灌注大鼠中的表達及機制。

1材料與方法

1.1實驗動物實驗動物的購買、麻醉和外科操作均經華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心批準。于2015年選取清潔級健康雄性SD大鼠60只，體質量(280±20)g，由同濟醫學院實驗動物中心提供；飼養條件：25 ℃、12 h晝夜喂養。

1.2主要儀器及試劑一氯化三苯基四氮唑(TTC)購自美國sigma公司，2.0 T核磁共振儀購自美國GE公司，羊抗鼠精氨酰-tRNA合成酶IgG、兔抗羊抗體及ABC試劑盒購自Santa Cruz 公司；Trizol購自GIBCOL公司；精氨酰-tRNA合成酶基因引物由巴菲爾生物技術公司合成；反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒購自Promega公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物試劑公司；其他試劑均為國內分析純。 LEICA-Q500IW圖像分析系統購自德國Meilteler公司，UVP ImageStore 5000 cobine系統購自美國。

1.3實驗分組首先選取4只大鼠進行預實驗，建立局灶性腦缺血再灌注模型，4只大鼠均建模成功。然后將剩余的56只大鼠隨機分為正常組8只、假手術組8只、腦缺血再灌注組40只。正常組大鼠不做任何外科處理；假手術組大鼠外科操作步驟與腦缺血再灌注組相同，只是線栓不進入頸內動脈、不造成腦缺血；腦缺血再灌注組大鼠建立局灶性腦缺血再灌注模型。

1.4局灶性腦缺血再灌注模型采用線栓法栓塞大腦中動脈建立局灶性腦缺血再灌注模型：暴露左側頸總動脈，結扎頸外動脈；線栓(線栓為進口尼龍線，直徑0.2 mm，長度2.4 cm，頭端為直徑0.25～0.28 mm的圓鈍小球)經頸外動脈插入頸內動脈2.0～2.2 cm，用以封閉大腦中動脈；15 min后拔出線栓至頸外動脈形成大腦中動脈再灌注；造模后，觀察大鼠行為以證實栓塞大腦中動脈有效。局灶性腦缺血再灌注模型建立成功標準：大鼠出現左側Horner征，右前爪不能伸直，爬行時向右側轉圈或向右側傾倒。局灶性腦缺血再灌注造模成功大鼠方可進入實驗；造模大鼠死亡或出現蛛網膜下腔出血或無左側Horner征及右側偏癱表現均為造模失敗，不能進入實驗，選取同一批次的大鼠制成合格模型后補足數目。

1.5TTC染色大鼠采用2.0 T核磁共振儀掃描后腹腔注射過量麻醉劑即刻斷頭處死，無菌條件下迅速取出大鼠腦組織快速低溫冷凍，做連續2 mm厚冠狀切片，隨后放入1% TTC溶液中，37 ℃下染色30 min。正常腦組織TTC染色顯示為紅色，缺血區腦組織TTC染色顯示為白色。

1.6RT-PCR正常組、假手術組各選取4只大鼠，腦缺血再灌注組于再灌注2 h、6 h、12 h、24 h、48 h分別選取4只大鼠，注射過量麻醉劑致死，快速斷頭取腦。無菌條件下取出正常組、假手術組大鼠正常腦組織及腦缺血灌注組大鼠缺血區腦組織，采用RNAiso Plus裂解細胞，三氯甲烷溶解總RNA，異丙醇沉淀RNA，沉淀RNA經無水乙醇洗滌后采用不含RNA酶的雙蒸水溶解。然后采用分光光度法測定RNA純度。精氨酰-tRNA合成酶基因擴增引物由Primer 3軟件進行設計，在上海生工生物技術公司合成。上游引物為5′-CATCAAATACGCCGACCTTT-3′，下游引物為5′-GTAAAATGCACCGTCCCAGT-3′，產物長度為233 bp；內參照為β-actin，其上游引物為5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游引物為5′-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3′，產物長度為462 bp。RNA反轉錄成cDNA及PCR擴增過程均嚴格按照試劑生產商提供的說明書進行。配制1.2%瓊脂糖凝膠電泳，10 μl PCR擴增產物(精氨酰-tRNA合成酶基因和β-actin基因)電泳。采用GDS8000凝膠成像系統及LEICA-Q500IW圖像分析系統進行電泳條帶分析，并計算精氨酰-tRNA合成酶mRNA相對表達量，精氨酰-tRNA合成酶mRNA相對表達量=精氨酰-tRNA合成酶mRNA/β-actin mRNA。

