微型大白菜“娃娃菜”優(yōu)異雙單倍體的創(chuàng)制與評價

王麗麗+王鑫++吳海東++田云+呂艷玲

摘要：以7個“娃娃菜”優(yōu)良雜交種為試材進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件建立高效培養(yǎng)體系。結(jié)果表明，不同基因型間的小孢子胚誘導(dǎo)能力差異極顯著，33 ℃條件熱擊48 h，胚誘導(dǎo)率達(dá)最大值；NLN-13+0.05 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA為適宜的誘胚培養(yǎng)基，MS+3%蔗糖+0.75%瓊脂+0.1 g/L活性炭是小孢子植株繼代和壯苗的適宜培養(yǎng)基，MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂+0.1 mg/L NAA是小孢子植株適宜的生根培養(yǎng)基。通過游離小孢子培養(yǎng)，獲得大量的小孢子胚狀體和再生植株195株，篩選獲得2個優(yōu)異的雙單倍體（DH系）植株。

關(guān)鍵詞：微型大白菜；游離小孢子培養(yǎng)；胚狀體；再生植株；娃娃菜；雙單倍體（DH系）；熱擊

中圖分類號： S634.102.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0236-03

收稿日期：2016-01-07

基金項(xiàng)目：遼寧省科學(xué)事業(yè)公益基金（編號：2013002001）。

作者簡介：王麗麗（1981—），女，河北滄州人，博士，助理研究員，主要從事十字花科蔬菜遺傳育種研究。E-mai：wanglili_81@163.com。

通信作者：田云，碩士，副研究員。E-mail：cloudtian@163.com。大白菜是我國主要的蔬菜作物之一，備受育種工作者的關(guān)注。隨著消費(fèi)者對大白菜的球色、品質(zhì)提出更高要求，為滿足市場和消費(fèi)者需求，研究者傾向于注重球色、品質(zhì)以及品種的新、奇、特等開展各種類型大白菜品種的育種研究。“娃娃菜”別稱微型大白菜，其名字起源于中國，是一種小株型、具有特殊食用價值的大白菜，外形美觀、可密植、耐貯藏、耐運(yùn)輸，可保證產(chǎn)品的整齊一致，有利于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。娃娃菜由于生長周期一般為45～50 d，相對較短，因此病蟲害也較普通大白菜少，在生長過程中施用農(nóng)藥量也少，是一種綠色、安全的蔬菜。另外，娃娃菜纖維含量較少，營養(yǎng)物質(zhì)含量更加豐富，口感更好。盡管“娃娃菜”的概念起源于中國，產(chǎn)地和消費(fèi)市場均在中國，但我國開展娃娃菜育種較國外晚，目前市場上使用最多的卻是韓國和日本品種，選育具有自主知識產(chǎn)權(quán)的娃娃菜品種是亟待解決的問題。

