芍藥總多糖抑齲作用的體外研究

李賀　李艷　趙今

[摘要]目的：對比不同質量濃度下芍藥總多糖對變異鏈球菌、血鏈球菌、黏性放線菌生長、產酸及合成水不溶性多糖（water insoluble glucan，WIG）含量的影響。方法：自行提取芍藥總多糖，連續稀釋法測定芍藥總多糖對變異鏈球菌、血鏈球菌、黏性放線菌生長的最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）與最低殺菌濃度（minimal bactericidalconcentration，MBC）；將芍藥總多糖倍比稀釋為小于MIC的4個質量濃度組，以腦心浸液液體培養基為空白對照組，加入108CFU/ml的變異鏈球菌、血鏈球菌、黏性放線菌菌懸液，厭氧培養24h及.48h。pH計測定pH值，計算ΔpH值（初始pH～終末pH）。蒽酮法測定WIG含量。結果：①芍藥總多糖對變異鏈球菌、血鏈球菌、黏性放線菌生長均有抑制作用，其最低抑菌濃度變異鏈球菌為110.4mg/ml，血鏈球菌為27.6 mg/ml，黏性放線菌為13.8 mg/ml；②培養48h后，ZXpH值均隨芍藥總多糖質量濃度的增大而減小。變異鏈球菌實驗組除1/4MIC、1/2MIC組之外，其余各組間的ApH值差異無統計學意義（P>0.05）。血鏈球菌1/2MIC組同對照組間有統計學意義（P<0.05）。黏性放線菌各組間差異無明顯統計學意義（P>0.05）；③培養24h，WIG含量隨芍藥總多糖質量濃度的增大而減小。變異鏈球菌1/2MIC組及血鏈球菌1/4MIC及1/2MI組同對照組差異有統計學意義（P<0.05）。結論：芍藥總多糖對浮游狀態下的變異鏈球菌、血鏈球菌、黏性放線菌的生長及變異鏈球菌、血鏈球菌產糖、產酸有不同程度抑制作用。

[關鍵詞]芍藥；總多糖；生長；產酸；防齲

[中圖分類號]R781 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2016）04-0041-04

芍藥總多糖是從芍藥中提取出的主要活性物質。武新華等報道芍藥提取物能夠不同程度抑制金黃色葡萄球菌、傷寒桿菌等的生長，而其對口腔細菌的影響尚不明確。變異鏈球菌、血鏈球菌及黏性放線菌均為是口腔常駐菌。變異鏈球菌是菌斑生物被膜的常見菌，是與齲病發生關系密切的致病菌。血鏈球菌在牙菌斑生物被膜形成和細菌在牙體硬組織上聚集定植都有著重要作用。黏性放線菌對其他致齲菌進一步的粘附定居有協同作用。這些細菌在齲病形成的過程中發揮著重要作用。本實驗選擇了以上細菌作為實驗菌株，研究芍藥總多糖化學組分對浮游狀態下變異鏈球菌、血鏈球菌及黏性放線菌的生長及產酸、產水不溶性胞外多糖作用的影響，進一步探索評估其防齲效能。

1材料和方法

1.1實驗菌株、儀器及菌懸液、試劑制備。

1.1.1實驗菌株：變異鏈球菌ATCC 76100、血鏈球菌ATCC10556及黏性放線菌ATCC 19246均由口腔生物醫學工程教育部重點實驗室口腔生物學研究室提供。

1.1.2實驗儀器：隔水式電熱恒溫培養箱（上海精宏實驗設備有限公司，DNP 9162），二氧化碳恒溫培養箱（Forma Direct heat c02 Incubator Thermo Fisher Scientific，P.O.Box 649Marietta，OH 45750，USA），電熱壓力蒸汽滅菌器（YXQ LM SII，上海迅博實業有限公司醫療設備制造廠），低溫超速離心機（德國艾本德eppendorf，型號5417C），pH計（北京賽多利斯儀器系統有限公司，Sartorius AG），分光光度計（上海棱光技術有限公司，Spectrumlab 22型），酶聯免疫檢測儀（Human，德國）。

1.1.3菌懸液制備及試劑配置

1.1.3.1菌懸液：將實驗菌株接種于BHI-S瓊脂血平板，置厭氧箱中37℃下復蘇48h，涂片鏡檢，隨機選取菌株行生化鑒定，確定為單純培養后于BHI固體培養基接種傳代，置37℃下厭氧培養24h。檢查菌落生長形態，鏡檢無污染，接種環挑選單菌落移至BHI液體培養基中同樣條件下培養18h增菌；應用分光光度計測定菌懸液濃度，BHI培養液稀釋上述培養物，并用比濁儀校正至1.0McFarland（相當于3×10³CFU/ml）。

1.1.3.2蒽酮試劑：稱取200mg蒽酮溶解于100ml濃硫酸中，充分攪拌溶解，置于4℃保存。

1.1.3.3芍藥總多糖：新疆赤芍（新疆阿勒泰產，經新疆醫科大學中醫學院鑒定）。

1.2實驗方法

1.2.1芍藥總多糖對口腔細菌最低抑菌濃度及最低殺菌濃度（MBC）的測定：將提取的芍藥總多糖干粉0.552g，過微孔濾膜后（0.22μm），用生理鹽水配成濃度為110.4mg/ml的原液。將原液稀釋溶于BHI液體培養基中。并倍比稀釋為六個濃度梯度，使其最終濃度達到3.45、6.9、13.8、27.6、55.2、110.4mg/ml。將細菌懸液與各組藥液倍比稀釋（V/V），接種后震蕩60s后，置于20%CO₂，36℃下厭氧培養48h。置于暗色、無反光物體表面，肉眼觀察無渾濁出現的最低藥物濃度為其MIC（最低抑菌濃度）值；若結果不易判斷，挑取少量菌液接種于BHI固體培養基上，置于20%CO₂，36℃下厭氧培養48h，觀察是否有菌落生長。最低抑菌濃度測定重復3次。選擇大于最低抑菌濃度濃度的各孔，混勻培養基，分別取20μl涂于BHI固體培養基，相同條件下培養24h，觀察菌落少于5～6個的最低濃度為最低殺菌濃度（MBC）。實驗分組，陽性對照組：含1%葡萄糖的BHI菌懸液液體培養基，每組4個平行；陰性對照組：含0.05%洗必泰，每組4個平行；實驗組：含6種不同濃度芍藥總多糖，每組4個平行。