1.7Western Blotting法正常組、假手術組各選取4只大鼠，腦缺血再灌注組于再灌注2 h、6 h、12 h、24 h、48 h分別選取4只大鼠，注射過量麻醉劑致死，快速斷頭取腦。選取正常組、假手術組大鼠正常腦組織及腦缺血灌注組大鼠缺血區腦組織，勻漿后采用TBS緩沖液(50 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，5 mM CaCl，0.05%Brij-35，0.1 mM PMSF，pH 7.4)抽提，勻漿緩沖液4 ℃ 12 000 r/min離心20 min。取含細胞質成分的上清液，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。取70 μg蛋白溶液于10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉染到PVDF膜上。將轉染后的PVDF膜置于含5%脫脂牛奶和小牛血清的0.05% Tween-20的TBS緩沖液中用以封閉非特異性抗體。室溫下一抗(精氨酰-tRNA合成酶1∶500，β-actin 1∶1 000)和PVDF膜反應2 h，然后加入二抗反應2 h。試劑盒(增強化學發光法)用作抗體檢測。PVDF膜置于X線膠片下，采用化學發光法UVP ImageStore 5000 cobine系統對獲取的條帶進行光密度測定和定量分析。精氨酰-tRNA合成酶蛋白相對表達量=精氨酰-tRNA合成酶蛋白/β-actin蛋白。

2結果

2.1局灶性腦缺血再灌注模型的建立及穩定性各組大鼠動脈壓、肛溫、動脈血氧分壓、血糖、心率及呼吸頻率比較，差異均無統計學意義(P>0.05，見表1)。對局灶性腦缺血再灌注大鼠蘇醒后進行行為觀察及腦組織切片TTC染色，結果顯示，40只大鼠均出現左側Horner征、右前爪不能伸直、行走時向右轉圈或向右傾倒。

Table 1Comparison of arterial pressure，rectal temperature，arterial oxygen partial pressure，blood glucose，heart rate，respiratory rate in the three groups

組別例數動脈壓(mmHg)肛溫(℃)動脈血氧分壓(kPa)血糖(mmol/L)心率(次/min)呼吸頻率(次/min)正常組 8 98±7 35.2±0.5514.7±0.43.6±0.1392±2273±10假手術組 8 98±12 35.6±0.7014.4±0.43.6±0.2387±1776±7腦缺血再灌注組40104±935.4±0.6514.5±0.73.5±0.1390±1177±8F值0.450.350.250.310.070.16P值0.650.720.780.750.930.86

注：1 mm Hg=0.133 kPa

2.2各組大鼠精氨酰-tRNA合成酶mRNA及蛋白表達情況各組大鼠精氨酰-tRNA合成酶mRNA相對表達量及蛋白相對表達量比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。假手術組與腦缺血再灌注組大鼠再灌注2 h、48 h精氨酰-tRNA合成酶mRNA相對表達量及蛋白相對表達量比較，差異無統計學意義(P>0.05)；假手術組大鼠精氨酰-tRNA合成酶mRNA相對表達量及蛋白相對表達量均低于腦缺血再灌注組再灌注6 h、12 h及24 h，差異有統計學意義(P<0.05)；腦缺血再灌注組大鼠再灌注6 h精氨酰-tRNA合成酶mRNA相對表達量及蛋白相對表達量均高于再灌注2 h及12 h，差異有統計學意義(P<0.05)；腦缺血再灌注組大鼠再灌注24 h精氨酰-tRNA合成酶mRNA相對表達量及蛋白相對表達量均高于再灌注12 h及48 h，差異有統計學意義(P<0.05，見表2，圖1～2)。

3討論

哺乳動物冬眠狀態下體溫下降、氧耗減少、心率減慢及可調節性細胞、組織代謝抑制。NATHANIEL[3]認為機體可調節性細胞、組織代謝抑制是防治腦缺血缺氧損傷的新策略之一。ASAMI等[4]研究認為，減少氧耗、降低細胞代謝能夠減輕組織器官缺血缺氧性損傷(包括腦損傷)，其可能成為臨床治療重癥疾病的重要研究方向之一。趙睿等[5]對冬眠動物北極地松鼠進行離體細胞培養發現，在體外缺氧和葡萄糖匱乏條件下培養其海馬區神經元幾乎未遭受任何損傷；用同樣方法培養人類海馬區神經元則發現細胞嚴重損傷且細胞數量大量減少；進一步研究發現，這種對缺氧缺糖的耐受能力歸因于能源物質匱乏促發了北極地松鼠神經元再生；且通過研究ATP產量推測，在缺血缺氧條件下北極地松鼠神經元能量代謝率急劇降低[6]。