游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)在花椰菜、菜薹、芥藍(lán)、普通白菜、大白菜、青梗菜、小松菜等多種蕓薹屬農(nóng)作物[1-7]上獲得成功，用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)創(chuàng)制的雙單倍體純系（DH系）作親本可以加快育種進(jìn)程。本試驗(yàn)選用引自韓國的4個娃娃菜雜交種及國內(nèi)3個娃娃菜雜交種為材料，對影響娃娃菜胚狀體發(fā)生及其成苗的關(guān)鍵因素如基因型、低溫預(yù)處理及激素等進(jìn)行系統(tǒng)分析，以更好地利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)創(chuàng)制新、奇、特蔬菜品種DH系，創(chuàng)新種質(zhì)資源，豐富大白菜品種類型。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2013年9月在遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所基地進(jìn)行，試驗(yàn)材料共7個，分別為愛娃、小巧娃娃菜、明月黃娃娃菜、金玲等4個引自韓國的娃娃菜雜交種及秀麗娃娃菜、津夏三號、金春娃2號等3個中國產(chǎn)的娃娃菜雜交種。試材分3批播種，第1批于8月下旬開始，將萌動種子在4 ℃冰箱中春化處理25 d，9月下旬播種于穴盤，11月初栽植于花盆中溫室培育，12月中旬至翌年3月開花取樣；第2、第3批試材各延遲30 d播種，春化及定植時間順延。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1游離小孢子培養(yǎng)方法小孢子培養(yǎng)采用常規(guī)方法，略有改進(jìn)。開花期，采集健壯植株上長2～3 mm的花蕾，用流動的清水沖洗5 min，75%乙醇表面消毒30 s，再用0.1% HgCl2溶液滅菌8 min，無菌水洗滌3次，每次5 min；瀝干水分，B5液體洗滌培養(yǎng)基中用玻璃棒碾壓花蕾，擠出小孢子；小孢子懸浮液經(jīng)孔徑為50 μm的尼龍網(wǎng)過濾，1 100 r/min離心3 min；棄上清液，所得沉淀物即為純凈小孢子；將分離純化的小孢子用NLN-13培養(yǎng)基懸浮，用直徑為60 mm的培養(yǎng)皿分裝，每皿5 mL，Parafilm膜封口；33 ℃條件下暗培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)至25 ℃條件下暗培養(yǎng)，直至14～21 d長出肉眼可見的胚狀體。

1.2.2小孢子培養(yǎng)體系優(yōu)化處理方法將分離純化的小孢子懸浮液分別在33 ℃條件下進(jìn)行24、48、72 h熱擊暗培養(yǎng) 21 d，統(tǒng)計(jì)胚誘導(dǎo)率，比較33 ℃熱擊處理不同時間對小孢子胚發(fā)生的影響；在NLN-13培養(yǎng)基中添加不同濃度6-BA和NAA培養(yǎng)21 d，統(tǒng)計(jì)胚誘導(dǎo)率，比較培養(yǎng)基中6-BA、NAA濃度及其配比對小孢子胚發(fā)生的影響；將子葉形胚轉(zhuǎn)入到添加不同濃度6-BA和NAA的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)25 d，統(tǒng)計(jì)胚成苗率，比較MS培養(yǎng)基中6-BA、NAA濃度及其配比對小孢子胚成苗的影響；將分生苗轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，每25～30 d繼代1次，9月下旬，將經(jīng)過多次繼代培養(yǎng)獲得的試管苗轉(zhuǎn)入到添加不同濃度NAA的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)25 d左右誘導(dǎo)生根，后移至花盆中溫室培育。

1.3統(tǒng)計(jì)與分析方法

利用流式細(xì)胞儀鑒定再生植株倍性；應(yīng)用DPS 2000統(tǒng)計(jì)軟件采用鄧肯氏新復(fù)極法差對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同品種小孢子胚誘導(dǎo)情況

由表1可知，NLN-13培養(yǎng)基上培養(yǎng)小孢子14～21 d，7個參試品種中有3個品種誘導(dǎo)出胚狀體，誘導(dǎo)率為42.9%；不同品種間的胚誘導(dǎo)能力有極顯著差異，津夏三號相對最高，平均每蕾產(chǎn)胚為1.51個。

2.2小孢子胚誘導(dǎo)體系優(yōu)化

2.2.1熱擊處理對胚誘導(dǎo)的影響將分離純化的小孢子懸浮液在33 ℃條件下分別熱擊暗培養(yǎng)不同時間。由表2可知，熱擊處理對娃娃菜小孢子胚誘導(dǎo)能力的影響效果明顯，同一品種熱擊培養(yǎng)不同時間，其小孢子胚誘導(dǎo)能力差異極顯著；不進(jìn)行熱擊或熱擊培養(yǎng)24 h，津夏三號等3個品種均未誘導(dǎo)出小孢子胚狀體；熱擊48 h為最佳培養(yǎng)時間，胚誘導(dǎo)能量達(dá)到最大，津夏三號、秀麗娃娃菜、金春娃2號的平均每蕾產(chǎn)胚分別為1.35、1.08、0.45 個，熱擊超過48 h，胚誘導(dǎo)能力下降。