1.2.2芍藥總多糖對口腔三種致齲菌產酸作用影響的測定：用BHI液體培養基將芍藥總多糖配成最低抑菌濃度濃度值，另配含5%蔗糖的PBS緩沖液，用酸度計將兩者調定初始pH值為7.4，高壓滅菌器中0.1MPa、121.5℃高壓15min，根據芍藥總多糖對上述三種致齲菌的最低抑菌濃度測定結果，將待測藥液按倍比稀釋法配置成最低抑菌濃度值以下的4個不同濃度的實驗組，每組3平行管。菌懸液與藥液按1：10（V/V）分別接種3種細菌，10%C02，36℃厭氧箱中培養48h，利用PH計測定其pH值，并計算ApH值（初始pH～終末pH）?？瞻讓φ战M以空的培養基ApH值。實驗包括4個不同濃度的實驗組與1個不含藥物的空白對照組。實驗重復3次。

1.2.3 WIG含量測定：蒽酮法測葡聚糖標準曲線，計算胞外wIG含量。

1.2.4數據分析：使用SPSS19.0統計軟件分析，采用單因素方差分析進行分析。若差異用統計學意義，采用單因素方差分析Dunnett t雙側檢驗進一步比較各實驗組間及實驗組與對照組問的差異，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1 MIC測量結果

芍藥總多糖對變異鏈球菌、黏性放線菌、血鏈球菌均有抑制作用，其最低抑菌濃度分別是變異鏈球菌為110.4mg/ml，血鏈球菌為27.6mg/ml，黏性放線菌為13.8 mg/ml。

2.2芍藥總多糖對口腔三種致齲菌產酸作用影響的測定

不同質量濃度芍藥總多糖△pH值見表1。變異鏈球菌、血鏈球菌及黏性放線菌產酸隨著芍藥總多糖濃度的升高而減少。培育48h，變異鏈球菌對照組、1/16MIC、1/SMIC的△pH值的差異無統計學意義（P>0.05），1/4MIC、1/2MIC的△pH值的差異有統計學意義（P<0.05），提示1/4MIC、1/2MIC質量濃度的芍藥總多糖可較長久抑制變異鏈球菌產酸。同理1/2MIc質量濃度芍藥總多糖可較長時間抑制血鏈球菌。而芍藥總多糖對黏性放線菌產酸能力的影響與對照組相比無統計學差異。

2.3芍藥總多糖對致齲菌合成WIG的影響

不同質量濃度芍藥總多糖合成WIG的抑制實驗結果見表2?？梢姡?/2MIC及I/4MIC、1/2MIC質量濃度的芍藥總多糖分別對變異鏈球菌，血鏈球菌產生水不溶性胞外多糖的抑制作用較強（P<0.05）。同時其在實驗濃度下對黏性放線菌產糖幾乎沒有作用。

3討論

現代口腔生態學觀點認為：變異鏈球菌、黏性放線菌、血鏈球菌為主要的口腔致齲細菌，齲病的發生是口腔微生態系統失衡的結果。研究表明變異鏈球菌在恒牙和乳牙齲病的發生和發展過程中都起著重要的作用，是齲病的主要致病菌，并被認為是口腔生物膜中致齲性最強的微生物之一。血鏈球菌是菌斑生物被膜最初形成過程中較早粘附定植的菌群。黏性放線菌在菌斑生物膜中對變異鏈球菌粘附聚集牙面有協同作用，協同促進根面菌斑形成及根面齲的發生。本實驗選擇了3種標準菌株，即變異鏈球菌、血鏈球菌及黏性放線菌，以研究藥物對浮游狀態口腔主要致齲菌的影響。其中血鏈球菌為口腔菌斑形成的先鋒菌，黏性放線菌則可介導多種口腔細菌在菌斑中的集聚，而變異鏈球菌則是主要致齲菌。這樣的菌株選擇能夠較大程度上反應口腔細菌菌群構成。

近年，天然藥物因藥理活性強、毒性低、來源豐富等優點，其在齲病防治中的優勢日益顯著。目前已發現許多天然藥物都具有防齲作用。新疆赤芍是新疆芍藥和塊根芍藥的總稱，產于新疆阿勒泰地區，為傳統的活血化瘀類中藥。目前現有文獻報道了芍藥粗提物可不同程度抑制金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌的生長。但其對口腔主要致齲菌影響研究甚少。本實驗提取新疆赤芍中的總多糖，就浮游狀態下的上述三種細菌，測定總多糖對其生長、產酸、產糖作用的影響，評估其防齲效能。

本實驗結果顯示，芍藥總多糖對變異鏈球菌、血鏈球菌及黏性放線菌的生長均具有較強的抑制作用，對浮游狀態下的變異鏈球菌及血鏈球菌的產酸、產水不溶性胞外多糖有著較強的抑制作用。因此，可推測芍藥總多糖能有效抑制致齲菌的生長和代謝，抑制致齲菌的毒力因子，有一定的抑制致齲菌的效果。

編輯/張惠娟