Table 2Comparison of relative expression quantity of arginyl-tRNA synthetase mRNA and arginyl-tRNA synthetase protein in the three groups

組別只數精氨酰-tRNA合成酶mRNA相對表達量精氨酰-tRNA合成酶蛋白相對表達量正常組40.77±0.050.48±0.06假手術組40.78±0.050.49±0.06腦缺血再灌注組再灌注2h40.85±0.05b0.55±0.07b腦缺血再灌注組再灌注6h41.39±0.12a0.92±0.11a腦缺血再灌注組再灌注12h41.06±0.10abc0.66±0.09abc腦缺血再灌注組再灌注24h41.69±0.16a1.02±0.10a腦缺血再灌注組再灌注48h40.60±0.06c0.36±0.08cF值69.7234.29P值0.000.00

注：與假手術組比較，aP<0.05；與腦缺血再灌注組再灌注6 h比較，bP<0.05；與腦缺血再灌注組再灌注24 h比較，cP<0.05

圖1　3組大鼠精氨酰-tRNA合成酶mRNA表達情況

Figure 1Expression of arginyl-tRNA synthetase mRNA in the three groups

圖2　3組大鼠精氨酰-tRNA合成酶蛋白表達情況

Figure 2Expression of arginyl-tRNA synthetase protein in the three groups

氨基酰-tRNA合成酶作為蛋白質生物合成過程中的一類關鍵酶，其底物是氨基酸、tRNA 和ATP。通常細胞中含有20種氨基酰-tRNA合成酶，根據保守序列和特征結構花式不同可分為兩大類，各包括10種氨基酰-tRNA合成酶，且每種氨基酰-tRNA合成酶對應一種氨基酸和相應的tRNA。氨基酰-tRNA合成酶可催化相應tRNA的氨基酰化，氨基酰化的tRNA 通過tRNA的反密碼子與mRNA上的密碼子配對，在核糖體上將氨基酸依次連接并合成蛋白質[6]。

2009年ANDERSON等[1]通過RNAi技術抑制了線蟲體內氨基酰-tRNA合成酶的表達，結果發現氨基酰-tRNA合成酶基因沉默后蛋白質翻譯明顯減少，其低氧耐受能力明顯增強，缺氧所致的死亡率明顯降低，且低氧耐受能力與蛋白質翻譯水平呈負相關。以上研究結果表明，抑制氨基酰-tRNA合成酶基因能夠抑制蛋白質翻譯，導致細胞生物學行為變化，如ATP消耗減少等,故推測蛋白質翻譯減少導致能量消耗急劇下降是冬眠動物在長期缺氧環境下存活的一種行之有效的內在機制。KAMPHUIS等[7]對大鼠視網膜細胞缺血60 min前進行5 min缺血預處理，采用微陣列技術分析了104個已知基因在缺血預處理后1～7 d的表達情況；結果發現，缺血預處理能夠完全阻止后續缺血對視網膜的損傷，對視網膜具有保護作用，同時發現編碼氨基酰-tRNA合成酶的基因(Iars，Lars，Cars，Yars，Gars，Tars)表達明顯下調，缺血預處理后24 h和48 h下降幅度達30%～45%；定量PCR結果顯示，Iars、Lars、Cars、Yars、Tars等基因的轉錄在缺血預處理后24 h平均下降31.7%，在缺血預處理后48 h平均下降 49.3%；微陣列探針發現14個已知的氨基酰-tRNA合成酶中9個在缺血預處理后24 h和48 h轉錄減少，提示缺血預處理對視網膜細胞的保護作用與缺血預處理后參與氨基酸代謝和轉運過程的氨基酰-tRNA合成酶和基因轉錄減少有關，因此推測氨基酰-tRNA合成酶基因轉錄減少和功能降低可能是保護視網膜細胞的一種有效機制。另有研究顯示，采用放線菌酮抑制蛋白質合成能夠降低腦[8]和脊髓[9-10]的缺血性損傷，有助于維持細胞存活，但蛋白質合成的全面下調如何介導神經保護作用機制目前尚不清楚。