2.2.2激素濃度對小孢子胚狀體誘導(dǎo)的影響由表3可知，添加適宜濃度6-BA和NAA的NLN-13培養(yǎng)基可以提高胚狀體的誘導(dǎo)能力；胚狀體發(fā)生培養(yǎng)基適宜的激素濃度為 6-BA 0.05 mg/L+NAA 0.05 mg/L，以津夏三號的胚誘導(dǎo)效果最高，平均每蕾產(chǎn)胚1.35個。

2.2.3振蕩培養(yǎng)對小孢子胚狀體發(fā)育的影響將培養(yǎng)15 d的小孢子胚狀體在25 ℃恒溫?fù)u床上50 r/min繼續(xù)暗培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，與不振蕩培養(yǎng)相比，振蕩培養(yǎng)有利于促進(jìn)子葉形胚狀體的發(fā)育，胚狀體生長速度加快（圖1-A）。

2.3激素濃度對胚成苗的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，子葉形胚轉(zhuǎn)入不含任何激素的MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂+0.1 g/L活性炭培養(yǎng)基上培養(yǎng)14～21 d，子葉形胚形成愈傷組織（圖1-B），并沒有形成不定芽，而轉(zhuǎn)入含有 1 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA的MS+3%蔗糖+08%瓊脂+0.1 g/L活性炭培養(yǎng)基上培養(yǎng)，會分生出不定芽（圖1-C），添加激素濃度如過高，則影響不定芽的質(zhì)量，產(chǎn)生畸形苗。在實(shí)際操作過程中，最好先將子葉形胚轉(zhuǎn)入不含激素的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)，形成愈傷組織后再轉(zhuǎn)入含有激素的MS培養(yǎng)基，以促進(jìn)更多叢生苗的形成。

2.4繼代和生根培養(yǎng)

將獲得的小孢子分生苗轉(zhuǎn)入MS+3%蔗糖+0.75%瓊脂+0.1 g/L活性炭培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每隔25 d左右繼代1次，經(jīng)2～3次繼代，小孢子由纖弱植株逐漸復(fù)壯形成再生植株（圖1-D）；試管苗長到6～7片真葉時，將壯苗轉(zhuǎn)到MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂+0.1 mg/L NAA的生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)25 d左右即可生出粗壯、整齊的白色根系，煉苗后移栽至花盆在溫室中培育。目前，已經(jīng)獲得195株小孢子再生植株。須說明的是，小孢子植株繼代和壯苗培養(yǎng)過程中，在培養(yǎng)基中添加0.1 g/L的活性炭會有利于小孢子植株的復(fù)壯。

2.5DH系評價

對獲得的再生植株測定其育性及倍性，結(jié)果表明，獲得的195株再生植株，可育株有167株，不育株有28株，可育株中單倍體植株有4株，雙單倍體植株有155株，四倍體植株有8株。經(jīng)秋季田間性狀鑒定，篩選出2個優(yōu)良的DH系15W05、15W16（圖2）。

3討論與結(jié)論

目前，有對春結(jié)球黃心大白菜、抗根腫病大白菜、耐抽薹大白菜等游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)的研究報(bào)道[8-10]，主要是對影響胚狀體發(fā)生及其成苗的關(guān)鍵因素包括基因型、低溫預(yù)處理及激素等進(jìn)行系統(tǒng)分析，完善小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系。本試驗(yàn)將游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)與育種實(shí)踐相結(jié)合，重點(diǎn)研究娃娃菜游離小孢子的培養(yǎng)，旨在將該技術(shù)應(yīng)用于創(chuàng)制新、奇、特的大白菜品種，以豐富大白菜種質(zhì)資源。

蔣武生等開展基因型、高、低溫預(yù)處理、激素對大白菜胚胎發(fā)生影響的研究，結(jié)果表明，基因型是決定小孢子胚發(fā)生的重要因素之一；適當(dāng)?shù)牡蜏仡A(yù)處理或熱擊處理能夠提高小孢子胚的發(fā)生頻率；培養(yǎng)基中添加適宜濃度的激素6-BA、NAA能促進(jìn)小孢子胚狀體產(chǎn)生。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同品種娃娃菜的小孢子胚誘導(dǎo)能力差異顯著；影響小孢子胚狀體發(fā)生及發(fā)育的關(guān)鍵因素主要為熱擊處理、激素濃度及振蕩培養(yǎng)；胚狀體發(fā)生培養(yǎng)基中添加濃度均為0.05 mg/L的6-BA、NAA，小孢子胚誘導(dǎo)率最高，這與前人研究結(jié)果[11-12]一致。小孢子正常是通過不對稱核分裂后發(fā)育成花粉，而要讓小孢子發(fā)育成胚，就要阻斷原有的配子體發(fā)育，使小孢子進(jìn)行對稱性分裂向孢子體方向發(fā)育，才能誘導(dǎo)小孢子胚的發(fā)生[13-16]。姜立榮等觀察白菜小孢子發(fā)現(xiàn)，單核晚期，小孢子大部分都有1個清晰的占整個細(xì)胞50%以上的大液泡，25 ℃條件下小孢子會進(jìn)行不對稱分裂，而經(jīng)過32 ℃處理，對稱分裂成為其主要的分裂方式[13]。本試驗(yàn)中，熱擊預(yù)處理對娃娃菜小孢子胚發(fā)生的作用最為明顯，分離純化的小孢子懸浮液在33 ℃條件下熱擊 24 h，未誘導(dǎo)出小孢子胚狀體，熱擊48 h則胚誘導(dǎo)效果達(dá)到最大值，熱擊超過48 h時胚誘導(dǎo)能力下降，這說明熱擊處理也是影響小孢子胚發(fā)生的重要因素之一。

參考文獻(xiàn)：

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王麗麗 王鑫 吳海東 田云 呂艷玲

摘要：以7個“娃娃菜”優(yōu)良雜交種為試材進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件建立高效培養(yǎng)體系。結(jié)果表明，不同基因型間的小孢子胚誘導(dǎo)能力差異極顯著，33 ℃條件熱擊48 h，胚誘導(dǎo)率達(dá)最大值；NLN-13+0.05 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA為適宜的誘胚培養(yǎng)基，MS+3%蔗糖+0.75%瓊脂+0.1 g/L活性炭是小孢子植株繼代和壯苗的適宜培養(yǎng)基，MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂+0.1 mg/L NAA是小孢子植株適宜的生根培養(yǎng)基。通過游離小孢子培養(yǎng)，獲得大量的小孢子胚狀體和再生植株195株，篩選獲得2個優(yōu)異的雙單倍體（DH系）植株。