目前，臨床上針對哺乳動物氨基酰-tRNA合成酶的研究主要集中在精氨酰-tRNA合成酶[11-12]、亮氨酰-tRNA合成酶[13]、甲硫氨酰-tRNA合成酶[14]、丙氨酰-tRNA合成酶[15]的結構和功能方面，對哺乳動物尤其是大鼠腦缺血與氨基酰-tRNA合成酶關系的研究報道極少。本研究結果顯示，正常組、假手術組大鼠腦組織及缺血再灌注組大鼠缺血區腦組織中均有精氨酰-tRNA合成酶的表達，且正常組和假手術組大鼠精氨酰-tRNA合成酶mRNA及蛋白相對表達量間無差異，提示假手術對精氨酰-tRNA合成酶的表達無影響。本研究結果亦顯示，假手術組大鼠精氨酰-tRNA合成酶mRNA相對表達量及蛋白相對表達量均低于腦缺血再灌注組再灌注6 h、12 h及24 h，腦缺血再灌注組大鼠再灌注6 h精氨酰-tRNA合成酶mRNA相對表達量及蛋白相對表達量均高于再灌注2 h和12 h，腦缺血再灌注組大鼠再灌注24 h精氨酰-tRNA合成酶mRNA相對表達量及蛋白相對表達量均高于再灌注12 h和48 h，表明精氨酰-tRNA合成酶表達在局灶性腦缺血再灌注6 h和24 h出現兩個高峰，可能與缺血和再灌注兩次損傷有關。精氨酰-tRNA合成酶mRNA表達與蛋白表達規律相似，但分析數據發現蛋白表達強度弱于mRNA表達強度，其原因有待進一步分析。

綜上所述，大鼠局灶性腦缺血再灌注6 h及24 h精氨酰-tRNA合成酶表達明顯升高，分析其機制可能如下：受細胞缺氧、去極化、K+水平升高等因素影響，機體通過某種機制導致細胞氨基酰-tRNA合成酶活性增加，進而增加腦缺血再灌注組織腦細胞的蛋白質合成以穩定缺血腦細胞的結構，進而維持正常的細胞功能；而腦缺血損傷導致精氨酰-tRNA合成酶代償性增多，在再灌注后缺氧情況得到改善，精氨酰-tRNA合成酶表達隨之降低，但隨著再灌注損傷出現，細胞代謝紊亂進一步加重，為了維持細胞結構穩定精氨酰-tRNA合成酶再次代償性增多。因此筆者推測大鼠局灶性腦缺血再灌注后6 h及24 h精氨酰-tRNA合成酶兩次增高可能與缺血和再灌注兩次損傷有關，精氨酰-tRNA合成酶基因和蛋白表達增加可能是哺乳動物腦缺血再灌注后的一種機體自我修復機制。

作者貢獻：沈寅、符榮進行實驗設計、撰寫論文、成文并對文章負責；沈寅、范云志、范宇蔥進行實驗實施、評估、資料收集；符榮進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

參考文獻

[1]ANDERSON L L，MAO X，SCOTT B A，et al.Survival from hypoxia in C.elegans by inactivation of aminoacyl-tRNA synthetases[J].Science，2009，323(5914)：630-633.

[2]STOREY K B，STOREY J M.Metabolic rate depression in animals：transcriptional and translational controls[J].Biol Rev Camb Philos Soc，2004，79(1)：207-233.

[3]NATHANIEL T I.Brain-regulated metabolic suppression during hibernation：a neuroprotective mechanism for perinatal hypoxia-ischemia[J].Int J Stroke，2008，3(2)：98-104.

[4]ASLAMI H，JUFFERMANS N P.Induction of a hypometabolic state during critical illness——a new concept in the ICU?[J].Neth J Med，2010，68(5)：190-198.

[5]趙睿，高凱，于常海.腦能量代謝研究的回顧與前瞻[J].科學，2009，61(3)：11-14.

[6]ROSS A P，CHRISTIAN S L，ZHAO H W，et al.Persistent tolerance to oxygen and nutrient deprivation and N-methyl-D-aspartate in cultured hippocampal slices from hibernating Arctic ground squirrel[J].J Cereb Blood Flow Metab，2006，26(9)：1148-1156.

[7]KAMPHUIS W，DIJK F，VAN SOEST S，et al.Global gene expression profiling of ischemic preconditioning in the rat retina[J].Mol Vis，2007，28(13)：1020-1030.

[8]KATO H，KANELLOPOULOS G K，MATSUO S，et al.Protection of rat spinal cord from ischemia with dextrorphan and cycloheximide：effects on necrosis and apoptosis[J].J Thorac Cardiovasc Surg，1997，114(4)：609-618.

[9]SNIDER B J，DU C，WEI L，et al.Cycloheximide reduces infarct volume when administered up to 6 h after mild focal ischemia in rats[J].Brain Res，2001，917(2)：147-157.

[10]LIANG C L，YANG L C，LU K，et al.Neuroprotective synergy of N-methyl-D-aspartate receptor antagonist(MK801) and protein synthesis inhibitor(cycloheximide) on spinal cord ischemia-reperfusion injury in rats[J].J Neurotrauma，2003，20(2)：195-206.

[11]RODOVICIUS H，BURNECKIENE J.Seasonal differences in activities of rabbit liver tRNA and aminoacyl-tRNA synthetases specific for valine and arginine under myocardial ischemia[J].Medicina(Kaunas)，2006，42(3)：225-230.

[12]YANG F，XIA X，LEI H Y，et al.Hemin binds to human cytoplasmic arginyl-tRNA synthetase and inhibits its catalytic activity[J].J Biol Chem，2010，285(50)：39437-39446.

[13]CHEN X，MA J J，TAN M，et al.Modular pathways for editing non-cognate amino acids by human cytoplasmic leucyl-tRNA synthetase[J].Nucleic Acids Res，2011，39(1)：235-247.

[14]G?TZ A，TYYNISMAA H，EURO L，et al.Exome sequencing identifies mitochondrial alanyl-tRNA synthetase mutations in infantile mitochondrial cardiomyopathy[J].Am J Hum Genet，2011，13(5)：635-642.

[15]JONES T E，ALEXANDER R W，PAN T.Misacylation of specific nonmethionyl tRNAs by a bacterial methionyl-tRNA synthetase[J].Proc Natl Acad Sci USA，2011，26(17)：6933-6938.

(本文編輯：謝武英)

基金項目：國家自然科學基金項目(81371453)

通信作者：符榮，430030湖北省武漢市，華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院神經外科；E-mail：FurongLP@163.com

【中圖分類號】R 743.31

【文獻標識碼】A

DOI:10.3969/j.issn.1008-5971.2016.06.014

Corresponding author：FU Rong，Department of Neurosurgery，Union Hospital Affiliated to Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China；E-mail：FurongLP@163.com

(收稿日期：2016-02-16；修回日期：2016-06-07)

Expression of Arginyl-tRNA Synthetase in Rats With Focal Cerebral Ischemia Reperfusion and the Mechanism

SHENYin，FANYun-zhi，FANYu-cong，FURong.

DepartmentofNeurosurgery，UnionHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

【Abstract】BackgroundsAt present，aminoacyl-tRNA synthetase related clinical studies mostly concentrate on the structure and function of arginyl-tRNA synthetase，leucyl-tRNA synthetase，methionyl-tRNA synthetase and alanyl-tRNA synthetase，research reports about relationship between aminoacyl-tRNA synthetase and cerebral ischemia is relatively rare.ObjectiveTo explore the expression of arginyl-tRNA synthetase in rats with focal cerebral ischemia reperfusion and the mechanism.MethodsAt first，4 out of 60 clean healthy male SD rats were selected to carry out the preliminary experiment，then the other 56 rats were randomly divided into A group(n=8)，B group(n=8)and C group(n=40)；focal cerebral ischemia reperfusion model was prepared by suture-occluded method(by embolization of middle cerebral artery).Rats of A group did not received any surgical intervention，rats of C group prepared for focal cerebral ischemia reperfusion model，while rats of B group received same surgical intervention without line-lock of internal carotid or cerebral ischemia.RT-PCR was used to detect the relative expression quantity of arginyl-tRNA synthetase mRNA，Western Blotting method was used to detect the relative expression quantity of arginyl-tRNA synthetase protein.ResultsAfter 2 hours and 48 hours of reperfusion，no statistically significant differences of relative expression quantity of arginyl-tRNA synthetase mRNA or arginyl-tRNA synthetase protein was found between B group and C group(P>0.05)；after 6 hours，12 hours and 24 hours of reperfusion，the relative expression quantity of arginyl-tRNA synthetase mRNA and arginyl-tRNA synthetase protein of B group were statistically significantly lower than those of C group(P<0.05).After 6 hours of reperfusion，the relative expression quantity of arginyl-tRNA synthetase mRNA and arginyl-tRNA synthetase protein of C group were statistically significantly higher than those after 2 hours and 12 hours of reperfusion(P<0.05)；after 24 hours of reperfusion，the relative expression quantity of arginyl-tRNA synthetase mRNA and arginyl-tRNA synthetase protein of C group were statistically significantly higher than those after 12 hours and 48 hours of reperfusion(P<0.05).ConclusionAfter 6 hours and 12 hours of reperfusion，the expression of arginyl-tRNA synthetase is significantly elevated in rats with focal cerebral ischemia reperfusion，its mechanism is possibly related with the double damage of ischemia and reperfusion.

【Key words】Brain ischemia；Reperfusion injury；Arginyl-tRNA synthetase