關(guān)鍵詞：微型大白菜；游離小孢子培養(yǎng)；胚狀體；再生植株；娃娃菜；雙單倍體（DH系）；熱擊

中圖分類號： S634.102.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0236-03

收稿日期：2016-01-07

基金項(xiàng)目：遼寧省科學(xué)事業(yè)公益基金（編號：2013002001）。

作者簡介：王麗麗（1981—），女，河北滄州人，博士，助理研究員，主要從事十字花科蔬菜遺傳育種研究。E-mai：wanglili_81@163.com。

通信作者：田云，碩士，副研究員。E-mail：cloudtian@163.com。大白菜是我國主要的蔬菜作物之一，備受育種工作者的關(guān)注。隨著消費(fèi)者對大白菜的球色、品質(zhì)提出更高要求，為滿足市場和消費(fèi)者需求，研究者傾向于注重球色、品質(zhì)以及品種的新、奇、特等開展各種類型大白菜品種的育種研究。“娃娃菜”別稱微型大白菜，其名字起源于中國，是一種小株型、具有特殊食用價值的大白菜，外形美觀、可密植、耐貯藏、耐運(yùn)輸，可保證產(chǎn)品的整齊一致，有利于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。娃娃菜由于生長周期一般為45～50 d，相對較短，因此病蟲害也較普通大白菜少，在生長過程中施用農(nóng)藥量也少，是一種綠色、安全的蔬菜。另外，娃娃菜纖維含量較少，營養(yǎng)物質(zhì)含量更加豐富，口感更好。盡管“娃娃菜”的概念起源于中國，產(chǎn)地和消費(fèi)市場均在中國，但我國開展娃娃菜育種較國外晚，目前市場上使用最多的卻是韓國和日本品種，選育具有自主知識產(chǎn)權(quán)的娃娃菜品種是亟待解決的問題。

游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)在花椰菜、菜薹、芥藍(lán)、普通白菜、大白菜、青梗菜、小松菜等多種蕓薹屬農(nóng)作物[1-7]上獲得成功，用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)創(chuàng)制的雙單倍體純系（DH系）作親本可以加快育種進(jìn)程。本試驗(yàn)選用引自韓國的4個娃娃菜雜交種及國內(nèi)3個娃娃菜雜交種為材料，對影響娃娃菜胚狀體發(fā)生及其成苗的關(guān)鍵因素如基因型、低溫預(yù)處理及激素等進(jìn)行系統(tǒng)分析，以更好地利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)創(chuàng)制新、奇、特蔬菜品種DH系，創(chuàng)新種質(zhì)資源，豐富大白菜品種類型。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2013年9月在遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所基地進(jìn)行，試驗(yàn)材料共7個，分別為愛娃、小巧娃娃菜、明月黃娃娃菜、金玲等4個引自韓國的娃娃菜雜交種及秀麗娃娃菜、津夏三號、金春娃2號等3個中國產(chǎn)的娃娃菜雜交種。試材分3批播種，第1批于8月下旬開始，將萌動種子在4 ℃冰箱中春化處理25 d，9月下旬播種于穴盤，11月初栽植于花盆中溫室培育，12月中旬至翌年3月開花取樣；第2、第3批試材各延遲30 d播種，春化及定植時間順延。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1游離小孢子培養(yǎng)方法小孢子培養(yǎng)采用常規(guī)方法，略有改進(jìn)。開花期，采集健壯植株上長2～3 mm的花蕾，用流動的清水沖洗5 min，75%乙醇表面消毒30 s，再用0.1% HgCl2溶液滅菌8 min，無菌水洗滌3次，每次5 min；瀝干水分，B5液體洗滌培養(yǎng)基中用玻璃棒碾壓花蕾，擠出小孢子；小孢子懸浮液經(jīng)孔徑為50 μm的尼龍網(wǎng)過濾，1 100 r/min離心3 min；棄上清液，所得沉淀物即為純凈小孢子；將分離純化的小孢子用NLN-13培養(yǎng)基懸浮，用直徑為60 mm的培養(yǎng)皿分裝，每皿5 mL，Parafilm膜封口；33 ℃條件下暗培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)至25 ℃條件下暗培養(yǎng)，直至14～21 d長出肉眼可見的胚狀體。

1.2.2小孢子培養(yǎng)體系優(yōu)化處理方法將分離純化的小孢子懸浮液分別在33 ℃條件下進(jìn)行24、48、72 h熱擊暗培養(yǎng) 21 d，統(tǒng)計(jì)胚誘導(dǎo)率，比較33 ℃熱擊處理不同時間對小孢子胚發(fā)生的影響；在NLN-13培養(yǎng)基中添加不同濃度6-BA和NAA培養(yǎng)21 d，統(tǒng)計(jì)胚誘導(dǎo)率，比較培養(yǎng)基中6-BA、NAA濃度及其配比對小孢子胚發(fā)生的影響；將子葉形胚轉(zhuǎn)入到添加不同濃度6-BA和NAA的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)25 d，統(tǒng)計(jì)胚成苗率，比較MS培養(yǎng)基中6-BA、NAA濃度及其配比對小孢子胚成苗的影響；將分生苗轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，每25～30 d繼代1次，9月下旬，將經(jīng)過多次繼代培養(yǎng)獲得的試管苗轉(zhuǎn)入到添加不同濃度NAA的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)25 d左右誘導(dǎo)生根，后移至花盆中溫室培育。

1.3統(tǒng)計(jì)與分析方法

利用流式細(xì)胞儀鑒定再生植株倍性；應(yīng)用DPS 2000統(tǒng)計(jì)軟件采用鄧肯氏新復(fù)極法差對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同品種小孢子胚誘導(dǎo)情況

由表1可知，NLN-13培養(yǎng)基上培養(yǎng)小孢子14～21 d，7個參試品種中有3個品種誘導(dǎo)出胚狀體，誘導(dǎo)率為42.9%；不同品種間的胚誘導(dǎo)能力有極顯著差異，津夏三號相對最高，平均每蕾產(chǎn)胚為1.51個。

2.2小孢子胚誘導(dǎo)體系優(yōu)化

2.2.1熱擊處理對胚誘導(dǎo)的影響將分離純化的小孢子懸浮液在33 ℃條件下分別熱擊暗培養(yǎng)不同時間。由表2可知，熱擊處理對娃娃菜小孢子胚誘導(dǎo)能力的影響效果明顯，同一品種熱擊培養(yǎng)不同時間，其小孢子胚誘導(dǎo)能力差異極顯著；不進(jìn)行熱擊或熱擊培養(yǎng)24 h，津夏三號等3個品種均未誘導(dǎo)出小孢子胚狀體；熱擊48 h為最佳培養(yǎng)時間，胚誘導(dǎo)能量達(dá)到最大，津夏三號、秀麗娃娃菜、金春娃2號的平均每蕾產(chǎn)胚分別為1.35、1.08、0.45 個，熱擊超過48 h，胚誘導(dǎo)能力下降。

2.2.2激素濃度對小孢子胚狀體誘導(dǎo)的影響由表3可知，添加適宜濃度6-BA和NAA的NLN-13培養(yǎng)基可以提高胚狀體的誘導(dǎo)能力；胚狀體發(fā)生培養(yǎng)基適宜的激素濃度為 6-BA 0.05 mg/L+NAA 0.05 mg/L，以津夏三號的胚誘導(dǎo)效果最高，平均每蕾產(chǎn)胚1.35個。

2.2.3振蕩培養(yǎng)對小孢子胚狀體發(fā)育的影響將培養(yǎng)15 d的小孢子胚狀體在25 ℃恒溫?fù)u床上50 r/min繼續(xù)暗培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，與不振蕩培養(yǎng)相比，振蕩培養(yǎng)有利于促進(jìn)子葉形胚狀體的發(fā)育，胚狀體生長速度加快（圖1-A）。

2.3激素濃度對胚成苗的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，子葉形胚轉(zhuǎn)入不含任何激素的MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂+0.1 g/L活性炭培養(yǎng)基上培養(yǎng)14～21 d，子葉形胚形成愈傷組織（圖1-B），并沒有形成不定芽，而轉(zhuǎn)入含有 1 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA的MS+3%蔗糖+08%瓊脂+0.1 g/L活性炭培養(yǎng)基上培養(yǎng)，會分生出不定芽（圖1-C），添加激素濃度如過高，則影響不定芽的質(zhì)量，產(chǎn)生畸形苗。在實(shí)際操作過程中，最好先將子葉形胚轉(zhuǎn)入不含激素的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)，形成愈傷組織后再轉(zhuǎn)入含有激素的MS培養(yǎng)基，以促進(jìn)更多叢生苗的形成。

2.4繼代和生根培養(yǎng)

將獲得的小孢子分生苗轉(zhuǎn)入MS+3%蔗糖+0.75%瓊脂+0.1 g/L活性炭培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每隔25 d左右繼代1次，經(jīng)2～3次繼代，小孢子由纖弱植株逐漸復(fù)壯形成再生植株（圖1-D）；試管苗長到6～7片真葉時，將壯苗轉(zhuǎn)到MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂+0.1 mg/L NAA的生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)25 d左右即可生出粗壯、整齊的白色根系，煉苗后移栽至花盆在溫室中培育。目前，已經(jīng)獲得195株小孢子再生植株。須說明的是，小孢子植株繼代和壯苗培養(yǎng)過程中，在培養(yǎng)基中添加0.1 g/L的活性炭會有利于小孢子植株的復(fù)壯。

2.5DH系評價

對獲得的再生植株測定其育性及倍性，結(jié)果表明，獲得的195株再生植株，可育株有167株，不育株有28株，可育株中單倍體植株有4株，雙單倍體植株有155株，四倍體植株有8株。經(jīng)秋季田間性狀鑒定，篩選出2個優(yōu)良的DH系15W05、15W16（圖2）。

3討論與結(jié)論

目前，有對春結(jié)球黃心大白菜、抗根腫病大白菜、耐抽薹大白菜等游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)的研究報(bào)道[8-10]，主要是對影響胚狀體發(fā)生及其成苗的關(guān)鍵因素包括基因型、低溫預(yù)處理及激素等進(jìn)行系統(tǒng)分析，完善小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系。本試驗(yàn)將游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)與育種實(shí)踐相結(jié)合，重點(diǎn)研究娃娃菜游離小孢子的培養(yǎng)，旨在將該技術(shù)應(yīng)用于創(chuàng)制新、奇、特的大白菜品種，以豐富大白菜種質(zhì)資源。

蔣武生等開展基因型、高、低溫預(yù)處理、激素對大白菜胚胎發(fā)生影響的研究，結(jié)果表明，基因型是決定小孢子胚發(fā)生的重要因素之一；適當(dāng)?shù)牡蜏仡A(yù)處理或熱擊處理能夠提高小孢子胚的發(fā)生頻率；培養(yǎng)基中添加適宜濃度的激素6-BA、NAA能促進(jìn)小孢子胚狀體產(chǎn)生。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同品種娃娃菜的小孢子胚誘導(dǎo)能力差異顯著；影響小孢子胚狀體發(fā)生及發(fā)育的關(guān)鍵因素主要為熱擊處理、激素濃度及振蕩培養(yǎng)；胚狀體發(fā)生培養(yǎng)基中添加濃度均為0.05 mg/L的6-BA、NAA，小孢子胚誘導(dǎo)率最高，這與前人研究結(jié)果[11-12]一致。小孢子正常是通過不對稱核分裂后發(fā)育成花粉，而要讓小孢子發(fā)育成胚，就要阻斷原有的配子體發(fā)育，使小孢子進(jìn)行對稱性分裂向孢子體方向發(fā)育，才能誘導(dǎo)小孢子胚的發(fā)生[13-16]。姜立榮等觀察白菜小孢子發(fā)現(xiàn)，單核晚期，小孢子大部分都有1個清晰的占整個細(xì)胞50%以上的大液泡，25 ℃條件下小孢子會進(jìn)行不對稱分裂，而經(jīng)過32 ℃處理，對稱分裂成為其主要的分裂方式[13]。本試驗(yàn)中，熱擊預(yù)處理對娃娃菜小孢子胚發(fā)生的作用最為明顯，分離純化的小孢子懸浮液在33 ℃條件下熱擊 24 h，未誘導(dǎo)出小孢子胚狀體，熱擊48 h則胚誘導(dǎo)效果達(dá)到最大值，熱擊超過48 h時胚誘導(dǎo)能力下降，這說明熱擊處理也是影響小孢子胚發(fā)生的重要因素之一。

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